PLoS ONE: MicroRNA-206: Effektiv Hæmning af gastrisk kræft Progression gennem c-Met Pathway

Abstrakt

MikroRNA’er er endogene kortkædede nukleotid RNA, der regulerer gen funktion ved direkte binding af target mRNA. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningerne af microRNA-206 (MIR-206) på udviklingen af ​​mavekræft. MIR-206 blev først bekræftet at blive nedreguleret i gastrisk cancer prøver. Omvendt opregulering af c-Met blev bekræftet i vævsprøver af human gastrisk cancer, med dens niveau omvendt korreleret med MIR-206-ekspression. Indførelse af MIR-206 inhiberede celleproliferation ved indførelsen G1 cellecyklusstandsning, samt migration og invasion. Endvidere blev vigtige proliferation og /eller migrering relaterede molekyler, såsom c-Met, CDK4, p-Rb, p-Akt og p-ERK bekræftet at de nedreguleres ved Western blot analyse. Målretning af c-Met også direkte berørt AGS celleproliferation, migration og invasion.

In vivo

, miR-206, der udtrykker tumorceller også vises vækst forsinkelse i forhold til uberørte tumorceller. Vores resultater viste, at MIR-206 undertrykte c-Met-ekspression i gastrisk cancer og kunne fungere som en potent tumorsuppressor i c-Met overudtrykker tumorer. Inhibering af MIR-206 funktion kan bidrage til afvigende celleproliferation og migration, hvilket fører til gastrisk cancerudvikling

Henvisning:. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) MicroRNA-206: Effektiv Hæmning af mavekræft Progression gennem c-Met Pathway. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10,1371 /journal.pone.0128751

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: Februar 4, 2015; Accepteret: May 1, 2015; Udgivet: 17 Jul 2015

Copyright: © 2015 Zheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af National Natural Science Foundation of China Grant 81100671 (DY), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China Grant Y2110609 ( DY), og Wenzhou Science Teknologi Bureau Grant Y20080096 (DY). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i verden [1]. Dens sygelighed og dødelighed er særlig udtalt i de asiatiske lande på grund af en række forskellige påvirkninger [1]. Siden sin præsentation ofte er forbundet med fremskreden sygdom, er der et presserende behov for fremskridt i sin afsløring og i sidste ende dens ledelse. På nuværende tidspunkt er forståelsen af ​​microRNA (miRNA) om at påvirke mavens kræft dannelse forekommer i et hastigt tempo.

Siden den første beskrivelse af miRNA i nematode

C

.

elegans

tilbage i 1993, virkningen af ​​disse små ikke-kodende RNA har overskredet flere grene af molekylær biologi [2]. MiRNA er meget væv specifikke biomarkører med potentiale til at ændre og omdanne bosat væv. Fordi overekspression og under-udtryk har begge været forbundet med tumorigenese [3], deres roller som onkogener og tumorsuppressorgener er begge veletablerede [4, 5]. I løbet af de sidste mange år, er deres indvirkning på udviklingen og afsløring af faste organer tumorer, herunder mavekræft langsomt belyst. Der er allerede flere miRNA identificeret i mavekræft antiapoptotiske mekanisme såsom miR-21 og miR-148a [6, 7]. Andre veje påvirket af miRNA omfatter cellecyklusprogression bestående af miR-222/221 miR-106b /93/25 og miR-24 [6, 7].

En af de andre lovende nye miRNA til faste organer tumorer omfatter mIR-206 [8]. Dette særlige miRNA tilhører en gruppe af “myomiRs”, der er involveret i skeletmuskulatur udvikling [9]. Efter at være blevet forbundet med adskillige andre sygdomme, herunder hjertesygdomme, kronisk obstruktiv lungesygdom og Alzheimers, dens rolle i onkogenese modtaget kontrol nylig herunder rhabdomyosarcom, lungecancer, colorektal cancer, schwannom, og gastrisk cancer [8, 9]. Selvom forhøjet i et par typer af kræft, herunder æggestokkene og Waldenströms makroglobulinæmi, er miR-206 meste undertrykt i faste organer tumorer [9]. MIR-206 er tidligere blevet vist at inhibere gastrisk cancer proliferation delvis ved at undertrykke cyclin D2 [10]. I denne undersøgelse, vi koncentreret os om den rolle, MIR-206 i gastrisk cancer onkogenese gennem c-Met-vejen, som traditionelt har været en indflydelsesrig signalvej til onkogenese i en række tumorer [11]. c-Met er blevet forudsagt, og vist sig at være target-genet af flere miRNA herunder miR-206 [9, 12].

