PLoS ONE: terapeutiske effekt af C-Kit-Målrettet radioimmunterapi Brug 90Y-mærket anti-C-Kit Antistoffer i en musemodel af småcellet Cancer

Abstrakt

Lille celle lungekræft (SCLC) er en aggressiv tumor og prognose er stadig dårlig. Derfor er der behov for udvikling af mere effektiv terapi. Vi har tidligere rapporteret, at høje niveauer af en anti-c-kit-antistof (12A8) akkumuleret i SCLC xenotransplantater. I den foreliggende undersøgelse, vi vurderede effekten af ​​to antistoffer (12A8 og 67A2) til radioimmunterapi (RIT) af en SCLC musemodel ved mærkning med

90Y isotop.

Metoder

111In- eller

125I-mærkede antistoffer blev evalueret

in vitro

ved celle binding, kompetitiv inhibering og cellulær internalisering analyser i c-kit-udtrykkende SY celler og

in vivo

ved biodistribution i SY-bærende mus. Terapeutisk virkning af

90Y-mærkede antistoffer blev evalueret i SY-bærende mus op til dag 28 og histologisk analyse blev udført på dag 7.

Resultater

[

111In] 12A8 og [

111In] 67A2 specifikt bundet til SY celler med høj affinitet (8,0 og 1,9 nM). 67A2 blev internaliseret ligner 12A8. Høje niveauer af [

111In] 12A8 og [

111In] 67A2 akkumuleret i tumorer, men ikke i større organer. [

111In] 67A2 optagelse af tumoren var 1,7 gange højere end for [

111In] 12A8. [

90Y] 12A8, men ikke [

90Y] 67A2, undertrykte tumorvækst på en dosis-afhængig måde. Tumorer behandlet med 3,7 MBq [

90Y] 12A8 og 1,85 og 3,7 MBq [

90Y] 67A2 (absorberede doser var 21,0, 18,0 og 35,9 Gy henholdsvis) næsten helt forsvundet ca. 2 uger efter injektion, og genvækst blev ikke observeret bortset fra i en mus behandlet med 1,85 MBq [

90Y] 67A2. Arealet af nekrose og fibrose forøges afhængig af RIT virkning. Apoptotiske celletal steg med øgede doser [

90Y] 12A8, hvorimod ikke blev observeret nogen dosisafhængig stigning efter [

90Y] 67A2 behandling. Kropsvægten blev midlertidigt reduceret, men alle mus har tolereret RIT eksperimenter godt.

Konklusion

Behandling med [

90Y] 12A8 og [

90Y] 67A2 opnåede komplet terapeutisk respons, når SY tumorer modtaget en absorberet dosis på mere end 18 Gy, og dermed er lovende RIT agenter for metastatiske SCLC celler på fjerne steder

Henvisning:. Yoshida C, Tsuji AB, Sudo H, Sugyo A, Kikuchi T, Koizumi M, et al. (2013) terapeutiske effekt af C-Kit-Målrettet radioimmunterapi Brug 90Y-mærket anti-C-Kit Antistoffer i en musemodel af småcellet lungekræft. PLoS ONE 8 (3): e59248. doi: 10,1371 /journal.pone.0059248

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: September 2, 2012; Accepteret: 13 februar 2013; Udgivet: 14. marts 2013 |

Copyright: © 2013 Yoshida et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af National Institute of radiologiske videnskaber til TS. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Småcellet lungekræft (SCLC) er en særskilt clinicopathologic enhed, der tegner sig for op til 20% af alle lungekræfttilfælde og adskiller sig fra ikke-småcellet lungekræft med sin hurtige tumor fordoblingstid, høj vækst fraktion og tidlig udvikling af udbredte metastaser [ ,,,0],2]. Selvom SCLC er meget følsomme over for kemoterapi og strålebehandling, den overordnede prognose stadig ringe på grund af stor recidiv eller metastatiske satser og den ringe respons af ildfast SCLC [2], [3]. Den mediane overlevelse for patienter med tilbagevendende SCLC er cirka seks måneder [3].

