PLoS ONE: Pennogenyl saponiner fra almindelig firblad L. Fremkald Ydre og Indre Pathway af apoptose i Human Livmoderhalskræft HeLa Cells

Abstrakt

Pennogenyl saponiner er de aktive forbindelser stort antal plantearter og dermed mange polyherbal formuleringer . Derfor har stor interesse været vist i deres karakterisering og i undersøgelsen af ​​deres farmakologiske og biologiske egenskaber, især anticancer. Nærværende undersøgelse rapporter om evalueringen af ​​cytotoksiske virkninger og forklaring af de molekylære virkningsmekanismer af de to pennogenyl saponiner (PS 1 og PS 2) isoleret fra

Paris quadrifolia

L. jordstængler på menneskers cervikal adenokarcinom cellelinie HeLa . For at bestemme levedygtigheden af ​​cellerne behandlet med forbindelserne vi brugte realtid celleproliferation analyse og fandt, at pennogenyl saponiner PS 1 og PS 2 stærkt hæmmet vækst på tumorceller med IC50-værdier på 1,11 ± 0,04 ug /ml og 0,87 ± 0,05 ug /ml. Flowcytometri analyse viste, at de to forbindelser induceret apoptose på en dosis-afhængig måde og nedsat mitrokondriemembranen i HeLa-celler i det tidlige stadium af apoptose. Kvantitativ PCR og Western blot-analyse viste, at de to saponiner signifikant forøget mRNA-ekspression af FADD og BID samt induceret caspase-8 via forøget af procaspase-8 forarbejdning i de behandlede celler. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at både den ydre død receptor og iboende mitokondrie veje er involveret i programmeret celledød

Henvisning:. Stefanowicz-Hajduk J, Bartoszewski R, Bartoszewska S, Kochan K, Adamska A, Kosinski I, et al. (2015) Pennogenyl saponiner fra

Paris quadrifolia

L. Fremkald Ydre og Indre Pathway af apoptose i Human livmoderhalskræft HeLa-celler. PLoS ONE 10 (8): e0135993. doi: 10,1371 /journal.pone.0135993

Redaktør: Boris Zhivotovsky, Karolinska Institutet, SVERIGE

Modtaget: 16. april, 2015; Accepteret: 28 Juli 2015; Udgivet: 21 August, 2015

Copyright: © 2015 Stefanowicz-Hajduk et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data . er inden papiret

Finansiering: Denne forskning blev støttet af den polske ministerium for videnskab og videregående uddannelse under tilskud nr N N405 669.140 (til JR Ochocka) og fra kvalitet – fremme tilskud under den førende nationale Forskningscenter (ved) program for perioden 2012-2017. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, decicion at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

steroide saponiner er den gruppe af sekundære metabolitter som findes i stort antal enkimbladede planter. Derfor er de bestanddele af mange plante narkotika og folkemusik medicin, især af Orient oprindelse [1], hvor almindelige kilder til saponiner er de arter fra

Liliaceae

familie. En af de vigtige saponin-bærende slægt fra denne familie er

Paris

, der omfatter over tyve plantearter. Disse arter indeholder hovedsageligt pennogenyl og diosgenyl glycosider [2], som er fysiologisk aktive forbindelser [3, 4] og spiller en vigtig rolle i behandlingen af ​​neoplasmer, hæmostatiske forstyrrelser, betændelse og svampeinfektion [5-7]. I folkemedicinen, de er gavnlige i behandlingen af ​​traumatiske skader, slangebid, bylder, fåresyge og mastitis.

Megen opmærksomhed er betalt til den cytotoksiske aktivitet pennogenin saponiner isoleret fra

Paris polyphylla

[8-10]. Disse komponenter viser betydelige antiproliferative aktiviteter på lever, bryst og prostata kræftceller [11, 12]. Nylige data tyder på, at pennogenyl glycosider besidder en anti-metastatisk virkning på melanomaceller [13] og

in vivo

anticancer aktivitet over hepatocellulært carcinom [14]. Styrken af ​​disse virkninger på tumorceller er mangfoldigt og er strengt forbundet med kemiske struktur af saponin forbindelser, som er mest kendt [10, 15-17].

