PLoS ONE: A Novel Multivariate Index for kræft i bugspytkirtlen Detection Baseret på Plasma frie aminosyre profil

Abstrakt

Baggrund

Forekomsten af ​​kræft i bugspytkirtlen (PC) fortsætter med at stige i verden, mens de fleste patienter er diagnosticeret med fremskredne stadier og overleve 12 måneder. Denne dårlig prognose skyldes vanskeligheden ved tidlig påvisning. Her udviklede vi og evaluerede en multivariat indeks bestående af plasma frie aminosyrer (PFAAs) til tidlig opdagelse af PC.

Metoder

Vi har udført en tværsnitsundersøgelse i multi-institutioner i Japan. Fastende plasmaprøver fra PC patienter (n = 360), kronisk betændelse i bugspytkirtlen (CP) patienter (n = 28), og sunde kontrol (HC) forsøgspersoner (n = 8372) uden tilsyneladende kræftformer, der var undergår omfattende lægeundersøgelser blev indsamlet. Koncentrationer på 19 PFAAs blev målt ved væskekromatografi-massespektrometri. Vi genererede et indeks bestående af følgende seks PFAAs: serin, asparagin, isoleucin, alanin, histidin og tryptophan som variabler til diskrimination i et træningssæt (120 PC og matchende 600 HC) og evaluering i en validering sæt (240 PC, 28 CP, og 7772 HC).

Resultater

Flere aminosyre-koncentrationer i plasma blev væsentligt ændret i PC. Plasma tryptophan og histidin koncentrationer i PC var særligt lave, mens serin var især højere end for HC. Arealet under kurven (AUC) baseret på receiver opererer karakteristik (ROC) kurve analyse af den resulterende indeks til at skelne pc fra HC var 0,89 [95% konfidensinterval (CI), 0,86-0,93] i træningssættet. I valideringen sæt, AUC baseret på ROC kurve analyse af PFAA indekset var 0,86 (95% CI, 0,84 til 0,89) for alle pc-patienter versus HC emner, 0,81 (95% CI, 0,75-0,86) til PC patienter fra scenen IIA til IIB versus HC fag, og 0,87 (95% CI, 0,80-0,93) for alle pc-patienter versus CP-patienter.

konklusioner

Disse resultater tyder på, at PFAA profil PC var signifikant forskellig fra den for HC. Den PFAA indeks er en lovende biomarkør til screening og diagnosticering af PC

Henvisning:. Fukutake N, Ueno M, Hiraoka N, Shimada K, Shiraishi K, Saruki N, et al. (2015) A Novel Multivariat Index for kræft i bugspytkirtlen Detection Baseret på Plasma frie aminosyre profil. PLoS ONE 10 (7): e0132223. doi: 10,1371 /journal.pone.0132223

Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), SPANIEN

Modtaget: Januar 6, 2015; Accepteret: 12 juni 2015; Udgivet: 2 juli 2015

Copyright: © 2015 Fukutake et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Forfatterne bekræfter at for godkendte årsager, nogle adgangsbegrænsninger anvendelse på de data, der ligger til grund for resultaterne. De data, der ligger til grund resultaterne i vores undersøgelse kan ikke offentliggøres på grund af arten af ​​etiske godkendelser for undersøgelsen. Data er tilgængelige fra Osaka Medical Center of Cancer og hjertekarsygdomme etiske komité (via e-mail til [email protected]~~V) for forskere, der opfylder kriterierne for adgang til fortrolige data.