nylig har mange molekylære målrettede lægemidler blevet udviklet, der bidrager til den forbedrede overlevelse af patienter med flere kræftformer [4]. SCLC stærkt udtrykker flere molekyler, såsom c-kit, c-Met og vaskulær endotel vækstfaktor [4]. C-kit-proto-onkogenet koder for et 145-kDa transmembran tyrosinkinasereceptor bestående af en ekstracellulær del med fem immunoglobulinlignende domæner: den første tre indeholder en ligand bindingssted og det fjerde og femte domæner er forbundet med receptordimerisering, det transmembrane portion, og den intracellulære del med kinase enzymatisk aktivitet [5], [6], [7]. Stamcellefaktor er en ligand for c-kit og dens bindende fører til receptoraktivering og udløser aktiveringen af ​​downstream signalveje, der er involveret i cellevækst, differentiering og udvikling. C-kit er impliceret i den hurtige cellevækst iagttaget i SCLC og således betragtes som en kandidat målmolekyle til diagnostik og terapeutiske af SCLC [8]. Imatinib, en inhibitor af c-kit-tyrosinkinaseaktivitet, er yderst effektiv mod kemoterapi-resistent gastrointestinale stromale tumorer (GIST) [9], [10]. Selv om flere prækliniske undersøgelser rapporteret, at undertrykkelse af c-kit signalering hæmmer SCLC cellevækst [4], [11], fase II imatinib forsøg i patienter med recidiverende c-kit-positive SCLC rapporterede ingen objektivt respons eller vedvarende sygdom stabilisering [12], [13], [14]. Dette antyder, at progression ikke kan afhænge af c-kit på grund af mangel på aktiverende mutationer i modsætning GIST trods høj c-kit-ekspression i SCLC [15], [16]. Skønt blokering af c-kit pathway ikke kan have en terapeutisk virkning på SCLC, kan c-kit være en lovende mål for den selektive afgivelse af terapeutiske midler, såsom toksiner og radioisotoper til c-kit-positive SCLC tumorceller ved hjælp af bærere, som antistoffer.

Vi har tidligere rapporteret, at høje niveauer af

111In-mærket anti-c-kit-antistof, 12A8, akkumuleret i c-kit-udtrykkende SCLC-xenotransplantater, mens dens akkumulering var lav i normale organer [ ,,,0],17], [18]. Derfor 12A8 har potentialet til at blive anvendt til radioimmunterapi (RIT) ved at erstatte γ-emitterende

111In med β- eller a-emitterende radionuklider med egnede nukleare egenskaber. Begrebet RIT er blevet realiseret i klinikker til behandling af non-Hodgkins B-celle lymfom, ved anvendelse af anti-CD20-antistof mærket med

90Y eller

131I [19].

90Y er en ren β-emitter med høj energi (maksimal energi, 2.3 MeV), lange partikel rækkevidde (maksimal rækkevidde i vand, 11,3 mm), en passende halveringstid (64,1 h) for RIT med IgG og egnet til RIT med et internalisere antistof [19], [20]. I den foreliggende undersøgelse vurderede vi og sammenlignede

in vitro

in vivo

egenskaber af to radiomærkede anti-c-kit monoklonale antistoffer, 12A8 og 67A2, og deres anvendelse i eksperimentel RIT af SCLC ved hjælp af

90Y-mærkede antistoffer.

Materialer og metoder

Celler

Et menneske SCLC cellelinie SY (Immuno-Biological Laboratories (IBL), Takasaki, Japan ), der har høj c-kit-ekspression blev opretholdt i RPMI1640 (Sigma, St. Louis, MO, USA) indeholdende 5% føtalt bovint serum (Sigma, St. Louis, MO, USA) i en fugtig inkubator holdt ved 37 ° C med 5% CO

2.

antistoffer

To anti-c-kit-monoklonale antistoffer fra mus (12A8 [17], og 67A2) blev købt fra IBL. Hvert antistof binder til en anden epitop på den ekstracellulære del af c-kit: 12A8 binder til det femte domæne nærmest transmembrandomænet og 67A2 binder til det andet domæne. Ligevægtsdissociationskonstanten (Kd) af 12A8 og 67A2 er 1,06 og 0,26 nM, som målt ved en overfladeplasmonresonans assay. 12A8 har stærke neutralisation og moderate antitumoraktiviteter men inducerer ikke antistofafhængig cellecytotoksicitet (ADCC) eller komplementafhængig cytotoksicitet (CDC). 67A2 ikke besidder nogen af ​​de ovennævnte aktiviteter (information leveret fra producenten).