På trods af de mange fytokemiske undersøgelser, er der ganske få forskning der forsøger at udforske mekanismerne i pennogenyl saponiner handling på tumorceller, primært på grund af deres lave indhold i planter [9, 13, 14].

den foreliggende undersøgelse undersøger mekanismen af ​​cytotoksiske virkninger af de to pennogenyl saponiner (PS) isoleret fra

Paris quadrifolia

L. på humane cervikale adenocarcinomceller (HeLa). De saponiner blev opnået fra

Paris

jordstængler og kemisk identificeret i vores tidligere undersøgelse [18]. Strukturen af ​​forbindelse PS 1 bestemtes som pennogenin 3-

O

-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside

and Forbindelse PS 2 som pennogenin 3-

O

-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside. Disse forbindelser har stærke antitumoregenskaber på de testede celler. Men mekanismerne i deres cytotoksiske virkning, ifølge vores viden, forbliver delvist belyst [19]. En af de mulige mekanisme, der spiller en rolle i inhibering af HeLa-celler proliferation er induktion af apoptose via aktivering af caspaser relateret til iboende signalvej [19]. I vores undersøgelse postulerer vi, at både de pennogenyl saponiner inducerer apoptose også gennem aktivering af død receptor-medieret vej.

Materialer og metoder Salg

Materialer

Dulbeccos modificerede Eagles- medium (DMEM), penicillin, streptomycin, L-glutamin, DMSO, PBS, 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) farvestof blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

isolation og kemiske egenskaber i de to undersøgte pennogenyl saponiner fra

P

.

quadrifolia

jordstængler blev udført og tidligere [18] beskrevet. De frysetørrede forbindelser blev opløst i DMSO ved en koncentration på 1 mg /ml.

Cell line kultur

Den humane cervikale adenocarcinom cellelinie (HeLa S3) og humane keratinocytter (HaCaT) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). Cellelinjer blev dyrket i DMEM suppleret med 10% (vol /vol) FBS, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 2 mM L-glutamin og blev holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% COz

2 inkubator.

MTT assay

levedygtigheden af ​​cellerne blev bestemt ved anvendelse af MTT-analysen. Cellerne blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 2×10

3 celler /brønd og behandlet i 24 timer med forbindelserne PS 1 og PS 2 i koncentrationsområdet 0,1-10,0 ug /ml. DMSO blev tilsat til kontrolcellerne i en slutkoncentration på 1,0% (v /v), som var relateret til den maksimale koncentration af opløsningsmidlet forbindelser anvendt i eksperimentet. Efter behandling blev MTT (0,5 mg /ml) tilsat til mediet, og celler blev inkuberet i 3 timer ved 37 ° C. Absorbansen af ​​den formazan opløsning blev målt ved 570 nm med en pladeaflæser (Epoch, Biotek Instruments, USA). Resultaterne er udtrykt som IC50 middelværdier (± SD, standardafvigelse) på mindst to uafhængige forsøg.

xCELLigence celleproliferationsassay

For real-time overvågning af cellelevedygtighed, vi brugte xCELLigence systemet (ACEA Biosciences, USA). Cellerne blev podet med en tæthed på 2×10

4 /brønd i E-pladen 16 (ACEA Biosciences, USA) indeholdende 100 pi medium per brønd. Når cellerne indtastede logaritmisk fase, den Forbindelserne PS 1 og PS 2 tilsat ved slutkoncentrationer på 0,1-10,0 ug /ml. En slutkoncentration DMSO i brøndene oversteg ikke 1,0% (v /v). Cellerne blev inkuberet med forbindelserne og overvåges i 24 timer ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. Den RTCA software v. 1.2.1 blev anvendt til at beregne halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50) værdier. Alle forsøg blev udført to gange, i tre uafhængige gentagelser.

