PLoS ONE: Målretning Epigenetisk Regulering af miR-34a til Behandling af kræft i bugspytkirtlen ved hæmning af kræft i bugspytkirtlen Stem Cells

Abstrakt

Baggrund

MicroRNA-34a (miR-34a) er en transskriptionel mål af p53 og er nedreguleret i bugspytkirtelkræft. Denne undersøgelse har til formål at undersøge den funktionelle betydning af MIR-34a i bugspytkirtelkræft progression gennem sin epigenetisk restaurering med chromatin modulatorer, demethyleringsmiddel 5-Aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) og HDAC inhibitor Vorinostat (SAHA).

Metodologi /vigtigste resultater

Re-ekspressionen af ​​miR-34a i humane pancreas cancer stamceller (CSCS) og i humane bugspytkirtelkræft cellelinjer ved behandling med 5-Aza-dC og SAHA stærkt hæmmet den celleproliferation, cellecyklusprogression, selvfornyelse, epitelial til mesenkymale overgang (EMT) og invasion. I pancreas CSCS, modulation af miR-34a induceret apoptose ved at aktivere caspase-3/7. Behandling af pancreas CSCS med kromatin-modulerende midler resulterede i inhibering af Bcl-2, CDK6 og SIRT1, som er de formodede mål for MIR-34a. MIR-34a opregulering af disse midler også induceret acetyleret p53, p21

WAF1, p27

KIP1 og PUMA i bugspytkirtlen CSCS. Hæmning af miR-34a af antagomiR ophæver virkningerne af 5-Aza-dC og SAHA, hvilket tyder på, at 5-Aza-dC og SAHA regulere stamcelle egenskaber gennem miR-34a. I CSCS, SAHA hæmmede Notch vej, tyder på undertrykkelse kan bidrage til hæmning af selvfornyelse kapacitet og induktion af apoptose den. Interessant behandling af pancreas CSCS med SAHA resulterede i inhibering af EMT med den transkriptionelle opregulering af E-cadherin og nedregulering af N-cadherin. Angivelse af EMT induktorer (Zeb-1, Snail og Slug) blev hæmmet i CSCS efter behandling med SAHA. 5-Aza-dC og SAHA også forsinke

in vitro

migration og invasion af CSCS.

Konklusioner

Den foreliggende undersøgelse viser således rollen som miR-34a som en kritisk regulator af kræft i bugspytkirtlen progression af de regulerende CSC egenskaber. Restaureringen af ​​dets udtryk med 5-Aza-dC og SAHA i CSCS vil ikke kun give mekanistisk indsigt og terapeutiske mål for kræft i bugspytkirtlen, men også lovende reagenser til at øge patientens respons på eksisterende kemoterapi eller som en standalone cancer drug ved at fjerne de CSC egenskaber.

Henvisning: Nalls D, Tang SN, Rodova M, Srivastava RK, Shankar S (2011) Målretning Epigenetisk Regulering af miR-34a til Behandling af kræft i bugspytkirtlen ved hæmning af kræft i bugspytkirtlen stamceller. PLoS ONE 6 (8): e24099. doi: 10,1371 /journal.pone.0024099

Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Juni 29, 2011; Accepteret: 31 Jul 2011; Udgivet: 31 August, 2011

Copyright: © 2011 Nalls et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra National Institutes of Health (R01CA125262, RO1CA114469, 3R01CA114469-05S1, og 3R01CA125262-03S1), Kansas Bioscience Authority, og Susan G. Komen Breast Cancer Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft død i USA og er en ødelæggende invasiv sygdom og en af ​​de mest aggressive kræftformer [1]. Den dårlig prognose af pancreas adenocarcinom tilskrives den sene fremlæggelse, mangel på præcise biomarkører til tidlig diagnose for muligheden for kurativ resektion samt tilbøjeligheden af ​​tidlig metastaser. Derfor er et presserende behov for nye diagnostiske modaliteter for tidlig diagnose og nye terapeutiske strategier.