Finansiering: Denne undersøgelse blev finansieret af Ajinomoto Co., Inc. bidragyder ydet støtte i form af lønninger til forfattere NO, AI, SK, og HY, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« afsnittet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og rapportere følgende konflikter: NO, AI, SK, og HY er medarbejdere i Ajinomoto , Co., Inc. NF, MU, NH, K. Shimada, K.Shiraishi, NS, TI, MY, og KK fik forskningsbevillinger fra Ajinomoto, Co., Inc. NO, SK, HY, K. Shiraishi, KK , NF, og MU har ansøgt om patenter WO /2014 /084.290 “metode til evaluering bugspytkirtelkræft, bugspytkirtelkræft analyseenhed, bugspytkirtelkræft evalueringsmetode, bugspytkirtelkræft evalueringsprogram, bugspytkirtelkræft evalueringssystem oG INFORMATION KOMMUNIKATION TERMINAL UNIT.” Det gør ikke ændre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) er i øjeblikket den ottende hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald, med en anslået 266.000 dødsfald på verdensplan i 2008 [1], og er stadig en af ​​de mest udfordrende maligniteter at behandle. Den eneste potentiel kurativ terapi er kirurgisk resektion; men omtrent 70% af tilfældene oprindeligt til stede med fremskreden sygdom (stadium III-IV), som ikke kan kureres ved kirurgi. Avanceret PC har en meget dårlig prognose, der kan henføres til manglende tidlige symptomer og nyttige screeningsmetoder, med en median overlevelse periode på 7,7 måneder for fase III og 2,5 måneder for trin IV [2] sygdom. Desuden er de 5-års overlevelse satser er efter sigende kun 21,3% til lokal fase, 8,9% for den regionale scene, og 1,8% for fjernt etape [3].

Flere tumor-associerede antigener er blevet vurderet som potentielle prognostiske faktorer for PC, herunder carcinoembryonisk antigen (CEA) og kulhydrat-antigen (CA) 19-9. CA19-9 er den mest klinisk anvendelig diagnostisk markør, med følsomhed på 79% -81% og specificitet på 82% -90% hos symptomatiske patienter, men dens lave positive prædiktiv værdi gør det en dårlig markør for screening [4]. Desuden, forbedret computertomografi (CT) og endoskopisk ultralyd (EUS) er anvendelige til diagnosticering af PC; men disse modaliteter er dyre og potentielt farlige. Derfor er det nødvendigt at etablere mere effektive screeningsmetoder til PC, især i de tidlige stadier af sygdommen. Aminosyrer er enten indtages eller endogent syntetiseret og spille vigtige fysiologiske roller både som grundlæggende metabolitter og metaboliske regulatorer. Plasma frie aminosyrer (PFAAs) nuværende gunstige mål for biomarkører fordi PFAA profiler er kendt for at være påvirket af metaboliske variationer i specifikke organsystemer induceret af specifikke sygdomme [5] [6] [7] [8] [9]. Tidligere omfattende metabolomiske studier har ofte fokuseret på ændringer i PFAA profiler [10] [11] [12] [13]. Måling af PFAA koncentrationer som muligt markør for sygdom er også en mere fordelagtig strategi til præcis og højt gennemløb analyse under anvendelse massespektroskopi end omfattende metabolomics. Ændringer i PFAAs profiler er karakteristiske for flere kræftformer; Således kunne udvikle en multivariat indeks sammensat af disse PFAAs anvendes til bedre at skelne individuelle cancertyper fra raske kontroller [14] [15]. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi mønstre af PFAA profiler, og derefter udviklet og valideret en multivariat indeks til påvisning af PC.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Dette undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og protokollen blev godkendt af etiske komitéer i Osaka Medical center of Cancer og hjertekarsygdomme, Kanagawa Cancer center, National Cancer center Hospital, Tokai University Hospital, Gunma Prefectural Cancer center, JCHO Osaka Hospital, Mitsui Memorial Hospital, Kameda Medical center, og Kanagawa Health service Association. Alle individer gav skriftligt informeret samtykke inden deltagelse i denne undersøgelse. Alle kliniske oplysninger blev anonymiseret før dataanalyse.

Emner

PC patienter (n = 360), der indgår i denne undersøgelse blev rekrutteret fra Osaka Medical Center of Cancer og hjertekarsygdomme, den Kanagawa Cancer Center , National Cancer center Hospital, Tokai University Hospital, og Gunma Prefectural Cancer center mellem 2007 og 2014. Patienter med kronisk pancreatitis (CP, n = 28) blev rekrutteret fra JCHO Osaka Hospital mellem 2013 og 2014, mens sund kontrol (HC) fag (n = 8372), som gennemgik en omfattende helbredsundersøgelse blev rekrutteret fra Kanagawa Health service Association, Kameda Medical center (Makuhari Clinic), og Mitsui Memorial Hospital mellem 2008 og 2010. over 95% af på hinanden følgende PC og CP tilfælde og HC enige om at give samtykke i undersøgelsesperioden. PC patienter med følgende karakteristika blev udelukket: (1) samtidig konstateret kræft i et andet organ, (2) hepatitis C, og (3) under behandling med anti-cancer. CP patienter med følgende karakteristika blev udelukket: (1) diagnosticeret med kræft og (2) hepatitis C. Kriterierne for HC fag integration var som følger: (1) ingen historie enhver kræft, og (2) ingen historie af hepatitis C . PC etape blev bestemt i henhold til sjette udgave af den Internationale Union Against Cancer (UICC) Tumor-Node-Metastase (TNM) Klassificering af maligne tumorer [16]