Trypan blue assay

Cellerne (1×10

5 celler /brønd) blev inkuberet med de testede forbindelser i en koncentration på 1,0 -5.0 pg /ml. Efter 24 timer blev cellelevedygtighed bestemtes under anvendelse af 0,2% (v /v) trypanblåt-opløsning (slutkoncentration) og celletæller (Grevinde Automated Cell Counter, Life Technologies, USA). Forsøgene blev gentaget mindst to gange.

Hoechst farvning for apoptose analyser

apoptotiske virkning af forbindelserne blev analyseret ved anvendelse af den blå fluorescerende Hoechst 33342 farvestof (Life Technologies). HeLa-celler blev podet i 6-brønds plader ved en densitet på 5×10

5 /brønd. Cellerne blev behandlet med forbindelserne PS 1 og PS 2 opløst i DMSO ved en slutkoncentration på 1 ug /ml. DMSO-koncentration oversteg ikke 0,1% (v /v). Efter 24 timer blev cellerne farvet med slutkoncentration på 0,5 ug /ml af farvestoffet i PBS i 25 minutter ved en CO

2 inkubator og derefter observeret under et fluorescensmikroskop (Leica, Schweiz).

DNA-ekstraktion og fragmentering assay

HeLa-celler blev podet ved en densitet på 5×10

6 celler i 100 mm dyrkningsskåle og behandles med forbindelserne i en slutkoncentration på 1,0 ug /ml. Efter 48 timer blev cellerne høstet og lyseret i lysisbuffer (1% NP-40 i 20 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5). Efter cellelyse blev supernatanten opsamlet og behandlet med 1% SDS og RNase A (Sigma-Aldrich) ved en slutkoncentration på 50 ug /ml. Cellerne blev inkuberet i 2 timer ved 56 ° C. Dernæst blev proteinase K (2,5 ug /ml) tilsat til supernatanten, og prøver blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. DNA blev præcipiteret med 3M ammoniumacetat og iskold ethanol ved en slutkoncentration på 70% (v /v). Det opnåede DNA pellet blev opløst i TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) og underkastet elektroforese på 1,5% agarosegel med ethidiumbromid.

Apoptose assay

Induktion af apoptose blev vurderet ved bindingen af ​​annexin V-phycoerythrin /7-amino-actinomycin (PE /7-AAD) til cellulær phosphatidylserin. Cellerne (1×10

5) blev behandlet med de to forbindelser i en koncentration på 0,5-5,0 ug /ml i 24 timer. Disse koncentrationer værdier af saponinerne blev valgt for at vise signifikante ændringer i antallet af de apoptotiske celler. Koncentrationen af ​​DMSO som en kontrolprøve ikke oversteg 0,5% (v /v). Cellerne blev høstet og farvet under anvendelse Muse Annexin V og Dead Cell Assay Kit (Merck Millipore, Tyskland) ifølge protokollen tilvejebragt af producenten. Apoptotiske celler blev derefter analyseret ved Muse Cell Analyzer (Merck Millipore). Forsøgene blev gentaget mindst to gange.

Vurdering af mitokondrisk membranpotentiale

Hela-celler blev podet ved en densitet på 1×10

5 celler /brønd og behandlet med de to forbindelser ved en koncentration på 1,0-10,0 ug /ml. Disse koncentrationer værdier blev valgt til angivelse af mitokondriel dysfunktion i den tidlige fase af cellen behandling. Koncentrationen af ​​DMSO som en kontrolprøve ikke oversteg 1% (v /v). Efter 3 timer af eksponering blev cellerne høstet og fremstillet under anvendelse Muse MitoPotential Kit (Merck Millipore) ifølge med producentens protokol. Procenten af ​​depolariserede /levende celler blev bestemt ved Muse Cell Analyzer. Alle forsøgene blev gentaget mindst to gange.

Real-time PCR

Syntesen af ​​cDNA og real-time PCR-reaktioner blev udført som tidligere beskrevet [20]. Kort beskrevet blev totalt RNA isoleret ved anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Holland) ifølge producentens instruktioner. Koncentrationen af ​​RNA blev målt og cDNA-syntese blev udført under anvendelse Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, USA), ifølge med producentens protokol.