Radioaktiv mærkning af antistoffer

Antistoffer (12A8 og 67A2) blev konjugeret med

s

-SCN-Bz-CHX-a ” – DTPA (DTPA, Macrocyclics, Dallas, TX, USA) som tidligere beskrevet [17], [18], og derefter DTPA-konjugerede antistoffer blev oprenset ved anvendelse af en Sephadex G-50 (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) kolonne. Disse DTPA-konjugeret antistoffer (20 ug) blev blandet med 1,2 MBq [

111In] CI

3 eller 9,25 MBq [

90Y] CI

3 i 0,5 M acetatpuffer (pH 6,0) , og blandingen blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Radiomærkede antistoffer blev separeret fra frit

111In eller

90Y anvendelse af en Sephadex G-50-søjle. Den konjugation Forholdet mellem DTPA til begge antistoffer blev anslået til at være 1,1, bestemt ved celluloseacetat elektroforese, og de specifikke aktiviteter [

111In] 12A8, [

111In] 67A2, [

90Y] 12A8 og [

90Y] 67A2 var ca. 50, 50, 300 og 450 kBq /ig hhv. Udbyttet mærkning var ca. 80% for

111In mærkning og 65% til 97% for

90Y mærkning, og den radiokemiske renhed oversteg 96%. 67A2 blev også mærket med

125I under anvendelse af chloramin-T til internalisering assay som tidligere beskrevet [17]. Den specifikke aktivitet af [

125I] 67A2 var ca. 500 kBq /ug.

In vitro

assay

cellebinding, kompetitiv inhibering og internalisering analyser blev udført som tidligere beskrevet [17]. Kort beskrevet i en celle bindingsassay, serielt fortyndede SY-celler i PBS blev inkuberet med

111In-mærket antistof på is i 60 minutter. Efter vask blev radioaktiviteten bundet til cellerne målt. Den immunoreaktivitet af

111In-mærkede antistoffer blev anslået i henhold til den metode Lindmo

et al

[21]. I et kompetitivt inhiberingsassay blev

111In-mærket antistof inkuberet med SY-celler i nærvær af forskellige koncentrationer af det umærkede antistof på is i 60 minutter. Efter vask blev radioaktiviteten bundet til cellerne tælles. Data blev analyseret og Kd blev estimeret under anvendelse af GraphPad Prism software (Graphpad Software, La Jolla, CA, USA). I en internalisering assay blev SY-celler præinkuberet i dyrkningsmedium med

125I- eller

111In-mærket antistof på is i 60 minutter. Efter vask, opsamlede celler blev yderligere dyrket ved 37 ° C eller på is i frisk medium uden radiomærkede antistoffer. På forskellige tidspunkter blev supernatanten og cellerne separeret ved centrifugering. Trichloreddikesyre blev tilsat til supernatanten på is og derefter adskilt ved centrifugering til bestemmelse af den ikke-protein-bundne fraktion (supernatant) og protein-bundne fraktion (pellet). Cellerne blev vasket med surt buffer og derefter adskilt ved centrifugering til at bestemme både den membranbundne (supernatant) og internaliseres fraktion (pellet).

Biofordeling af

111In-mærket antistof

BALB /c-nu /nu-mus (5 uger gamle, CLEA Japan, Tokyo, Japan) blev inokuleret subkutant med 2 x 10

6 SY celler i venstre lår. Mus (19 til 23 g kropsvægt) bærende SY tumorer blev intravenøst ​​injiceret med 37 kBq af

111In-mærket antistof. Det injicerede protein dosis blev justeret til 20 ug per mus. Ved 1, 2, 4, 7 og 10 dage efter injektion af

111In-mærket antistof, fem mus på hvert tidspunkt blev aflivet, og blod blev opnået fra hjertet. Tumoren og større organer blev fjernet og vejet, og radioaktivitet tællinger blev målt ved anvendelse af en gammatæller. Dataene blev udtrykt som procentdelen af ​​injiceret dosis pr gram væv (% ID /g) henfald-korrigeret og normaliseret til en 20-g legemsvægt mus.