Datasæt forberedelse

Blandt de 360 PC patienter, 120 PC patienter opnåede tidligt blodprøvetagning rækkefølge blev brugt som en uddannelse datasæt. For at fremstille HC fag i uddannelsen datasættet, 600 af 8372 HC emner blev valgt ved hjælp tilbøjelighed score matching baseret på køn og aldersfordeling. De resterende 240 PC og alle 28 CP-patienter og 7772 HC forsøgspersoner blev brugt som en validering datasæt.

Body mass index (BMI)

højde og vægt af alle emner blev målt. BMI blev beregnet som vægt i kg divideret med højden i kvadratmeter. BMI-værdier blev kategoriseret som følger: undervægtige ( 18,50 kg /m

2), normal vægt (18.50-24.99 kg /m

2), overvægt (25.00-29.99 kg /m2), og fede ( 30,00 kg /m

2)

PFAA analyse

Efter faste natten over blev blodprøver (5 ml) indsamlet fra antecubital vener i rør indeholdende ethylendiamintetraeddikesyredinatriumsalt som en antikoagulant. og var straks ( 1 min) placeret i isvand eller en iskold køling beholder (Forte Grow Medical Co., Ltd., Tochigi, Japan). Plasma blev separeret fra de fuldblodsprøver ved centrifugering ved 3.000 rpm og 4 ° C i 15 minutter og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Efter optøning blev plasmaprøver deproteiniseret anvendelse af acetonitril i en slutkoncentration på 80% før måling af aminosyre-koncentrationer ved højtydende væskekromatografi (HPLC) -electrospray ionisering (ESI) -massespektrometri (MS) ved forkolonne derivatisering. Disse analytiske metoder er blevet beskrevet andetsteds [17] [18] [19]. Koncentrationer af de følgende 19 aminosyrer blev målt og analyseret: alanin (Ala), arginin (Arg), asparagin (Asn), citrullin (Cit), glutamin (Gin), glycin (Gly), histidin (His), isoleucin (Ile ), leucin (Leu), lysin (Lys), methionin (Met), ornithin (Orn), phenylalanin (Phe), prolin (Pro), serin (Ser), threonin (Thr), tryptophan (Trp), tyrosin (Tyr ), og valin (Val).

Statistisk analyse

middelværdi og standardafvigelse (SD).

De gennemsnitlige aminosyre koncentrationer ± SD’er blev beregnet til at bestemme opsummeret PFAA profiler for både patienter og kontroller.

Mann-Whitney

U

-test.

Mann-Whitney

U

-test blev anvendt til at vurdere signifikante forskelle af PFAA fusioner og patienter og kontroller.

Receiver-operatør karakteristik (ROC) analyse.

ROC-analyse blev udført for at bestemme mulighederne i uni- og multivariate analyser til at skelne mellem patienter og kontroller. Patienten etiketter blev fastsat som positive klasse etiketter. Derfor et areal under ROC-kurven (AUC for ROC) værdi 0,5 viste, at aminosyren niveau var lavere hos patienter end kontrol, mens en AUC for ROC værdi 0,5 tilkendegivet, at det var højere. Konfidensintervallerne 95% (95% CI) i AUC for ROC for diskrimination af patienter baseret på aminosyre-koncentrationer og forhold blev også estimeret ved hjælp af de metoder, der er beskrevet af Hanley og McNeil [20].

Logistisk regression analyse.

Multivariat logistisk regressionsanalyse blev udført for at estimere modellen diskriminere PC patient fra kontrolpersoner.

model udvalg af PFAA indeks.