MikroRNA’er (miRNA) er endogene, kodende små RNA 19-25 nukleotider i længden, som nu er anerkendt som afgørende indlæg transkriptionelle regulatorer af gen udtryk [2], [3], [4]. Evne miRNA til at regulere flere gener overensstemmelse dem til at spille vigtige roller i biologiske processer, effekt tumor progression, herunder migration, invasion, epitelial til mesenkymale overgang (EMT) og metastase [5], [6], [7], [8] , [9], [10]. MiRNA er meget lovende, da tidlige biomarkører, prognostiske indikatorer og mekanisme baseret terapeutiske mål for kræftmidler [11], [12], [13], [14], [15], fordi deres afvigende udtryk er knyttet til cancer stamceller (CSC) deregulering og dermed onkogenese [16].

Kræft stamceller giver anledning til tumoren hovedparten gennem løbende selv-fornyelse og differentiering [17]. Pancreas CSCS er meget tumorgene og selvstændige forny delpopulation, der udtrykker de celleoverflademarkøren CD133 + /CD44 + /CD24 + /ESA + [17], [18], [19]. Strategier udvikles hen imod den målrettede ødelæggelse af disse tumor stamceller samtidig skåne de fysiologiske stamceller, som kan føre til en markant forbedring i patientens udfald. Ved at ændre ekspression af specifikke miRNA, der kan spille en vigtig rolle i bugspytkirtlen CSC fornyelse og kan således bidrage til udviklingen af ​​pancreas carcinom, ville bidrage til at nå en selektiv og målrettet fjernelse af bugspytkirtlen CSCS. Derfor forstå de mekanismer, der regulerer selvfornyelse er af største betydning for opdagelsen af ​​anticancer lægemidler rettet mod CSCS.

TP53 er en vigtig tumorsuppressorgen hvis biologiske effekter i høj grad på grund af sin funktion som en transkriptionel regulator [20 ]. TP53 mutationer er forholdsvis almindelige og forekommer hos op til 70% af tilfældene med pancreas adenocarcinom og er mest almindeligt ses i dårligt differentierede tumorer [21], [22], [23], [24], [25]. Tumor suppressor TP53 er blevet identificeret som en transkriptionel regulator af MIR-34a og adskillige nylige undersøgelser har impliceret den MIR-34 familien af ​​miRNA i p53 tumor suppressor netværk [20], [26]. MIR-34a udtrykkes kraftigt i normale væv, såsom testis, lunge, binyre og milt, selv om dets fysiologiske funktion er ukendt. MIR-34a er lokaliseret på humant kromosom 1p36, som er en region associeret med en række af cancere, og har vist sig at være nedreguleret i pancreascancer [20]. Reduceret ekspression af MIR-34a i bugspytkirtelkræft kunne være en resultanten af ​​enten transkriptionel regulering grund p53-mutationer, da disse er meget hyppige [22] eller gennem epigenetisk inaktivering. Derfor forstå bidrag disse mekanismer i nedregulering af miR-34a i bugspytkirtelkræft, som kan bidrage til malignitet i bugspytkirtlen, kunne være af relevans.

MIR-34a virker som en suppressor af neuroblastom tumorigenese ved at målrette mRNA, der koder E2F3 og reducere E2F3 proteinniveauer [27]. Det har også vist sig at være hyper-methylerede i bryst-, ovarie-, tyktarms-, lunge- og hæmatologiske maligniteter og nedregulere CDK6 oversættelse hvilket viser tumor suppressor rolle MIR-34a [28], [29], [30]. MIR-34a responsive gener er stærkt beriget for dem, der regulerer cellecyklus-progression, cellulær proliferation, apoptose, DNA-reparation, og angiogenese hvorved der tilvejebringes en funktionel grundlag for den epigenetiske inaktivering af denne miRNA i pancreascancer [31].

Det er velkendt, at mange tumorsuppressorgener i humane kræftformer er tavse af promotor methylering ledsaget af kromatin ændringer grundet rekruttering af histon deactylases af proteiner binder til methylerede CpG-rester. Disse epigenetiske markører associeret med undertrykkelse af tumorsuppressorgener kan bidrage i tumorudvikling og kan være terapeutisk reversibel, der tjener som mål for kræft i bugspytkirtlen behandling. Baseret på denne forudsætning, kvantificeret vi udtryk for miR-34a i humane pancreas CSCS og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer uanset p53 mutation status, sammenlignet med normale pancreas duktale epitelceller hjælp TaqMan miRNA analyser.