Tumoren absorberede dosis for

90Y- mærkede antistoffer blev estimeret ud fra biofordelingen data

111In-mærkede antistoffer.

90Y udsender en β-partikel med en gennemsnitlig udsendte energi af 0,9331 MeV, således betyde energi, der udsendes pr overgang blev beregnet som 1,495 × 10

-13 Gy kg (Bq s)

-1 baseret på en eV er lige to1.60218 × 10

-19 J [22]. Tumoroptagelse på forskellige tidspunkter blev plottet mod tiden, hvorfra arealet under kurven (AUC) blev beregnet. Dosis absorberes af tumoren i op til 10 dage efter injektion blev estimeret under anvendelse af AUC og betyde udsendes pr overgang som følger: AUC × 1,495 × 10

-13 × injiceret aktivitet. Den absorberede dosis til den røde knoglemarv i en 70-kg henvisning mand blev estimeret fra vores biodistributionsdata hjælp OLINDA /EXM version 1.0 software (Vanderbilt University, Nashville, TN, USA) som tidligere beskrevet [23].

radioimmunterapi

To uger efter inokulering af SY celler, modtog musene en intravenøs injektion af 0,74, 1,85 eller 3,7 MBq

90Y-mærket antistof (n = 5 for hver gruppe). Tumorstørrelse var 4,4 ± 3,2 mm

3 på tidspunktet for indgivelse. Proteinet dosis blev justeret til 20 ug for hvert præparat ved tilsætning umærket antistof. Som negative kontroller blev mus injiceret intravenøst ​​med det umærkede antistof (20 ug protein /mus) eller PBS alene (defineret som ubehandlet), hhv. Kropsvægten og tumorvækst blev bestemt to gange om ugen. Tumorvolumen (mm

3) blev beregnet som bredde × højde × dybde (mm) /2. Mus blev aflivet, da xenotransplanteret tumor volumen nåede mere end 200 mm

3. Denne forsøgsprotokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Nationale Institut for radiologiske videnskaber, og alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer for pasning af dyr og håndtering.

Histologisk analyse

Tumor prøver blev fjernet 1 uge efter injektion og fikseret i 10% (v /v) neutral bufret formalin og indlejret i paraffin for sektionering (n = 5 for hver gruppe). Sektioner (3 um tykkelse) blev farvet med hematoxylin og eosin (H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

In vitro

karakterisering af

111In-mærkede antistoffer

fra cellebindingsassayet, binding af [

111In] 12A8 og [

111In] 67A2 hjælp 1 × 10

7 SY celler var 50 og 76%, henholdsvis (fig. 1A). Binding af [

111In] 67A2 til SY-celler var højere sammenlignet med den for [

111In] 12A8, især ved lave cellulære koncentrationer. Den immunreaktive brøkdel af [

111In] 12A8 og [

111In] 67A2 var 83 og 88%, hhv. Fra kompetitivt inhiberingsassay blev Kd på [

111In] 12A8 og [

111In] 67A2 anslået til 8,0 og 1,9 nM (fig. 1B). Vi undersøgte den tidsmæssige ændring af radioaktiviteten af ​​[

111In] 67A2 og [

125I] 67A2 i den subcellulære fraktion (fig. 1C og D). Radioaktivitet i cellemembranen-bundne fraktion af [

111In] 67A2 og [

125I] 67A2 hurtigt faldt med tiden. I tilfælde af [

111In] 67A2, radioaktiviteten af ​​den internaliserede fraktion steg med tiden og nåede ca. 55% efter en 20-timers inkubation ved 37 ° C (fig. 1C). I modsætning hertil internaliseret radioaktivitet på [

125I] 67A2 forhøjes midlertidigt op til 3 timer, men faldt derefter gradvist. Radioaktivitet af den ikke-protein-bundne fraktion i dyrkningsmediet forøget med tiden, hvilket afspejler dehalogenering af

125I-mærket antistof i celler (fig. 1D). Når celler blev inkuberet på is, havde den membranbundne fraktion ikke ændre og internalisering blev ikke observeret i mindst 3 timer (data ikke vist). Disse resultater af internalisering assayet svarede til dem med 12A8 i vores tidligere undersøgelse [18].