PFAA-indekset blev defineret som en multivariate model ved hjælp PFAA koncentrationer som variable. Logistisk regressionsanalyse med variabel udvælgelse blev udført for at skelne pc patienter fra HC fag. Det maksimale antal forklarende variable var begrænset til mindre end syv for at undgå potentielle multikollinearitet. For model udvælgelse, blev AUC for ROC opnået efter orlov én ud krydsvalidering (LOOCV). Kort sagt ét matchede sæt af en PC patient og tilsvarende kontrolpersoner blev udeladt fra træningssættet data, og den logistiske regressionsmodel blev beregnet ved anvendelse af de resterende prøver at estimere koefficienterne for hver aminosyre. Funktionen værdier for venstre-out matchede sæt blev beregnet på grundlag af denne model. Denne proces blev gentaget, indtil hver prøve i sættet undersøgelsen data var blevet efterladt en gang.

Software

Alle statistiske og multivariate analyser blev udført ved hjælp af MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) og Prism (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, USA) statistisk software.

Resultater

Karakteristik af patienter og kontrolpersoner

figur 1 viser en oversigt over dette studere. Fastende plasma prøver blev indsamlet fra de emner (PC patienter, n = 360, CP patienter, n = 28, HC emner, n = 8372). Tabel 1 opsummerer egenskaberne af PC og HC emner inkluderet i denne undersøgelse. PC patienter med stadie 0-IIB sygdom, som en resektabel scene undergruppe, tegnede sig for 35,8% af træningssættet og 35,0% af valideringen sæt.

PFAA profiler af PC patienter

Vi først målte koncentrationerne af 19 plasma aminosyrer i uddannelsen indstillet ved HPLC-ESI-MS og fandt betydelige stigninger i Ser koncentrationer og signifikante fald i koncentrationerne af 14 aminosyrer (Thr, Asn, Pro, Ala, Cit, Val, Met, Leu, Tyr, Phe, His, Trp, Lys og Arg) i PC patienter sammenlignet med HC fag (

s

0,05) (tabel 2, S1 fig). De PFAA profiler blev underkastet AUC for ROC analyser, fordi niveauerne af betydning afhænger af prøvens størrelse (fig 2, S1 tabel). Plasma Ser koncentrationerne var især højere, mens Trp og hans koncentrationer var særligt lavere i PC patienter sammenlignet med HC fag. De PFAA profiler af PC patienter med stadie 0-IIB sygdom, som en resektabel scene undergruppe, var næsten de samme som for alle andre PC-patienter.

Resultaterne af receiver-operatør karakteristik (ROC) kurve analyse af PFAA profiler i træningssættet (120 PC og matchende 600 HC). Akser viser AUC for ROC for hver aminosyre til at skelne patienter fra raske kontroller. Sorte dristige linjer angiver det punkt, hvor AUC for ROC = 0,5.

Multivariate PFAA indeks

For effektiv detektering af pc-patienter, vi beregnede optimale PFAA indeks efter multipel logistisk regressionsanalyse. AUC for ROC værdier opnået efter LOOCV i top 50 modeller var stort set den samme (0,88-0,89). Vi evaluerede en repræsentativ model bestående af Ser, Asn, Ile, Ala, His, og Trp som den bedste model (tabel 3). Derefter ekstra logistisk regressionsanalyser tilføje BMI og /eller rygevaner i forklarende variable blev udført for at vurdere virkningen af ​​potentielle confounding. Ingen indlysende elevation af signifikans blev observeret i hver aminosyre, når disse faktorer blev tilsat til modellen, hvilket antyder, at ændringerne i plasmaniveauet af de aminosyrer forårsaget af PC var uafhængige BMI eller rygning status forsøgspersoner (tabel 3).