Resultater

Undertrykkelse af miR-206 ført til øget c-Met ekspression i gastrisk cancer

Real-time RT-PCR-analyse blev udført for at detektere ekspressionen af ​​mIR-206 i 40 gastrisk cancer prøver og normale væv. MIR-206-niveauer i de fleste vævsprøver af gastrisk tumor (34/40) sig at være betydeligt lavere end normalt væv (Fig 1A). MIR-206-ekspression blev omvendt relateret til niveauet af c-Met observeret i tumorprøver (Fig 1B). De fleste tumorprøver, med nedsat MIR-206-ekspression, viste høj procentdel ( 50%) af c-Met-farvning. Omvendt tumorer med normal ekspression af MIR-206 udviste meget svag eller negativ c-Met-ekspression.

(A) Real-time RT-PCR-analyse, der viser ekspressionen af ​​MIR-206 i normale væv (sat til 1 ) og den relative mængde af mIR-206 i tumorerne, som fold-reduktion. N: normale væv; T: tumorer. U6 snRNA blev anvendt som en intern kontrol. (B) MIR-206-ekspression i celler blev omvendt korreleret med c-Met. Den repræsentative immunhistokemisk farvning af tre gastriske tumorprøver og deres respektive tilgrænsende normale væv blev præsenteret. Prøve nummer 2, 6, og 23 er identiske med dem i realtid RT-PCR. Tumor celler med 50% positiv farvning blev anset for at have en stærk c-Met-ekspression.

miR-206 induceret G1 anholdelse og hæmmede celleproliferation, migration og invasion af AGS gastrisk kræftceller

Som miR -206 ekspression blev reduceret i gastrisk cancer prøver, vi har forsøgt at bestemme, om indførelsen af ​​mIR-206 havde nogen biologisk virkning på AGS-celler. AGS celler transficeret med MIR-206-molekyle viste inhibering af cellevækst i forhold til negativ kontrol baseret på MTS-assay (Fig 2A). FACS-analyse af cellerne viste G1 cellecyklusstandsning (S1 Fig). Antallet af kolonier blev også reduceret med transfektion af MIR-206 (S2 Fig).

(A) MTS celleproliferationsassay blev udført på dag 3 som angivet. (B) AGS celler blev vurderet med Transwell og Matrigel assays. Antallet af celler, der var migreret gennem kulturen insert porer (venstre) eller havde invaderet gennem Matrigel insert porer (højre) blev kvantificeret ved at tælle fem uafhængige synsfelter. *: Forskelle i celle migration eller invasion mellem miR-206 og negative kontrol transfekterede celler var signifikant,

P

0.01.

MIR-206 kan hæmme migration og invasion af AGS-celler (Fig 2B og S3 Fig). En dramatisk reduktion af migration mod de nedre kamre blev observeret i miR-206 transfekterede AGS-celler (86 ± 15 vs 165 ± 16 i AGS celler,

P

0,01, n = 3). Desuden celler transficeret med MIR-206 viste, at HGF-induceret invasionsevne også signifikant hæmmet efter MIR-206 transfektion (57 ± 12 vs. 116 ± 14 i AGS celler,

P

0,01, n = 3).

miR-206 nedreguleret c-Met-ekspression og andre cellecyklus-relaterede proteiner

Vi har tidligere identificeret c-Met som et direkte mål for miR-206 [9]. Western blot-analyse bekræftede, at c-Met-ekspression blev reduceret med MIR-206 transfektion i AGS celler (figur 3). Samtidig ektopisk MIR-206 også nedreguleret ekspression af CDK4, p-Rb, p-Akt og p-ERK.

MIR-206 nedregulerer også ekspression af p-Akt og p-ERK1 /2, men ikke total Akt eller ERK1 /2.

nedregulering af c-Met hæmmede mavekræft proliferation, migration og invasion

Dernæst c-Met specifikke siRNA blev første gang brugt til at mindske udtryk for c-Met i AGS-celler (S4 fig). MTS assays blev udført for at detektere proliferation af celler. AGS celler transfekteret med c-Met siRNA viste reduceret cellevækst sammenlignet med negative kontrolceller (figur 4A; 25.10 ± 3,81% fald). Både HGF-induceret migration og invasion blev reduceret ved at sammenligne c-Met siRNA transficerede celler til negative kontrol transfekterede celler. Som angivet i fig 4B og S5 Fig, fald i migration (88 ± 10 vs. 155 ± 15, P 0,01, n = 3) og invasion (72 ± 7 vs. 126 ± 12, P 0,01, n = 3) var begge statistisk signifikante.