(A) Cell bindingsassay for [

111In] 12A8 (lukkede cirkler) og [

111In ] 67A2 (åbne cirkler). (B) kompetitivt inhiberingsassay for [

111In] 12A8 (lukkede cirkler) og [

111In] 67A2 (åbne cirkler). Internalisering assay for [

111In] 67A2 (C) og [

125I] 67A2 (D). Ændringer i% af total radioaktivitet for hver fraktion er afbildet mod inkubationstid ved 37 ° C (lukkede cirkler, internaliseret fraktion; åbne cirkler, membranbundet fraktion; lukkede trekanter, protein-bundne fraktion i dyrkningsmediet; krydsmarkeringer, ikke- protein-bundne fraktion i dyrkningsmediet).

Biofordeling af [

111In] 12A8 og [

111In] 67A2

langsigtede biofordeling eksperimenter [

111In] 12A8 og [

111In] 67A2 blev udført i nøgne mus, der bærer SY tumorer fra dag 1 til 10 efter injektion (tabel 1 og 2). [

111In] 12A8 akkumuleret i tumorceller ved 7,3 ± 1,3% ID /g på dag 1 og en spidsværdi på 18,9 ± 2,9% ID /g opnåedes på dag 4 (tabel 1). Tumoren optag af [

111In] 67A2 var 15,7 ± 0,9% ID /g på dag 1, og et højdepunkt værdi på 31,5 ± 7,7% ID /g blev opnået på dag 4 (tabel 2). AUC for [

111In] 67A2 var 1,7 gange højere end for [

111In] 12A8. Optagelsen af ​​radioaktivt mærkede antistoffer i større organer var lav og faldt gradvist med tiden, svarende til den, rapporteret i tidligere studier for radioaktivt mærkede IgG specifikke for andre antigener [25], [26]. Tumor-til-blod-forhold på [

111In] 12A8 og [

111In] 67A2 på dag 1 var 0,6 og 0,9 henholdsvis og nåede spidsværdier på 3,6 og 4,0, henholdsvis ved dag 10.

den dosis, der absorberes af tumorer blev estimeret baseret på AUC for hver

111In-mærket antistof fra biodistributionsdata. Den dosis, der absorberes af tumorer behandlet med 0,74, 1,85 og 3,7 MBq [

90Y] 12A8 blev anslået til at være 4,2, 10,5 og 21,0 Gy henholdsvis, og at af [

90Y] 67A2 var 7,2, 18,0 og 35,9 Gy, henholdsvis. Den absorberede dosis til rød marv blev anslået fra vores biodistributionsdata at være 0,5 mGy /MBq i en 70-kg henvisning mand for både

90Y-mærkede antistoffer.

radioimmunterapi

Efter [ ,,,0],

90Y] 12A8 behandling, tumor volumen i alle grupper steg indtil dag 3 efter injektion, men faldt derefter i 3,7-MBq behandlingsgruppe og helt forsvundet omkring 2 uger efter injektion (fig. 2A). Administrationen af ​​1,85 MBq [

90Y] 12A8 undertrykte også tumorvækst indtil omkring 2 uger efter injektion, men derefter tumorvolumener begyndte at stige igen (fig. 2A). I grupper behandlet med umærket IgG alene og 0,74 MBq [

90Y] 12A8, observerede vi tumorvækst forsinkelse i forhold til den ubehandlede (PBS) gruppe (