Notch signaler er kendt for at påvirke stamceller selfrenewal og differentiering, og er blevet foreslået at spille en rolle under bugspytkirtlen carcinogenese [32], [33]. Flere medlemmer af Notch-signalvejen er udtrykt i pancreas [32]. De Notch receptorer aktiveres af Delta og Serrate /Jagged ligander [34], som fremmer proteolytisk spaltning og frigivelse af Notch intracellulære domæne (ICD). Den aktiverede Notch-ICD translokerer til kernen og interagerer med transskriptionsfaktoren CSL /RBP-JK og co-aktivator Mastermind (MAM) for at aktivere target gener, såsom Hes1 og Hes5 [35], [36], og Hes ekspression kan derfor anvendes som en udlæsning for Notch-aktivitet [37].

Vores nuværende undersøgelser har afsløret, at ekspressionsniveauer af miR-34a blev væsentligt reduceret i pancreas CSCS og kræft i bugspytkirtlen tumorceller uanset deres p53 mutationsstatus, sammenlignet med normale pancreatiske duktale epitelceller. Dette fører os til hypotesen, at miR-34a, kan således epigenetisk tavshed i kræft i bugspytkirtlen. Reduktion af miR-34a gen methylering og ændret acetylering mønster ved brug af kromatin-modificerende midler resulterede i samtidig reaktivering af miR-34a udtryk. Ekspression af MIR-34a i pancreas CSCS og cellelinier blev signifikant induceret ved behandling med chromatin modifikatorer, demethyleringsmiddel 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) eller histondeacetylaseinhibitoren, SAHA (vorionostat). 5-Aza-dC og SAHA hæmmede også væksten og induceret apoptose i bugspytkirtlen CSCS. Endvidere at forstå den funktionelle rolle af miR-34a i reguleringen af ​​kræft i bugspytkirtlen progression effekten af ​​5-Aza-dC og SAHA på proteinet udtryk for formodede mål for miR-34a i pancreas CSCS blev undersøgt. 5-Aza-dC inhiberede ekspression af cyclin D1 og CDK4 og tværtimod inducerede ekspression af p27

/KIP1, og disse effekter blev ophævet i nærvær af miR34a antagonist. Tilsvarende SAHA nedreguleres ekspressionen af ​​SIRT1, cyclin D1, survivin, Bcl-2, VEGF og CDK6, og opreguleret ekspression af p21 og PUMA på en dosis-afhængig måde. Endvidere behandling af pancreas CSCS med kromatin modifikatorer resulterede i hæmning af selvfornyelse, EMT, migration og invasion af pancreas CSCS

in vitro

. Modulation af ekspression af MIR-34a ved SAHA inhiberede mRNA ekspression af forskellige komponenter i Notch-vejen, hvilket antyder, at MIR-34a kan være involveret i pancreas CSC selvfornyelse. Zeb-1, Sneglen og Slug transkriptionel ekspression blev signifikant reduceret i humane pancreas CSCS og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer ved behandling med SAHA. Vores resultater viser, at miR-34a kan spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​pancreas tumorigenese. Dette er hidtil, den første demonstration af hæmning af pancreas CSC karakteristika ved epigenetisk modulation af miR-34a ved terapeutisk intervention med 5-Aza-dC og SAHA. Derfor vil restaurering af miR-34a udtryk med 5-Aza-dC og SAHA i pancreas CSCS giver ikke kun unikke værktøjer til undersøgelse af miRNA-funktion, men også lovende reagens til at øge patientens respons på eksisterende kemoterapi eller som standalone cancer stof.

Resultater

Expression og restaurering miR-34a i pancreas CSCS og cellelinjer

Vi først målte udtryk for miR-34a i humane pancreas CSCS afledt af primære tumorer og kræft i bugspytkirtlen cellelinier [ASPC-1 (p53wt) og MiaPaCa-2 (p53mutant)] og sammenlignet med normale pancreatiske ductale epiteliale celler under anvendelse kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR-Taqman) og Taqman Real Time Assays. Den sammenlignende Ct (ΔΔCt) metode blev anvendt til bestemmelse af ekspressionen gange ændring af MIR-34a i bugspytkirtelkræftceller sammenlignet med normale pancreasepitelceller. Total RNA input var normaliseret baseret på CT-værdierne opnået for RNU48 anvendt som endogen kontrol. I overensstemmelse med tidligere studier i pancreascancer [20], observerede vi en global reduktion i ekspressionen af ​​MIR-34a i pancreas CSCS og cellelinjer uanset deres p53 mutationsstatus forhold til ikke-neoplastiske pancreatiske epiteliale celler (Fig. 1A).