(A) MTS celleproliferationsassay blev udført på dag 3 efter transfektion. (B) Virkningen af ​​c-Met siRNA på AGS celler blev kvantificeret ved hjælp af kultur eller Matrigel skær.

Indførelse af miR-206 undertrykte tumorvækst

in vivo

Vi næste undersøgt, om overekspression af miR-206 kunne undertrykke tumorvækst

in vivo

. Efter 8 uger, de midlede tumorvolumener var betydeligt lavere fra celler inficeret med lentivirus udtrykker MIR-206, sammenlignet med kontrol (figur 5).

(A) Repræsentative fotografier af nøgne mus 8 uger efter inokulering. (B) Gennemsnit volumen af ​​tumorer var statistisk signifikant. *: N = 5 hver,

P

0.01.

Diskussion

mavekræft er forblevet en væsentlig sundhedspleje byrde på verdensplan på trods års forskning [1]. Ifølge WHO, mavekræft er stadig en af ​​de øverste kræft ætiologier med en høj dødelighed [1]. Som med andre faste orgel tumorer, er det i stigende grad klart, at en bedre forståelse af tumor onkogenese er nødvendigt at forbedre prognosen for disse patienter. At være fremherskende i de asiatiske lande, er data at opstå på den rolle, miRNA på udviklingen eller undertrykkelse af gastrisk kræft [6].

miRNA har dobbeltfunktioner i form af mavekræft udvikling [6, 13]. Nogle miRNA er tumorsuppressorer og andre er oncomiRs [6]. Ueda et al. fundet 22 miRNA opregulerede og 13 nedreguleret i plasmaet hos patienter med gastrisk cancer [13]. Mål, der er under efterforskning i tilfælde af mavekræft omfatter regulatorer af p16, via miR-24, og p21 gennem miR-222/221 og miR-106b /93/25 [6]. Andre, såsom MIR-21, kan opreguleres i op til 92% af gastriske cancer vævsprøver [14]. Kandidater er identificeret i mavekræft tjener som tumorsuppressorer omfatter miR-181b, miR-101 og miR-486 [6]. For eksempel er MIR-101 menes at målrette EZH2, Cox-2, Mcl-1 og Fos [15]. MIR-486 menes at påvirke OLFM4, muligvis påvirker apoptose nedstrøms [16].

Efter at have konstateret, at størstedelen af ​​miRNA tjene som tumorsuppressorer, undersøgte vi c-Met-vejen i gastrisk cancer. Ved at studere c-Met vej for rhadbomyosarcoma, fandt vi vigtigheden af ​​denne vej hos sarkom [9]. c-Met er kendt for at blive dysreguleret i gastrisk cancer [11, 17-19]. MET proto-onkogen koder for et protein kendt som hepatocytvækstfaktor (HGF) receptor, som besidder tyrosinkinase-aktivitet [18]. Vi normalt finder det kun udtrykkes i stamceller, men har også set sin dysregulation i onkogenese [18]. I denne undersøgelse, var vi i stand til at bekræfte, at c-Met er signifikant involveret i gastrisk kræft og dens rolle som miR-206 mål er omdrejningspunktet i onkogenese.

cellecyklusprogression er dysreguleret i mavekræft. Baseret på tidligere rapporter, er cyklin D2 forhøjet i mavekræft når miR-206 er påvirket [10]. MIR-206 har vist sig at være en kraftig prognostisk markør [10]. Dens nedregulering er forbundet med kortere samlet overlevelse. Restaurering af miR-206 fører til G0 /G1 cellecyklusstop, bekræftede sin rolle som en tumor suppressor. Vores arbejde viste også cellecyklus dysregulering med CDK4 og phosphoryleret-Rb blive påvirket. CDK4 er medlem af cyclin-afhængig kinase familie med Ser /thr proteinkinaseaktivitet. Det fører til G1-fasen progression. Desuden kinasen fører til phosphorylering af Rb, der er en tumorsuppressor involveret i cellecyklusprogression.