Real-time PCR genekspression arrays.

cDNA opnået fra cellerne behandlet med forbindelserne, samt fra cellerne behandlet med vehikelkontrol, er blevet anvendt på Applied Biosystems TaqMan Array Humant Apoptosis 96-brønds plader (Life Technologies 4.414.072). Hver plade indeholder 88 assays for apoptose forbundet gener og 4 assays for kandidat endogene kontrol gener. PCR-reaktionerne blev indstillet i henhold til fabrikantens anvisninger og udføres på ABI7500 Real Time PCR-system. De resulterende data blev analyseret med ABI 2.05 software baseret på den komparative DCT-metoden [21]. For at validere arrays resultater, vi analyseret uafhængigt (med RT-PCR) alle signifikant ændret transkripter samt gener med upåvirkede niveauer.

Måling af ekspression under anvendelse kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR).

for yderligere at bekræfte ekspressionen af ​​bestemte gener, vi brugte specifikke TaqMan prober (BAX assay id Hs00180269_m1; BCL2 assay id Hs00608023_m1; GAPDH assay id Hs02758991_g1, 18S rRNA assay id Hs99999901_s1, FADD assay id Hs04187499_m1; BID assay id Hs00609632_m1; TNFSF10 assay id Hs00921974_m1; DEDD2 assay id Hs00370206_m1, BAD assay id Hs00188930_m1) og TaqMan One-Step RT-PCR Master MixReagents (Life Technologies) som tidligere beskrevet [22]. De resulterende data blev analyseret med ABI 2.05 software baseret på den komparative relative standardkurve metode [23].

Western blot-analyse

Hela-celler blev behandlet med de to forbindelser PS 1 og PS 2. efter behandling blev cellerne høstet og lyseret i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0). Den samlede proteinkoncentration blev bestemt ved Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, USA). Prøverne blev separeret elektroforetisk hjælp prestained SDS PAGE geler (Bio-Rad Laboratories) og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner. Membranerne blev holdt ved 4 ° C natten over i 3% BCA (Sigma-Aldrich) i PBS /Tween-20 og derefter inkuberet med de primære antistoffer ved en af ​​følgende: p-actin (ab 1801 Abcam, UK), Bud (ab 32060, Abcam), Bcl-2 (ab 59348, Abcam), caspase-8 (sc-81.661, Santa Cruz Biotechnology, USA). Efter vask med PBS /Tween-20 blev membranerne inkuberet med gede-anti-kanin-IgG eller med gede anti-mus IgG HRP konjugerede sekundære antistoffer (Bio-Rad Laboratories). Immundetektion blev udført med en forøget kemiluminescens (ECL) detektion kit (Bio-Rad Laboratories). Protein- mærker blev analyseret ved anvendelse ChemiDoc systemet udstyret med Image Lab software v. 4.1 (Bio-Rad Laboratories).

Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middelværdier ± standardafvigelse (SD) . Statistiske sammenligninger af resultaterne blev evalueret ved brug af t-test.

Resultater

Den saponin forbindelser PS 1 og PS 2 faldt HeLa og HaCaT celler levedygtighed

Effekten af

P

.

quadrifolia

pennogenyl saponiner på levedygtigheden af ​​cellerne blev undersøgt af xCELLigence system, der er baseret på elektronisk impedans måling af sensor elektroder i E-brønde og tillader kontinuerlig, kvantitativ overvågning af celler [24]. Ændringer i celler levedygtighed, antal, morfologi og graden af ​​adhæsion påvirker elektrode impedans som er beskrevet ved en parameter kaldet Cell Index (CI) [25, 26]. CI anvendes til beregning af IC50-værdien i hvert målepunkt af eksperimentet.