(A) Relativ udtryk for miR-34a blev kvantificeret i humane bugspytkirtelkræft cellelinjer ASPC-1 (p53wt), MiaPaCa-2 (p53mutant), human pancreas cancer stamceller (PanCSC) og menneskelig pancreas normal duktalt epitel celler (HPNE). (B) Genoprettelse af miR34a af SAHA og Aza-5DC. Kræft i bugspytkirtlen cellelinjer ASPC-1 (p53wt), MiaPaCa-2 (p53mutant) og bugspytkirtelkræft stamceller blev behandlet med SAHA (3 uM) eller Aza-5DC (4 uM) i 24 timer. Ekspressionen af ​​MIR-34a blev kvantificeret under anvendelse af kvantitativ revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR-Taqman) og Taqman Real Time Assays, og normaliseret til RNU48 ekspression. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * = Signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (C), Anti miR34a hæmmer evnen af ​​SAHA og Aza-5DC at genoprette miR34a. Pancreas CSCS blev transient transficeret med enten negativ kontrol (krypteret) eller anti-miR34a oligonukleotid, og behandlet med SAHA (3 uM) eller Aza-5DC (4 uM) i 24 timer. RNA blev ekstraheret for at måle ekspressionen af ​​miR34a af q-RT-PCR som beskrevet ovenfor. NC = negativ kontrol. (D), miR34a-Luciferase reporter-aktivitet. Pancreas CSCS blev transficeret med enten negativ kontrol (krypteret) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med miR34a-Luc konstruere, og behandlet med enten SAHA (1 uM) eller Aza-5DC (2 uM) i 24 timer. Luciferaseaktivitet blev målt i henhold til producentens anvisninger (Promega). Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * = Signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Mir-34a er tæt forbundet med en stor CpG ø tyder på, at det kan være epigenetisk tavshed i kræft i bugspytkirtlen. For at bevise denne hypotese undersøgte vi, hvis den reducerede ekspression af MIR-34a i bugspytkirtelkræft kunne genoprettes ved behandling med en DNA-methyleringsinhibitor, 5-aza-dc og /eller en histondeacetylaseinhibitor, SAHA. Interessant, miR-34a udtryk i pancreas CSCS og kræft i bugspytkirtlen cellelinjer [ASPC-1 og MiaPaCa-2] steg betydeligt efter behandling med disse kromatin-modifiers sammenlignet med mock behandlede kontroller, som målt ved QRT-PCR (fig. 1 B) ved hjælp af Taqman Real Time Analyser ved hjælp af sammenlignende Ct (ΔΔCt) metode. Total RNA input var normaliseret baseret på CT-værdierne opnået for RNU48. Disse resultater viser, at 5-Aza-dC og SAHA inducerer restaureringen af ​​miR-34a i bugspytkirtelkræftceller. Dataene tyder også på, at epigenetisk modifikation af regulatoriske sekvenser i CpG øer og deacetylering af histoner kan bidrage til miR-34a lyddæmpning i kræft i bugspytkirtlen. Yderligere hæmning af miR-34a af antgomiR ophæver virkningerne af 5-Aza-dC og SAHA i restaurering af ekspressionen af ​​miR-34a i pancreas CSCS tyder på, at 5-Aza-dC og SAHA regulere stamcelle karakteristisk gennem miR-34a ( fig. 1C).

Vi næste undersøgte den transkriptionelle regulering af miR-34a i CSCS af miR-34a-luciferase reporter assay (fig. 1D). SAHA og 5-Aza-dC induceret miR-34a-luciferaseaktivitet, hvilket tyder på en funktionel rolle miR34a i pancreas CSCS.

opregulering af miR-34a hæmmer celledeling, og inducerer apoptose og cellecyklusstop i human pancreas CSCS

Vi undersøgte effekten af ​​5-Aza-dC og SAHA om spredning af pancreas CSCS ved trypanblåt farvning. 5-Aza-dC og SAHA inhiberede signifikant celleproliferation på en dosis-afhængig måde i pancreas CSCS (Fig. 2A). Endvidere har vi undersøgt virkningerne af disse kromatin modulatorer på induktion af apoptose og caspase-3/7 aktivitet i pancreas CSCS ved annexin-V og PI farvning og caspase-3/7 aktivitet assay kit, hhv. 5-Aza-dC og SAHA induceret apoptose i CSCS i en dosisafhængig måde, der var forbundet med øget caspase-3/7-aktivitet (fig. 2B og C).