med hensyn til at diskriminere PC patienter fra kontrolpersoner, ROC kurver til PC vs HC eller CP undergrupper mellem sæt og validering uddannelse sæt blev beregnet (fig 3A og 3B, henholdsvis). I træningssættet, AUC af PFAA indeks for detektion af pc-patienter vs. HC forsøgspersoner var 0,89 (95% CI, 0,86-0,93) blandt alle pc patienter og 0,89 (95% CI, 0,83-0,95) blandt pc-patienter med fase 0-IIB sygdom. Følsomhed i de PFAA indeks på 95% og 80% specificitet var 60,0% og 82,5%, henholdsvis for alle PC patienter, og 53,5% og 83,7% for PC patienter med stadium 0-IIB sygdom (tabel 4). I valideringen sæt, AUC for den PFAA indekset var 0,86 (95% CI, 0,84-0,89) for alle pc-patienter og 0,81 (95% CI, 0,75-0,86) til PC patienter med trin IIA og IIB sygdom (Fig 3B) . Følsomhed i de PFAA indeks på en specificitet på 95% og 80% var 57,5% og 76,7% for alle PC patienter, og 48,8% og 64,3% for PC patienter med stadium IIA og IIB sygdom (tabel 4). AUC for PFAA indeks for detektion af PC vs. CP var 0,87 (95% CI, 0,80-0,93) for alle pc-patienter og falsk positive satser på 95% og 80% specificitet var 7,1% og 25,0%, henholdsvis ( tabel 4). S2 Figur viser box plots af PFAA indeks i HC, PC, og CP i valideringen sæt.

Vi bekræftede, at variansen oppumpning faktor (VIF), den maksimale af diagonalen element den inverse matrix af korrelationskoefficienten matrix, af alle de øverste 50 modeller til ikke at vælge de uhensigtsmæssige modeller viser Multikollinearitet. Alle modeller bestået prøven, der er, VIFs blev mindre end 10. Mest af alt, VIF i den repræsentative model var 1,70, hvilket tyder på, at ingen Multikollinearitet opstod.

Desuden undergruppe analyse blev udført for tumor fase, størrelse og placering i pancreas. AUC for PFAA indekset ifølge tumor etape var som følger: 0,79 (95% CI, 0,72-0,86) for fase IIA, 0,85 (95% CI, 0,77-0,92) for fase IIB, 0,88 (95% CI, 0.83- 0,94) til fase III, og 0,91 (95% CI, 0,88-0,94) for trin IV (fig 4A). AUC for PFAA indekset efter tumorstørrelse var som følger: 0,76 (95% CI, 0,66-0,86) for TS1, 0,87 (95% CI, 0,83-0,90) for TS2, 0,91 (95% CI, 0,86-0,95) for TS3, og 0,97 (95% CI, 0,95-1,00) for TS4 (fig 4B). AUC for den PFAA indekset ifølge tumor placering var som følger: 0,86 (95% CI, 0,82-0,90) for pancreas- hoved, 0,88 (95% CI, 0,83-0,93) for pancreas- legeme, og 0,90 (95% CI , 0,83-0,96) for pancreas- hale (fig 4C). Desuden har vi vurderet korrelationerne mellem PFAA indeksværdier og andre biomarkører (dvs. CA19-9, CEA, og elastase-1), fordi det kombinatoriske brug af flere uafhængige tumormarkører er effektiv til at detektere PC. Der var ingen signifikante korrelationer mellem de PFAA indekser og niveauer af CA19-9 (r = 0,075,

s

= 0,247), CEA (r = -0,005,

s

= 0,957), eller elastase-1 (r = 0,009,

s

= 0,351) i PC (figur 5, S2 tabel).

(A) ROC kurver af PFAA indekset i fase IIA (rød), fase IIB (lyserød), fase III (orange), og trin IV (gul-grøn), hhv. (B) ROC kurver i TS1 (rød), TS2 (lyserød), TS3 (orange), og TS4 (gul-grøn), hhv. TS1 ≤ 2,0 cm, 2,0 cm TS2 ≤ 4,0 cm, 4,0 cm TS3 ≤ 6,0 cm, og TS4 6,0 cm. (C) ROC kurver i bugspytkirtlen hoved (rød), body (lyserød), og hale (Orange) henholdsvis.

Den stiplede linje viser cut-off af hver biomarkør eller PFAA indeks. Til dataanalyse blev de øvre normale grænser for CA19-9, CEA, og elastase-1 er defineret som 37 U /ml, 5 ng /dl, og 300 ng /dl hhv. Der var ingen signifikante korrelationer mellem hver biomarkør og PFAA indekset.