P

0,05) (. Figur 2A). [

90Y] 67A2 behandling viste en højere terapeutisk virkning i forhold til [

90Y] 12A8 på midten til high-dosisniveauer. Administrationen af ​​1,85 og 3,7 MBq [

90Y] 67A2 markant undertrykt tumorvækst, og tumorer helt forsvundet omkring 2 uger efter injektion, bortset fra en enkelt mus behandlet med 1,85 MBq [

90Y] 67A2. Selvom vi observerede tumorvækstforsinkelse i behandlingsgruppen med 0,74 MBq [

90Y] 67A2 sammenligning med den ubehandlede (PBS) gruppe (

P

0,05), var der ingen signifikant forskel i tumorvækst sammenlignet med den umærkede IgG behandlingsgruppe (fig. 2C). Det kropsvægt mus behandlet med [

90Y] 12A8 og [

90Y] 67A2 midlertidigt faldt med cirka 15%, men begyndte at stige inden for den første uge efter behandlingen (fig. 2B og D), og alle mus tolereres RIT eksperimentet op til dag 28 (den sidste dag observeret).

Tumor vækstkurve (A) og kropsvægt (B) for mus behandlet med [

90Y] 12A8. Tumorvækst kurve (C) og kropsvægt (D) for mus behandlet med [

90Y] 67A2 (lukkede cirkler, ubehandlede (PBS), åbne cirkler, umærket IgG alene, lukkede trekanter, 0,74 MBq, åbne ruder, 1,85 MBq ; sorte firkanter, 3,7 MBq)

Histologisk analyse

Der blev observeret Høje antal mitotiske celler i H . E-farvede sektioner af SY tumorer fra den ubehandlede gruppe (PBS), afspejler en høj proliferation aktivitet (fig. 3A). Tumorsnit opnået på dag 7 efter injektion af [

90Y] 12A8 afsløret områder med nekrose og fibrose, at øget på en dosis-afhængig måde (Fig. 3A). Nekrose og fibrose blev også observeret i tumorer behandlet med 1,85 og 3,7 MBq [

90Y] 67A2, men ikke med umærket IgG alene og 0,74 MBq [

90Y] 67A2 (fig. 3A). På TUNEL-farvede snit blev apoptotiske celler sjældent observeret under ubehandlede betingelser (fig. 3A og B). I tumorer behandlet med [

90Y] 12A8, procentdelen af ​​apoptotiske celler havde tendens til at stige med en forøgelse af dosis af radioaktivitet (fig. 3A og B). I modsætning hertil i tumorer behandlet med [

90Y] 67A2, blev der observeret den samme grad af apoptotiske celler til 0,74 til 3,7 MBq uden en dosisafhængig stigning (fig. 3A og B).

(A ) H 0,01 (Students

t

-test)

Diskussion

SCLC er en aggressiv tumor og den 2-årige. overlevelsesraten for patienter med begrænset fase og omfattende fase sygdomme er mellem 20 til 40% og 2 til 5%, henholdsvis [27], [28], [29]. Derfor er ekstra effektiv anticancer terapi nødvendig, især for patienter med omfattende-stadie sygdom. SCLC udtrykker høje niveauer af c-kit, der muliggør hurtig cellevækst og er således en central kandidatmolekyle til diagnose og terapi i SCLC [30], [31], [32]. Vi har tidligere vist, at høje niveauer af anti-c-kit-antistof [

111In] 12A8 akkumuleret i c-kit-udtrykkende tumorer, men ikke i normale organer [17], [18]. Da SCLC er følsom over for stråling, RIT hjælp 12A8 mærket med cytotoksiske radionuklider såsom

90Y eller

131I har potentialet til at være en mere effektiv behandling for SCLC end de nuværende behandlinger. I den foreliggende undersøgelse, vi ansat en ekstra antistof 67A2, der har en højere affinitet for c-kit i forhold til 12A8, og evaluerede den terapeutiske effekt af

90Y-mærket 12A8 og 67A2 i en SCLC musemodel.