HeLa-celler blev behandlet med forbindelserne PS 1 og PS 2 (0,1-10,0 ug /ml) i 24 timer. Systemet får lov at vurdere IC50-værdierne for hver af forbindelserne. Eksponeringen af ​​HeLa-celler til saponinerne resulterede i et signifikant fald i cellelevedygtighed. Efter behandling med forbindelsen PS 1 og PS 2, de opnåede IC50-værdier var 1,11 ± 0,04 ug /ml og 0,87 ± 0,05 ug /ml (tabel 1).

IC50-værdierne fra xCELLigence systemet blev opnået baseret på den sigmoidale dosis-respons formel og beregnet ud fra gentagne forsøg (n = 3). For at bekræfte resultaterne fra xCELLigence systemet, udførte vi MTT-assay under anvendelse af samme koncentrationsområde på de to saponiner (0,1-10,0 ug /ml) i HeLa og HaCaT celler. Cellerne blev behandlet i 24 timer og de registrerede IC50-værdierne for forbindelserne blev opnået ud fra tre uafhængige forsøg (tabel 1).

Det anvendte kontrolprøve DMSO havde ingen inhibering virkning på cellerne. Vores resultater viser, at de to pennogenyl saponiner havde en dosisafhængig og tidsafhængig aktivitet (figur 1 og figur 2). Levedygtigheden af ​​HeLa-celler faldt under inkubationen af ​​cellerne med forbindelserne. Markant ændringer i celler adhæsion blev observeret efter 5 timers behandling af cellerne med saponinerne. levedygtighed for cellerne reduceres også sammen med højere koncentrationer af PS 1 og PS 2.

Cellerne blev inkuberet med pennogenyl saponiner PS 1 (A) og PS 2 (B) i forskellige koncentrationer i 24 timer. De numeriske etiketter på kurverne repræsenterer de stigende koncentrationsværdier af forbindelserne (0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 ug /ml).

IC50-værdierne af saponinerne blev beregnet baseret på dosis-respons-kurver for cellens indekset af xCELLigence systemet. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelserne.

De samme eksperimenter blev udført på ikke-tumor kontrol cellelinie-humane keratinocytter. IC50-værdierne var 1,01 ± 0,01 ug /ml for forbindelsen PS 1 og 0,94 ± 0,04 ug /ml for PS 2 (tabel 1).

Real-time celleanalyse og MTT-assay angivet stærkere cytotoksiske virkning af den saponin PS 2 på de undersøgte celler. Endvidere blev denne effekt bekræftet ved trypan blå-udelukkelse assay.

Virkning af saponiner-induceret celle apoptose

For at bekræfte den apoptotiske virkning af de to pennogenyl forbindelser, HeLa-celler (efter at være blevet behandlet for 24 h) blev farvet med annexin V-PE /7-AAD og analyseret ved Muse analysatoren. Procentdelen af ​​apoptotiske celler steg på en dosisafhængig måde. De samlede apoptotiske satser (den samlede procentdel af tidlige og sene apoptotiske celler) for sammensatte PS 1 var 10,71%, 41,35% og 62,48% for koncentrationer 0,5, 3,0 og 5,0 pg /ml. De apoptotiske for forbindelsen PS 2 var 13,80%, 57,37%, 76,12% for koncentrationer 0,5, 3,0 og 5,0 ug /ml (figur 3).

Cellerne blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af annexin V -PE /7-AAD farvningsfremgangsmåde. Fordelingen af ​​de apoptotiske celler blev bestemt i prøven af ​​ubehandlede celler (A) og efter inkubering af cellerne med 0,5% DMSO (B), forbindelsen PS 1 (CE) og PS 2 (FH) i en koncentration på 0,5, 3,0 og 5,0 ug /ml. Cellerne blev behandlet i 24 timer og det samlede omfang af apoptose (apoptose rate) blev bestemt i sammenligning med DMSO-kontrol (I). Hver prøve blev kørt tredobbelt. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser. Betydelige forskelle i forhold til kontrolgruppen er markeret med en “*” (p 0,05).