Diskussion

dysregulering af PFAA indhold i pc er blevet undersøgt i flere nyere undersøgelser ved hjælp af metabolomics eller aminosyreanalyse [21 ] [22] [23]. Men specifikke PFAA profiler i PC, især på resekterbare stadier, forbliver ubekræftet på grund af det relativt lille antal pc-patienter og kontrolpersoner, der anvendes i disse undersøgelser. Derfor har vi målt fastende PFAA koncentrationer i en storstilet undersøgelse af 360 PC patienter og 8372 kontrolpersoner at identificere specifikke PFAA profiler i PC patienter sammenlignet med en køns- og alder-matchede uddannelse sæt (PC120, HC600) (figur 2) . Desuden blev en lignende PFAA profil observeret hos patienter med stadie 0-IIB sygdom, som tegnede sig for 35,8% af PC patienter inkluderet i dette studie. (Figur 2). Som vist i tabel 2, blev plasmakoncentrationerne af adskillige aminosyrer ændret betydeligt i PC patienter, som var i overensstemmelse med PFAA profiler af fem kræfttyper rapporteret af Miyagi et al. [14], selv om plasma Hans og Trp koncentrationer blev især faldt, mens Ser koncentrationer især blev forøget (fig 2). Endvidere har vi udviklet en PFAA indeks ved anvendelse af et træningssæt bestående af seks aminosyrer, der var klart karakteristisk for aminosyren profil i PC. Vi viste, at dette indeks kan anvendes til effektivt at skelne ikke blot progressiv PC men også betjenes PC, fra trin IIA og IIB sygdom hos en uafhængig validering sæt (tabel 4). Desuden har vi også viste, at PFAA indekset næppe registrerer kronisk betændelse i bugspytkirtlen (tabel 4).

PFAA profiler af pc-patienter er blevet rapporteret i flere tidligere undersøgelser, blandt hvilke flere aminosyre profiler var ens, selv om der var nogle åbenlyse uoverensstemmelser [21] [22] [23] For eksempel fandt vi en signifikant stigning i plasma Ser koncentrationer i PC, mens denne tendens ikke blev observeret i andre studier. Derudover er der en unøjagtighed i Asn, Gin, Met, Ile, Phe, Leu, og Pro niveauer. I modsætning hertil disse tidligere undersøgelser almindeligt rapporterede et signifikant fald i Thr koncentrationer, mens ændringer i Arg, Cit og Trp-koncentrationer ikke blev bestemt i en undersøgelse, og signifikant fald i disse aminosyrer i PC blev observeret i vores undersøgelse samt to andre. Vi overvejede flere grunde til disse forskelle. Først disse tidligere undersøgelser omfattede relativt lille antal patienter sammenlignet med den nuværende undersøgelse, som omfattede det største antal emner til dato. I denne undersøgelse, at PFAA indekset var robust og AUC næsten faldt selv med valideringen sæt, fordi det blev udviklet på baggrund af en uddannelse sæt med en passende stikprøve. For det andet kan være opstået forskelle mellem vores resultater og de andre undersøgelser på grund af variationer i prøve betingelser forberedelse og analysemetoder. For det tredje, PFAA profiler udviser døgnets udsving [24] [25] [26], og ændres i henhold til døgnrytmen [27] [28], fordi de er i høj grad afhængig af de seneste måltider, selv blandt raske forsøgspersoner [24] [25] [26] [29]. Desuden forlader indsamlede blodprøver ved stuetemperatur vides at ændre plasma aminosyrekoncentrationer [30]. For at overvinde denne confounding faktor, alle deltagende faciliteter i denne undersøgelse brugt den samme protokol, hvor blodet blev trukket om morgenen før morgenmad efter faste natten over og de indsamlede prøver blev hurtigt afkølet for at forhindre ændringer i aminosyre koncentrationer på grund af enzymatiske reaktioner. Derfor er de erhvervede prøver var af høj kvalitet og de udtrukne data præcist afspejler in vivo aminosyreprofiler under faste. Endvidere blev bestemmelse af aminosyre-koncentrationer under anvendelse af HPLC-ESI-MS i dette studie beregnes ikke som en semiquantified værdi med metabolomics som i tidligere undersøgelser, men snarere som direkte kvantificeret absolutte koncentrationer ved at skabe en kalibreringskurve fra toparealet af standard referencer for hver aminosyre [19]. Disse målinger var meget nøjagtig og præcis til at sikre validering, reproducerbarhed, og begrænset daglig fejl [19]. Således kan resultaterne af denne undersøgelse mere klart demonstrere profil egenskaber i sammenligning med dem, påvist ved tidligere undersøgelser. Anvendelsen af ​​multivariabel analyse af markører for PC er også blevet rapporteret [23, 31]. For eksempel, Kobayashi et al. [23] konstrueres en multipel logistisk regressionsmodel anvendelse af en 43-sag træningssættet med koncentrationerne af fire metabolitter udvalgt som variable fra data omfattende semiquantified fra metabolitkoncentrationer ved GC-MS. I mellemtiden, af de fire udvalgte metabolitter, xylitol er en fødevare-afledt stof, der er til stede i meget lave koncentrationer i raske individer [32] [33]. Det var imidlertid uklart, om disse koncentrationer er fysiologisk fastholdes på et vist niveau in vivo. Endvidere Leichtle et al. [31] konstrueret en kombineret metabolit panel til at skelne pc fra CP og HC hjælp asparaginsyre (Asp) og CA19-9 som variable. Imidlertid plasma Asp koncentrationen har tendens til at være forholdsvis lav, og en analytisk variabilitet 25%, som rapporteret andetsteds [34]. I den foreliggende undersøgelse blev PFAA indeks konstrueret med kun aminosyrer med moderate til høje plasmakoncentrationer at sikre målepræcision. Derfor mener vi, at PFAA indekset tilbyder en høj diskriminerende evne uden at være påvirket af målefejl. Fordi aminosyreanalyse er almindeligt anvendt klinisk, at PFAA indekset forventes at blive hurtigt verificeret og vi har mistanke om dens anvendelse vil være udbredt i den nærmeste fremtid. I mellemtiden kan genetiske, racemæssige og geografiske elementer også være faktorer, der påvirker disse forskelle, som bør afklares i fremtidig forskning.