In vitro

karakterisering af

111In-mærket 12A8 og 67A2 viste, at [

111In] 67A2 havde fire gange højere bindingsaffinitet end [

111In] 12A8, som forventet. Skønt epitopen genkendt af 67A2 er forskellig fra den af ​​12A8 viste internalisering assay, 67A2 hurtigt blev internaliseret efter binding til c-kit svarende til den, set i 12A8 [17]. Som rapporteret i 12A8, efter c-kit binding og internalisering, blev radioaktivt mærket 67A2 metaboliseres og

125I aktivitet blev ryddet fra cellerne, mens

111 In aktivitet forblev, indikerer metal radionuklider er velegnede til billeddannelse (

111In) og terapi (

90Y) ved hjælp af 67A2 til at målrette tumorceller.

for at afgøre, om kunne bruges antistofferne for RIT af c-kit-udtrykkende tumorer, vi vurderet den langsigtede biodistribution af

111In-mærkede antistoffer, hvorfra tumoren absorberede dosis blev anslået til

90Y-mærket tilsvarende antistoffer. [

111In] 67A2, der har fire gange højere bindingsaffinitet end [

111In] 12A8, viste en højere tumoroptagelse på hvert tidspunkt undersøgt. AUC for tumor tid aktivitet kurven var 1,7 gange større for [

111In] 67A2 end for [

111In] 12A8, viser en højere tumor absorberede dosis ved hjælp af [

90Y] 67A2.

Næste vi mærkede begge antistoffer med

90Y og udført eksperimentelle RIT i mus, der bærer SY tumorer. Administration af 3,7 MBq [

90Y] 12A8 eller 1,85 og 3,7 MBq [

90Y] 67A2 næsten helt undertrykt tumorvækst. Sammenligning af beregning absorberet dosis viste, at tumorer, der modtager en absorberet dosis på mere end 18 Gy opnåede komplet respons i SY tumorer. RIT blev tolereret i mus, som kun udviklede forbigående tab af kropsvægt. Disse resultater tyder på, at

90Y-mærkede antistoffer har potentiale til at give en dødelig dosis af strålebehandling til c-kit-udtrykkende SCLC. Den dosisbegrænsende organ for RIT med IgG er almindeligt den røde marv, og overvejelse af den absorberede dosis til den røde knoglemarv er vigtigt ved fastsættelsen af ​​den terapeutiske strålingsdosis i patienter [33]. I den foreliggende undersøgelse, den absorberede dosis estimeres fra vores biofordeling data var 0,5 mGy /MBq i en 70-kg henvisning mand for både

90Y-mærkede antistoffer; ≤2 Gy almindeligvis anses for at være en sikker strålingsdosis [33] , hvilket indikerer, at den anslåede maksimale terapeutiske dosis er 4 GBq. Men Tolvanen

et al

. rapporterede, at der var uoverensstemmelser mellem de absorberede doser anslået fra ratings og human-afledte data [23]. Desuden til anti-c-kit-antistoffer 12A8 og 67A2 binder til human c-kit, men ikke murine c-kit. Derfor har vi brug en fremtidig klinisk studie med

111In-mærket 12A8 og 67A2 i patienter til at anslå præcis dosimetri. 38% til 78% af SCLC prøver og 42% til 52% af SCLC-cellelinier har høj ekspression af c-kit [30], [34]; Derfor kunne mere end ca. 40% af SCLC patienter potentielt gavn af c-kit målrettet radioimmunterapi. Dette bør yderligere valideres i fremtidige kliniske studier.

Det er interessant, [

90Y] 12A8 undertrykt tumorvækst i en dosisafhængig måde, mens [

90Y] 67A2 opførte sig, som om det krævede en tærskel dosis at være effektiv. Ingen signifikant forskel i tumorvækst blev fundet mellem umærket IgG alene og 0,74 MBq [

90Y] 67A2 behandlingsgrupper selvom 0,74 MBq [

90Y] 67A2 gav en tumor absorberet dosis på 7,2 Gy, som var 1,7 gange højere end den i 0,74 MBq [

90Y] 12A8. Histologisk analyse viste, at området med nekrose og fibrose afspejlede RIT virkning. I modsætning hertil induktion mønster af apoptose var forskellig mellem de to