For at estimere ændringer i kromatin fordeling i cellerne behandlet med de to forbindelser, vi gjorde visualiseringen af cellulære kerner med Hoechst 33342 farvestof. Efter farvning blev chromatin kondensering og nuklear fragmentering i HeLa-celler observeret i sammenligning med kontrolplanterne celler inkuberet med DMSO (figur 4). Forsøget bekræftede induktion af apoptose i cellerne behandlet med saponinerne.

Nuclear kromatin tilstand blev vurderet med Hoechst 33342-farvning efter udsættelse af cellerne til 1 ug /ml af forbindelsen PS 1 (A) og PS 2 ( B) i 24 timer (koncentrationen værdien relateret til IC50-værdierne for de saponiner). Cellerne behandlet med saponinerne viser kondenseret kromatin i forhold til kontrollen celler inkuberet med 0,1% DMSO (C). Pile repræsenterer apoptotiske celler.

Desuden resultaterne stede i figur 5 viser ubeskadiget DNA i kontrolcellerne mens forbindelser behandlede celler udviste DNA fragmentering karakteristisk for apoptotiske kerner.

Lanes 1 og 1 a repræsenterer DNA fra ubehandlede celler; bane 2, 2a – celler behandlet med 0,1% DMSO (ctrl); bane 3 – celler behandlet med forbindelsen PS 1; Bane 4-celler behandlet med forbindelsen PS 2. Cellerne blev inkuberet med forbindelserne i en koncentration på 1 ug /ml i 48 timer (koncentrationen værdien relateret til IC50-værdierne af forbindelserne). M-DNA-stige (Thermo Scientific).

Den pennogenyl forbindelser PS 1 og PS 2 moduleret mitokondrie membranpotentiale (A ^ m) af HeLa-celler

Tab af mitokondrie indre transmembrane potentiale er en pålidelig indikator for mitokondriel dysfunktion og cellulære sundhed. Denne virkning observeres ofte at være forbundet med de tidlige stadier af apoptose. Efter behandling af HeLa-celler med de undersøgte forbindelser, blev tilstanden af ​​mitochondriemembraner cellernes anslået af Muse-system. Kontrolcellerne udviste høj fluorescens på grund af ophobning af det fluorescerende farvestof inden indre membran af intakte mitochondrier. De celler inkuberet med stigende koncentrationer af saponinerne demonstrerede et fald i fluorescens. Procentdelen af ​​depolariserede /levende celler behandlet med forbindelsen PS 1 var 9,20%, 14,48%, 35,52% for koncentrationer 1,0, 5,0 og 10,0 ug /ml. Værdierne for forbindelsen PS 2 var 8,98%, 35.82%, 47.26% for koncentrationer 1,0, 5,0 og 10,0 ug /ml (Fig 6). De opnåede resultater viser, at mitokondrier spiller en rolle i induktion af apoptose i cellerne behandlet med de to undersøgte saponiner.

blev bestemt efter inkubation af ubehandlede celler (A)

Fordelingen af ​​de celler, som undergår tab af mitokondriepotentiale, cellerne med 1,0% DMSO (B), forbindelsen PS 1 (CE) og PS 2 (FH) i en koncentration på 1,0, 5,0, 10,0 ug /ml. Cellerne blev behandlet i 3 timer og omfanget af mitokondrie celledepolarisering blev bestemt i sammenligning med DMSO-kontrol (I). Hver prøve blev kørt tredobbelt. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser. Betydelige forskelle i forhold til kontrolgruppen er markeret med en “*” (p 0,05).