(A), pancreas CSCS blev behandlet med SAHA (3 og 5 uM) og 5-aza-dC (2 og 4 uM) og cellelevedygtighed blev målt ved 48 timer ved farvning med trypanblåt ved brug af Vi-cELL analysator (Beckman-tæller). (B), pancreas CSCS var ubehandlede (a) eller behandlet med SAHA (b) eller 5Aza-dC (c) i 48 timer, og apoptose blev målt ved farvning med annexin-PI hjælp Accuri Flow Cytometer. (C), caspase-3/7-aktivitet blev målt i pancreas CSCS behandlet med SAHA (0,5 og 2 uM) eller 5-aza-dC (1 og 3 uM) i 24 timer. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * Og $ = signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

For bedre at forstå den biologiske betydning af restaureringen af ​​miR-34a, ASPC-1 celler blev behandlet med eller uden SAHA og dens virkninger på fordelingen cellecyklus blev undersøgt ved PI-farvning ved anvendelse af flowcytometri (data ikke vist). SAHA induceret vækststandsning i i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus ved 24 timer i AsPC-1-celler. Endvidere blev SAHA inducerede G2 /M arrest ophævet i nærvær af MIR-34a-antagonist i forhold til den negative kontrol oligonukleotider hvilket antyder inddragelsen af ​​MIR-34a i cellecyklusstandsningen af ​​SAHA (data ikke vist).

Effekt af 5-Aza-dC og SAHA om de formodede mål for miR-34a i pancreas CSCS

Siden miR-34a er involveret i selv forny kapacitet og metastase af pancreas CSCS, udtryk for formodede mål for miR-34a i pancreas CSCS på behandling med 5-Aza-dC og SAHA blev undersøgt ved Western blot analyse (fig. 3A og B). Vores resultater indikerer, at 5-aza-dC og SAHA modulere protein ekspressionsniveauer af kendte direkte målgener af MIR-34a. Interessant SAHA inhiberede ekspression af cyclin D1 og CDK6 og opreguleret ekspression af p21 /CIP1 i pancreas CSCS (fig. 3A). SAHA inhiberede også ekspressionen af ​​SIRT1, survivin, Bcl-2, VEGF, og inducerede ekspression af acetyleret p53 og PUMA på en dosis-afhængig måde. Tilsvarende 5-Aza-dC inhiberede ekspressionen af ​​Notch3, CDK6, survivin og Bcl-2, og inducerede ekspression af p21 /CIP1 og PUMA på en dosis-afhængig måde. Siden SAHA hæmmede ekspressionen af ​​SIRT1 gennem opregulering af miR34a, vi næste undersøgt virkningerne af SAHA på SIRT1 3’UTR-luciferase reporter aktivitet. SAHA inhiberede SIRT1 3’UTR-Luciferaseaktivitet på en dosis-afhængig måde (Fig. 3C). Til sammenligning SAHA havde ingen virkning på SIRT1 mutant 3’UTR-luciferaseaktivitet (indeholdende intet funktionelt miR34a bindingssted). Disse data antyder, at MIR-34a inhiberer SIRT1 ekspression gennem en MIR-34a-bindingssted i 3’UTR af SIRT1.