Skønt tilsvarende resultater er blevet bekræftet i gastrisk, ovarie- og brystcancer, forekommer rolle MIR-206 at have en modsat virkning i colon cancer [6, 20]. En omvendt korrelation blev bemærket mellem MIR-206 og KLF4 i et panel af humane coloncancerformer [20]. KLF4, som har onkogene egenskaber i andre cancere, såsom bryst, hud og lunge, fungerer som en tumorsuppressor i coloncancer [20]. Dets promotor er hyper-methyleret med forhøjede niveauer af MIR-206 fører til nedregulering af KLF4 [20]. Disse resultater viser, at miR-206 ikke kan fungere på samme måde i alle epitelceller, som ophæver one size fits all tilgang kemoterapeutika.

I den foreliggende undersøgelse, vi identificeret en mekanisme til regulering af c-Met genekspression gennem mIR-206 i gastrisk cancer. c-Met overekspression efter MIR-206 nedregulering synes at være det fælles ætiologi for patogenesen af ​​mavecancer i de fleste undersøgte prøver i denne undersøgelse. Sammenfattende har vi vist, at MIR-206 negativt modulerer c-Met signalvej involveret i celleproliferation og migration. Vores undersøgelser vil forhåbentlig have vigtige kliniske konsekvenser i behandlingen af ​​mavekræft. miR-206 er en kandidat til både immunhistokemisk detektion af små tumorer og mulige mål for biologiske lægemidler.

Materialer og metoder

Cell kultur

Den menneskelige mavekræft cellelinje, AGS, købt fra ATCC (Manassas, VA), blev dyrket i Hams F-12-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum. (FBS; Hyclone, Logan, UT)

Ethics erklæring

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med de anbefalinger og godkendelse af Wenzhou Medical University Animal Care og brug Udvalg (Permit nummer: WZMCOPT-043.011). Fyrre gastrisk tumor prøver og normale donor gastriske væv blev opnået fra den anden tilknyttede hospital af Wenzhou Medical University (Wenzhou, Kina). Prøvetagning blev godkendt af Wenzhou Medical University Ethics Committee om forskning med menneskelige forsøgspersoner, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hvert enkelt tilfælde. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen og national lovgivning.

Kvantitativ RT-PCR

Total RNA blev ekstraheret fra humane gastrisk tumor prøver og normale kontroller med Trizol reagens (Invitrogen). 10 ng af total RNA blev anvendt til cDNA-syntese af Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), og MIR-206 ekspressionsniveauet blev kvantificeret ved Taqman MicroRNA assay (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR blev udført under anvendelse af Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems).

Immunohistokemisk farvning af c-Met

Sektioner af formalinfikseret paraffinindlejret humane gastrisk tumor prøver (5 um) blev foretaget, og derefter de-paraffinized med xylen og ethanol. Objektglas blev behandlet med 0,3% hydrogenperoxid og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med c-met-antistof ved 1: 300 fortynding (CST, Beverly, MA). Immunhistokemisk farvning blev udført under anvendelse af EnVision HRP /DAB detektionssystem (Dako, Glostrup, Danmark).

Celleproliferationsassay

AGS celler blev udpladet med 2000 celler per brønd i 96-brønds plader ( Costar, High Wycombe, UK) for hver transfektion. Transfektioner blev udført med reagens (Lipofectamin RNAiMAX; Invitrogen), i triplikater. For hver brønd blev 50 nM MIR-206 efterligner molekyle (Ambion, Austin, TX), eller en negativ kontrol (Ambion) transfektion anvendes. Efter 72 timers dyrkning blev celleproliferationen vurderet ved MTS-assay (CellTiter 96 Aqueous; Promega, Madison, WI).

Transwell migration assays

24 timer efter transfektion, AGS celler blev høstet ved trypsinisering og vasket en gang med D-Hanks opløsning (Invitrogen). For at måle cellemigrering eller invasion, 8-um porestørrelse kultur eller Matrigel inserter (Transwell; Costar) blev anbragt i brøndene på 24-brønds dyrkningsplader. I det nedre kammer, 400 pi F-12 indeholdende 10% FBS og 20 ng /ml HGF blev tilsat. Derefter blev 5×10

4 celler tilsat til det øvre kammer. Efter 20 timers inkubation blev celler, der var migreret gennem porerne farvet med krystalviolet og observeret under mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland) under anvendelse af en 20 x objektiv.