De to pennogenyl saponiner øget mRNA udtryk for FADD og BID i HeLa-celler

For at bestemme omfanget af de testede forbindelser på apoptotiske veje blev ekspressionen af ​​88 beslægtede gener testet med qPCR (qPCR human apoptose array). Blandt de undersøgte assays fra denne matrix, til yderligere forsøg blev valgt-de to grupper af gener gener, hvis ekspression blev ændret væsentligt og dem med ekspression sammenlignes med kontrollen. At bekræfte resultaterne af PCR arrays, blev real-time kvantitativ PCR brugt. Viser analysen ændringer i mRNA-ekspression af Fas-associeret dødsdomæne (FADD) og BH3 interagerende domæne død agonist (BID) efter behandling med de to saponiner (Fig 7). Derudover mRNA-niveauet af BCL2 associeret X protein (BAX) steg betydeligt i HeLa-celler inkuberet med forbindelsen PS 1 i 24 timer. Som vist i figur 7, mRNA ekspression af død effektordomæne indeholdende 2 (DEDD2), B-celle lymfom protein 2 (BCL2), BCL2 antagonist af celledød (BAD) og tumornekrosefaktor (ligand) superfamilien, element 10 (TNFSF10) var sammenlignelig med kontrol.

cellerne blev stimuleret med forbindelserne PS 1 og PS 2 ved en koncentration på 1,0 og 0,5 ug /ml og inkuberet i 24 timer. MRNA-niveauerne blev målt i realtid PCR-forsøg. Hver prøve blev kørt in duplo, og den relative mængde af mRNA blev normaliseret til 18S rRNA-indhold og udtrykkes som fold-change i forhold til kontrollen (0,1% DMSO). Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser. Betydelige forskelle i forhold til kontrolgruppen er markeret med en “*” (p 0,05).

Virkningerne af saponiner på proteinet ekspressionen af ​​Bcl-2, Bid og procaspase-8

for yderligere at belyse mekanismen af ​​apoptose i HeLa-celler behandlet med forbindelserne, undersøgte vi protein ekspression af Bcl-2, Bid og procaspase-8. Cellerne blev inkuberet med saponinerne i en koncentration på 1 ug /ml og kontrolprøven (0,1% DMSO) i 5 h (tidspunkt hvor ændringerne i protein niveauer var signifikant). Ekspressionen af ​​proteiner blev detekteret ved Western blot.

β

actin blev anvendt som en intern loading kontrol. De opnåede resultater viser, at saponiner behandling faldt proteinniveauet af Bcl-2 (Fig 8A), hvorimod Bid ekspression blev forøget i sammenligning med kontrolprøven (Fig 8B). For at bekræfte den rolle, extrinsicsti apoptose induceret af forbindelserne, blev påvist ændringerne i procaspase-8 ekspressionsniveau. Fig 8C viser det betydelige fald i proteinniveauet i de behandlede HeLa-celler.

HeLa-celler blev inkuberet med forbindelsen PS 1 og PS 2 ved en koncentration på 1,0 ug /ml (koncentrationen værdien relateret til IC50 værdier af de saponiner) i 5 timer, og ekspressionen af ​​proteiner i de behandlede celler blev bestemt ved Western blot analyse. PS 1 og PS 2 faldt Bcl-2 (A) og procaspase-8 (55 kDa) (C) proteinniveauer og øget Bud (B) proteinekspression i cellerne. Forsøgene blev gentaget tre gange, og hver proteinniveau var relateret til 0,1% DMSO kontrolprøve. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelser. Betydelige forskelle i forhold til kontrolgruppen er markeret med en “*” (p 0,05).

Diskussion

Paris

jordstængler har længe været brugt af kinesere som et middel mod blødning, mikrobiel infektion og inflammation [27, 28]. Desuden har jordstængler været almindeligt anvendt i forebyggelse og terapi af kræft i traditionel medicin [29]. De mange undersøgelser har vist, at de uddrag fra

Paris

arter og deres vigtigste aktive komponenter-steroide saponiner besidder antitumor egenskaber mod forskellige cellelinjer [11, 19, 29-34]. Det er dog kun få papirer, som forsøger at undersøge mekanismerne for cytotoksiske virkning af pennogenyl saponiner, er hidtil publiceret [11, 14, 19].