(A), pancreas CSCS blev behandlet med eller uden SAHA i 48 timer. Ekspressionen af ​​acetyleret-p53, p21, PUMA, SIRT1, CDK6, CyclinD1, survivin og Bcl-2 blev målt ved Western blot-analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B), blev pancreas CSCS behandlet med eller uden 5Aza-dC i 48 timer. Ekspressionen af ​​p21, PUMA, Notch 3, CDK6, survivin og Bcl-2 blev målt ved Western blot-analyse. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C), SIRT1 3’UTR-Luciferaseaktivitet. Pancreas CSCS blev transduceret med enten SIRT1 3’UTR-Luc konstruere eller SIRT1 mutant 3’UTR-Luc konstruere og behandlet med SAHA (0-3 uM) i 24 timer. Luciferaseaktivitet blev målt i henhold til producentens anvisninger (Promega). Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, # Eller% = signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Desuden manipulere ekspression af miR-34a ved hjælp miR-34a antagomiR ændret protein udtryk for sit mål gener (Fig. 4A og B). 5-Aza-dC og SAHA hæmmer ekspressionen af ​​cellecyklus regulerende proteiner (cyclin D1 og CDK2) og VEGF, og op regulerer ekspressionen af ​​P27 /KIP1 i bugspytkirtlen CSCS. Transfektion med antagomiR for miR-34a var alene tilstrækkeligt til at ophæve denne virkning. Disse data tyder på en vigtig og roman mekanisme, hvormed 5-Aza-dC og SAHA mægle deres virkninger på cellevækst og apoptose i bugspytkirtlen CSCS.

(A), blev i bugspytkirtlen CSCS kortvarigt transficeret med enten negativ kontrol (krypteret ) eller anti-miR34a oligonukleotid og behandlet med Aza-5DC (4 uM) i 48 timer. Western blot-analyse blev udført for at måle ekspressionen af ​​cyclin D1, CDK2, p27 og VEGF. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B), blev pancreas CSCS transient transficeret med enten negativ kontrol (krypteret) eller anti-miR34a oligonukleotid og behandlet med SAHA (3 uM) i 48 timer. Western blot-analyse blev udført for at måle ekspressionen af ​​cyclin D1, CDK2, p27 og VEGF. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C), forordning af VEGF-B 3’UTR-Luciferaseaktivitet af Aza-5DC. Pancreas CSCS blev transficeret med enten negativ kontrol (krypteret) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med VEGF-B 3’UTR-LUC konstruere og behandlet med Aza-5DC (0-3 uM) i 24 timer. Luciferaseaktivitet blev målt i henhold til producentens anvisninger (Promega). Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, @ Eller # = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (D), forordning af VEGF-B 3’UTR-Luciferaseaktivitet. Pancreas CSCS blev transficeret med enten negativ kontrol (krypteret) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med VEGF-B 3’UTR-LUC konstruere og behandlet med SAHA (0-3 uM) i 24 timer. Luciferaseaktivitet blev målt i henhold til producentens anvisninger (Promega). Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, @, # = Signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Siden 5-Aza-dC hæmmede ekspressionen af ​​VEGF gennem opregulering af miR34a, vi næste undersøgt virkningerne af 5- Aza-dC på VEGF-B 3’UTR-luciferase reporter aktivitet (fig. 4C). 5-Aza-dC inhiberede VEGF-B 3’UTR-luciferase reporter aktiviteten på en dosis-afhængig måde. Til sammenligning anti-miR34a blokeret de inhiberende virkninger af 5-aza-st på luciferaseaktivitet. Da SAHA inhiberede ekspressionen af ​​VEGF gennem opregulering af miR34a vi også undersøgt virkningerne af SAHA på VEGF-B 3’UTR-luciferase reporter-aktivitet. Som vist i fig. 4D, SAHA inhiberede VEGF-B 3’UTR-Luciferaseaktivitet på en dosis-afhængig måde. Til sammenligning anti-miR34a blokeret de inhiberende virkninger af SAHA på luciferaseaktivitet. Disse data tyder på, at opregulering af miR-34a med 5-Aza-dC og SAHA kan have funktionelle betydning om regulering af hak og selv-fornyelse.

Effekt af miR-34a restaurering på ekspressionen af ​​stamceller fornyelse gener

Notch signalering har vist sig at spille en rolle i stamcelle fornyelse og celle skæbne beslutsomhed i neural, hæmatopoietisk og embryonale stamceller [38]. Jagged 1-ekspression på progenitorceller inducerer selvfornyelse af stamceller grund Notch signaleringsaktivering [39]. Notch receptorer, ligander og downstream mål er blevet identificeret til at være opreguleret i præneoplastiske læsioner til invasiv pancreascancer hos mennesker og mus, hvilket antyder, at Notch-signalering kan være et tidligt begivenhed, der medfører akkumulering af udifferentierede præcursorceller i bugspytkirtelkræft. Vi viser, at re-tvungen udtryk for miR-34a i pancreas CSCS efter behandling med SAHA, forårsager en hæmning i mRNA ekspressionen af ​​alle komponenter i Notch vej, Notch receptor Notch1, Notch 3 og dens ligand Jagged1 og nedstrøms Notch målgenet Hes1 ekspression (fig. 5A). Nedregulering af Notch kan således bidrage til hæmning af stamceller fornyelse og den invasive kapacitet pancreas CSCS.