90Y-mærkede antistoffer. Selv om det ikke er klart, om forskellen i apoptose induktion er relateret til de forskellige mønster af RIT effekt, kan forskellene i de biologiske karakteristika af antistofferne har forårsaget denne uoverensstemmelse. Ifølge producentens oplysninger, 12A8 har en stærk neutralisering aktivitet og mild anti-tumor aktivitet, mens 67A2 hverken, og begge antistoffer ikke besidder ADCC og CDC aktiviteter. Selv om der ikke er noget direkte bevis, at c-kit er involveret i apoptose pathway, c-kit knockdown under anvendelse korte hårnål RNA induceret apoptose i brystcancerceller [35], og c-kit tømt af neutraliserende antistof resulterede i stærkt forøget apoptose i differentierende spermatogonier i mus [36]. Disse resultater rejser den mulighed, at kombinerede c-kit udtømning med strålebehandling kunne inducere synergistiske virkninger, hvilket resulterer i suppression af tumorvækst under anvendelse af en lav dosis af [

90Y] 12A8 trods sin nedre absorberet dosis sammenlignet med [

90Y] 67A2 . Da patienter generelt får høje doser i radikal RIT, vores resultater tyder på, at høj affinitet er en meget vigtig egenskab for antistof, der anvendes i RIT i et klinisk miljø, selv om vi ikke kan udelukke, at andre egenskaber kan påvirke RIT effekt. Det ville være interessant at vurdere muligheden for, at terapeutiske virkninger kunne udvides med andre biologisk karakter (r) af antistoffet i fremtidige studier.

Selvom RIT har potentiale til at øge virkningen af ​​antistofbehandling i mange typer tumorer, i klinisk brug radioimmunterapi til dato har været effektiv kun for blodkræftsygdomme, men ikke for ikke-blodkræftsygdomme [19], [37], [38]. Da det er vanskeligt for antistoffer at trænge ind hele faste tumorer, kan radioaktivt mærkede antistoffer ikke levere en dødelig dosis for alle tumorcellerne i en fast tumor. Men eftersom radiomærkede antistoffer systemisk kan levere cytotoksiske radionuklider til tumorsteder, RIT for faste tumorer i almindelighed betragtes som egnet til behandling af små metastatiske tumorer (mindre end flere cm i diameter), men ikke voluminøse primære tumorer (mere end flere cm i diameter) . I denne henseende SCLC, som har en høj risiko for udbredt metastaser, men som er relativt Radiosensitivitet kan være en god kandidat til RIT. Selv patienter med omfattende fase SCLC traditionelt ikke har modtaget strålebehandling, Slotman

et al

. rapporterede, at profylaktisk kraniel bestråling hos patienter med omfattende trin SCLC resulterede i en signifikant reduktion af hjernemetastaser forekomst og forbedring af overlevelse [39]. Derfor [

90Y] 12A8 og [

90Y] 67A2 kunne være effektiv til behandling af metastatisk cancer celler i fjerne steder og kan have potentiale til at reducere forekomsten af ​​metastaser foruden hjerne i SCLC, især i den omfattende stadium af sygdommen.

Konklusion

Vi evaluerede to radioaktivt mærkede anti-c-kit-antistoffer 12A8 og 67A2 for deres eventuelle ansøgning om RIT af SCLC. Affiniteten af ​​[

111In] 67A2 var fire gange højere end for [

111In] 12A8, og tumor optagelse af [

111In] 67A2 var 1,7 gange højere end for [

111In] 12A8 . Ved midten for at høje doser af

90Y-mærkede antistoffer, tumor kontrol blot afspejlede tumoren absorberede dosis, hvor en tumor absorberet dosis på mere end 18 Gy kunne inducere næsten fuldstændig regression af SCLC xenotransplantat. Dette antyder, at SCLC kan være et godt mål for RIT med

90Y-mærket anti-c-kit-antistoffer. [

90Y] 12A8 og [

90Y] 67A2 er lovende RIT agenter for omfattende fase SCLC.

Tak

Vi takker Maki Okada for teknisk rådgivning og nyttige forslag om dosimetri .