Western blot-analyse

AGS celler (1×10

5) blev podet i plader med 6 brønde og dyrket i F-12 i 24 timer forud for transfektion. 72 timer efter transfektion blev cellerne vasket med koldt PBS og underkastet en lyseringsbuffer (35 mM Tris-CI [pH 6,8], 20 g /l natriumdodecylsulfat [SDS], 100 mM dithiothreitol). Proteinlysater (20 ug hver) blev adskilt under anvendelse af 8% SDS-polyacrylamidgelelektroforese, derefter elektro-overført til nitrocellulose filtermembraner. Membranerne blev blokeret med en puffer indeholdende 5% fedtfri mælk i PBS med 0,05% Tween-20 i 2 timer og inkuberet natten over med antistof ved 4 ° C. Efter en anden vask med PBS indeholdende 0,05% Tween-20 blev membranerne inkuberet med peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer (Millipore, Darmstadt, Tyskland) og fremkaldt med en forbedret kemiluminescensdetektion kit (Pierce, Rockford, IL). GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Antistoffer for CDK4, p-Rb, ERK, Akt, p-ERK, p-Akt, c-Met og GAPDH var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA).

siRNA analyser

c-Met-specifik siRNA (Ambion) og negativ kontrol siRNA (Ambion) blev anvendt til at nedregulere c-Met-ekspression i AGS celler. 50 nM c-Met-specifikke siRNA eller negativ kontrol siRNA blev transficeret i AGS celler med Lipofectamine RNAiMAX. MTS-assay blev udført 72 timer efter transfektion, mens Transwell og Matrigel assays blev udført 24 timer efter transfektion, som beskrevet ovenfor.

In vivo

tumorvækstassay

pre-microRNA ekspressionskonstrukter Lenti-miR-206 og pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP styrevektor blev købt fra System Biosciences (Mountain View, CA). AGS-celler blev inficeret med lentivirus udtrykker MIR-206 eller negativ kontrol. Nøgne hunmus, 6 uger gamle, blev inokuleret med AGS celler (8×10

6), der udtrykker MIR-206 eller negative kontroller i deres flanker, og derefter aflivet efter 8 uger. Tumor størrelse blev målt og volumen blev beregnet ved hjælp af formlen: (

L

x

W

2) x 0,5, (

L

, længde;

W

, bredde), ifølge fremgangsmåden tidligere rapporteret [21]. Alle undersøgelser og procedurer blev godkendt af Wenzhou Medical University Animal Care og brug Udvalg.

Statistisk analyse

Alle data blev vist som middelværdien ± SEM. De viste resultater er udtrykt som middelværdien ± SEM af resultaterne fra tre eksemplarer i et eksperiment. Resultaterne repræsenterer de, der opnås i tre separate forsøg. Forskelle mellem eksperimentelle grupper og kontrolgrupper blev analyseret ved hjælp af Students

t

-test. Statistisk signifikans blev accepteret på

P

0.05.

Støtte Information

S1 Fig. FACS-analyse af AGS-celler transficeret med MIR-206. Salg AGS celler blev opsamlet 48 timer efter transfektion med MIR-206 eller NC, farvet med propidiumiodid, og analyseret ved flowcytometri. Ti tusinde celler blev vurderet i hver prøve. De mest repræsentative resultater i tre uafhængige forsøg er afbildet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s001

(TIF)

S2 Fig. Kolonidannelse assayet.

AGS celler transficeret med MIR-206 eller NC blev podet ved lav densitet. Efter 7 dage blev kolonidannelse bestemt ved farvning med krystalviolet. Typiske resultater i tre uafhængige forsøg er vist

doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s002

(TIF)

S3 Fig. Virkningerne af MIR-206 på AGS celler blev vurderet med Transwell og Matrigel assays.

Antallet af celler, der var migreret gennem kulturen insert porer (op) eller havde invaderet gennem Matrigel insert porer (ned) blev fotograferet under anvendelse af et 20X mikroskop mål

doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s003

(TIF)

S4 fig. . Nedregulering af c-Met ved siRNA

Western blot-analyse blev udført for at bekræfte undertrykkelse af c-Met-ekspression efter lipofectamin transfektion af AGS-celler med enten c-Met siRNA eller en negativ kontrol (NC)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s004

(TIF)

S5 fig. Virkningerne af c-Met siRNA på AGS celler blev vurderet med Transwell og Matrigel assays.

Antallet af celler, der var migreret gennem kulturen insert porer (op) eller havde invaderet gennem Matrigel insert porer (ned) blev fotograferet under anvendelse en 20X mikroskop mål

doi:. 10,1371 /journal.pone.0128751.s005

(TIF)