(A), blev i bugspytkirtlen CSCS behandlet med SAHA (1 og 3 uM) i 24 timer, og den ekspression af Notch1, JAGGED1, NOTCH3 og HES1 blev målt ved QRT-PCR. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * Eller $ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (B), RBP-JK reporter-aktivitet. Pancreas CSCS blev transficeret med enten negativ kontrol (krypteret) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med RBP-JK-LUC konstruere og behandlet med SAHA (0-3 uM) i 24 timer. Luciferaseaktivitet blev målt i henhold til producentens anvisninger (Promega). Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, # Eller @ = signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Siden SAHA hæmmede udtryk for flere komponenter af Notch vej, vi næste målte RBP-JK reporter aktivitet ved luciferaseanalyse ( fig. 5B). SAHA inhiberede RBP-JK-Luciferaseaktivitet på en dosis-afhængig måde. Til sammenligning anti-miR34a blokeret de inhiberende virkninger af SAHA på RBP-JK-luciferaseaktivitet. Disse data tyder på, at opregulering af miR-34a af SAHA kan have funktionelle betydning om reguleringen af ​​VEGF.

Effekt af miR-34a restaurering på epitel-mesenkymale overgang pancreas CSCS

EMT induktion i cancer celler resulterer i køb af invasive og metastatiske egenskaber [40]. Vi undersøgte derfor rolle miR-34a restaurering i EMT regulering i bugspytkirtlen CSCS. Zeb-1 er en afgørende EMT aktivator og undertrykker ekspressionen af ​​basalmembrankomponenter og cellepolaritet faktorer for derved at fremme metastase af tumorceller. Zeb-1 transkription blev inhiberet signifikant i pancreas CSCS og cancercellelinjer ved behandling med SAHA (fig. 6A og B). Derefter undersøgte vi effekten af ​​SAHA på ekspressionen af ​​andre EMT transskription faktorer Sneglen og Slug i bugspytkirtlen CSCS. Tilsammen SAHA resulterede i hæmning af Snail, Slug og Zeb1 transskription (fig. 6B), hvilket tyder på en rolle miR-34a i tilbageførsel af EMT overgang i bugspytkirtlen CSCS. Interessant 5-Aza-dC inhiberede også transkriptionen af ​​Slug (data ikke vist), som eventuelt kan spille en rolle i inhibering af invasion.

(A), pancreascancer cellelinier [ASPC-1 (p53wt ) og MiaPaCa-2 (p53mutant)] og pancreas CSCS blev behandlet med SAHA (1 uM) i 24 timer, og ekspressionen af ​​Zeb1 blev målt ved QRT-PCR. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * = Signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (B), blev pancreas CSCS behandlet med SAHA (1 uM) i 24 timer og ekspressionen af ​​sneglen, Slug og Zeb1 blev målt ved QRT-PCR. HK-GAPD blev anvendt som den endogene normalisering kontrol. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * = Signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (C), forordning af Zeb-1 3’UTR reporter aktivitet. Pancreas CSCS blev transficeret med enten negativ kontrol (krypteret) eller anti-miR34a oligonukleotider sammen med Zeb1 3’UTR-Luciferase konstrukt, og behandlet med SAHA (0-3 uM) i 24 timer. Luciferaseaktivitet blev målt i henhold til producentens anvisninger (Promega). Data repræsenterer gennemsnit ± SD. *, #,% = Signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (D), blev pancreas CSCS behandlet med SAHA (1 uM) eller 5-aza-dC (2 uM) i 24 timer og ekspressionen af ​​E-cadherin og N-cadherin blev målt ved QRT-PCR. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * = Signifikant forskellig fra kontrol, P. 0,05

Siden SAHA hæmmede ekspressionen af ​​Zeb-1 gennem opregulering af miR34a vi også undersøgt virkningerne af SAHA på Zeb1 3’UTR-luciferase reporteraktivitet. Som vist i fig. 6C, SAHA inhiberede Zeb-1 3’UTR-Luciferaseaktivitet på en dosis-afhængig måde. Til sammenligning anti-miR34a blokeret de inhiberende virkninger af SAHA på Zeb-1 3’UTR-Luciferaseaktivitet. Disse data tyder på, at opregulering af MIR-34a ved SAHA kan have funktionel signifikans på EMT regulering ved at inhibere Zeb-1.