Der er flere mulige mekanismer, der kan påvirke PFAA profiler hos kræftpatienter. Først har tidligere undersøgelser udvist betydelig metaboliske ændringer i den lokale cancer, herunder forskellige aminosyre-profiler og forskellige ekspression af aminosyretransporter i cancerceller sammenlignet med raske celler [10] [35]. For eksempel er L-neutral aminosyre transportør 1 (LAT1) udtrykkes kraftigt i PC celler [36]. Med hensyn til Ser, er de novo Ser biosyntese opreguleret i cancerceller og Ser fungerer som en allosterisk aktivator af pyruvatkinase isozym M2 [37]. Denne egenskab kan være relateret til faktorer, der også øger plasma Ser koncentrationer. En anden mulig mekanisme er induktionen af ​​fjerntliggende organ metaboliske ændringer forårsaget af faktorer, der udsendes fra cancerceller. For eksempel, Luo et al. [38] rapporterede, at HMGB-1 secerneret af cancerceller forårsaget fordelingen af ​​fjernbetjeningen muskelvæv proteiner til aminosyrer, hvoraf nogle sive ud i blodet og derved ændre den PFAA profil. En tredje mulig mekanisme er involvering af immunsystemet. For eksempel har plasmakoncentrationer af Trp blevet korreleret med fælles metaboliske ændringer, både i vores undersøgelse og en tidligere undersøgelse, der undersøgte Trp niveauer i fem forskellige typer af cancer [14]. Ekspression af indolamin 2,3-dioxygenase (IDO), der er involveret i kynurenin metaboliske vej, induceres i forskellige former for kræft (kræft celler eller immunceller) og kendt for at spille en vigtig rolle i immunosuppression [39]. IDO er også kendt for at være overudtrykt i PC celler [40]. Således flere punkter vedrørende mekanismerne bag ændringer i PFAA profiler i PC fortsat uklare; derfor er der behov for yderligere forskning for at afklare disse spørgsmål.