Cadherin switch er blevet vist at forekomme under EMT regulering. Behandling af pancreas CSCS med SAHA og 5-aza-dC alene inducerede ekspressionen af ​​E-cadherin og inhiberede ekspressionen af ​​N-Cadherin, hvilket viser, at MIR-34a er en stærk inducer af en epitelial fænotype (Fig. 6D).

5-Aza-dC og SAHA hæmme migration, kolonidannelse, invasion og kugleformet dannelse

for yderligere at forstå virkningen af ​​opregulering af miR-34a udtryk på invasive potentiale pancreas CSCS, Derefter undersøgte vi virkningen af ​​5-aza-dC og SAHA på pancreas CSCS vha scratch migration, blød agar-kolonidannelse, og transwell Boyden kammer invasion assays. Repræsentative mikrofotografier af celler invaderer gennem bunden genereret for kontrollen og 5-aza-dC og SAHA behandlet pancreas CSCS viste signifikant mindre migration i den behandlede gruppe panel sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 7A).

(A ), Mikrofotografier viser resultaterne af in vitro migration af pancreas CSCS hjælp af det enkle scratch teknik. Pancreas CSCS blev dyrket i monolag, ridset og behandlet med SAHA og 5-aza-dC i 24 timer. (B), SAHA og 5-aza-dC inhiberer kolonidannelse med CSCS. Pancreas CSCS blev podet i blød agar og behandlet med SAHA (1 og 3 uM) eller 5-aza-dC (2 og 4 uM) i 21 dage. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev kolonier talt. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. * Og $ = signifikant forskellig fra kontrol, P 0,05. (C), blev CSCS udpladet på Matrigel-coatede membran i øverste kammer i transwell og behandlet med SAHA (1 og 3 uM) eller 5-aza-dC (2 og 4 uM) i 48 timer. Celler invaderet til den nedre kamre blev fikseret med methanol, farvet og fotograferet. (D), blev pancreas CSCS podet i suspension og behandledes med SAHA (1 og 3 uM) eller Aza-5DC (2 og 4 uM) i 7 dage. Billeder af spheroids dannet i suspension blev taget af et mikroskop

. 5-Aza-dC og SAHA reducerede evne pancreas CSCS at danne bløde agar kolonier i forhold til kontrol (. Fig 7B) og transfektion med anti-mIR-34a ophævet virkningerne af 5-aza-dC og SAHA på kolonidannelse (data ikke vist). Invasion af pancreas CSCS gennem matrigel coatede membran viste, at antallet af indtrængende celler blev signifikant inhiberet i 5-Aza-dC og SAHA behandlede celler og var ca. 75% mindre end antallet af celler invaderende i kontrolgruppen (fig. 7C) . Endvidere 5-Aza-dC og SAHA inhiberede klumpformet dannelse i pancreas CSCS som vist i fig. 7D. Disse resultater viser, at miR-34a kan spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​pancreas tumorigenese ved at hæmme selvfornyelse kapacitet pancreas CSCS, metastase og invasion.

Diskussion

MikroRNA’er (miRNA) er små ikke-kodende RNA’er, der regulerer ekspressionen af ​​andre gener ved transkriptionel inhibering eller translationel undertrykkelse. Akkumulere tyder en rolle for microRNA i human carcinogenese som nye typer af tumor undertrykkere eller onkogener [41], [42]. For nylig blev fundet MIR-34a familiemedlemmer skal reguleres direkte af TP53, og den funktionelle aktivitet af MIR-34a indikerede en potentiel rolle som tumorsuppressor. Vi viser i denne undersøgelse, at miR-34a udtryk ned reguleres i humane pancreas CSCS og pancreas tumor afledt cellelinjer, uanset deres p53 mutationsstatus.