For nylig Mayers et al. [41] rapporterede, at forgrenet aminosyre (BCAA) serum niveauer er forhøjede 2-5 år før begyndelsen af ​​carcinogenese i PC, hvilket antyder, at BCAA elevation er en uafhængig risikofaktor for PC. Men BCAA niveauer vende tilbage til normale niveauer inden for de 2 år før bekræftelse af kræft. Desuden resultaterne af en mus undersøgelse viste, at perioden med BCAA elevation var klokke-formet og kun midlertidig. I vores undersøgelse, vi præsenterede PFAA profiler af endeligt diagnosticerede patienter efter afsløring kræft via diagnostisk billeddannelse. Blandt tilfælde med resektabel stadie sygdom (op til fase IIB), var der ingen væsentlige ændringer i BCAA-koncentrationer sammenlignet med kontrolpersoner. I tilfælde af fremskreden kræft, blev Leu og Val koncentrationerne faldet. Vores undersøgelsesdata identificerede karakteristika for pc-faser, som let bekræftet af for tiden tilgængelige billeddiagnostiske metoder; Således er det muligt, at disse egenskaber afveg blandt de vigtigste faser i microcarcinoma eller før indtræden af ​​carcinogenese. Fordi vi ikke undersøger PFAA koncentrationer før carcinogenese i denne undersøgelse, er der behov for fremtidige undersøgelser til præcist at identificere BCAA dynamik fra før PC debut til carcinogenese. Men ovennævnte undersøgelser fundet, at metaboliske ændringer ændrer systemiske aminosyreprofiler sammen med ændringer i plasma BCAA-koncentrationer i præcancer fase eller ekstremt tidlige stadier af PC [41]. Derfor er de observerede ændringer i PFAA profiler af patienter med pc-læsioner, der kunne diagnosticeres via billedbehandling og anses for resektion i vores undersøgelse, kan også være forårsaget af systemiske metaboliske ændringer.

I øjeblikket CA19-9 er den mest anvendte markør til at forudsige PC udfald behandling og efterbehandling prognose [42]. Dog er CA19-9 ikke syntetiseres af patienter klassificeret som Lewis blodtype Le

a-b-, som tegner sig for 10% af tilfældene; derfor kan denne markør ikke være forhøjet hos nogle patienter, selv dem med fremskredet stadium PC [43]. CEA er almindeligt anvendt som en prognostisk markør i gastrointestinale cancere; Men dens følsomhed og specificitet for PC er fattige [44]. Pancreas enzym elastase-1, hvilket menes at stige med pancreatitis forårsaget af pancreas kanalen stenose, er blevet påvist som en effektiv tidlig diagnostisk markør [45]. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi ingen korrelationer mellem PFAA indeks og CA19-9, CEA, eller elastase-1-niveauer (Fig 5). Således når de anvendes samtidig, kan PFAA indekset med CA19-9, CEA, eller elastase-1 supplere hinanden for mere præcist afsløre PC. Men CA19-9 og elastase-1, blev ikke målt på HC i dette studie. Således at bekræfte sammenligning af præcise diskriminerende evne og synergieffekt med disse markører, er der behov for yderligere undersøgelser. Den diskriminerende evne PFAA indekset viste sig at være høj, selv for små pancreatiske tumorer af TS-1 ifølge undergruppe analyse (ROC_AUC = 0,76) (Fig 4B). Vi fandt også, at PFAA indekset ikke var afhængig af placeringen af ​​den pancreatiske tumor (Fig 4C). Selvom almindelige abdominal ultralyd anvendes til at diagnosticere PC i den indledende fase, er det vanskeligt at billeddata små tumorer eller læsioner i pancreas hale eller uncinate proces ved hjælp af denne modalitet. Vores resultater foreslog, at den foreslåede PFAA indeks udviklet i dette studie giver den samme følsomhed uden at være afhængig tumor placering. Derfor kan kombinatorisk anvendelse af abdominal ultrasonografi og den PFAA indekset være en god markør for at forøge detektionsraten af ​​læsioner i pancreas hale og uncinate proces. I denne undersøgelse blev den træningssættet og validering sæt opdelt kronologisk. Som et resultat blev ingen tidlige tilfælde af trin I eller mindre indgår i valideringen sæt, der forekom kronologisk senere i tid. Den omstændighed, at diskriminerende evne PFAA indeks for tilfælde tidligt i fase I eller mindre forbliver ukendt er en begrænsning i denne undersøgelse. Men denne undersøgelse var tværsnit;