I denne undersøgelse undersøgte vi effekten af ​​de to

P

.

quadrifolia

pennogenyl saponiner på menneskers livmoderhalskræft cellelinie HeLa. De testede forbindelser udviste signifikant antiproliferativ aktivitet mod de humane celler. De opnåede i eksperimentet med RTCA systemet resultater viser, at både saponiner demonstrerer en dosisafhængig og tidsafhængig hæmmende virkning på proliferation af HeLa-celler. Forbindelsen PS 2 har lidt stærkere aktivitet end PS 1, som kan være forårsaget af forskelle i molekylet strukturer saponiner (én yderligere rhamnose rest i PS 2 sukkerkæde. Figur 9). Analyserne af forholdet mellem bioaktiviteten af ​​saponiner og kemiske struktur indikerer, at en sukkerdel spiller en rolle i aktiviteten af ​​steroid molekyle [32, 35, 36]. Saponiner med samme steroide del har forskellige anticancervirkning. Forbindelser med flere sukkerdele har stærkere aktivitet mod celler [12].

De forsøg udført for at bestemme form for celledød viser, at de to pennogenyl saponiner induceret apoptose. Apoptose er karakteriseret ved typiske morfologiske og biokemiske kendetegn, herunder celle krympning, nuklear DNA-fragmentering og membranblæredannelse [37]. blev observeret Alle disse ændringer i celler inkuberet med de to testede pennogenyl saponiner. Analysen af ​​cellerne behandlet med forbindelserne og farvet med det fluorescerende farvestof viser nuklear fragmentering og dannelse af kondenserede kerner. Vore data opnået i forsøget med elektroforetisk adskillelse af ekstraheret DNA fra de behandlede celler understøtter disse observationer.

Tidlig kendetegn for apoptose er tabet af plasmamembranen asymmetri hvor molekyler af phosphatidylserin translokeres fra den indre til den ydre overflade af cellemembranen, således at en afhængig phospholipid-bindende protein (annexin V) kunne let binde dem [38-40]. I vores undersøgelse observerede vi signifikant stigning i populationen antal apoptotiske HeLa-celler inkuberet med de undersøgte saponiner og denne virkning udviste en dosisafhængig mønster.

De vigtigste veje inducere apoptose er den ydre død receptor pathway og iboende mitokondrier pathway [41-43]. De ydre signalveje er relateret til membranen dødsreceptorer der hører til tumornekrosefaktor (TNF) -receptor-gen superfamilien [44, 45]. Til dato er det fedtsyresyntetase ligand /receptor (FasL /FasR) og TNF-α /TNFR1 modeller bedst karakteriseres dem. Sammenkoblingen af ​​FasL til fasr resultater i induktion af apoptose i sensitive celler gennem rekruttering af adapter molekylær FADD og en FADD-associeret procaspase-8 til døden receptoren [45-49]. En død inducerende signaleringskompleks DISC former, hvilket fører til celledød [50]. Vore data viser, at de to pennogenyl forbindelserne signifikant forøget mRNA-ekspression af FADD i de behandlede celler. Derudover forbindelsen PS 1 og PS 2 induceret caspase-8, som vist via forøget af procaspase-8 forarbejdning i forbindelserne behandlede HeLa-celler. Aktiveringen af ​​caspase-8 genereret på DISC er undertiden utilstrækkelig til at generere en caspase signaleringskaskade stærk nok til udførelse af celledød. I dette tilfælde signalet kræver forstærkning via mitochondrier-afhængig apoptotiske veje [51]. Det protein, der forbinder caspase signaleringskaskade og mitokondrier er Bcl-2 familiemedlem Bid. Den aktiverede form af Bud (tBid) translokaliserer til mitokondrier, hvor det fungerer med de proapoptotiske proteiner Bax og Bak at indlede frigivelsen af ​​proapoptotiske faktorer fra mitokondrierne [52]. I vores undersøgelse observerede vi stor stigning i BID-mRNA og proteinekspression i HeLa-celler inkuberet med de testede forbindelser. Interessant mRNA ekspression af BAX var meget højere for de PS 1-behandlede celler.

Virkningen af ​​bud og Bax modvirkes af den antiapoptotisk Bcl-2-familien element, såsom Bcl-2, som kan inhibere mitochondriske proapoptotiske begivenheder [53]. Bcl-2-familien af ​​proteiner påvirkninger af mitochondriemembranpermeabilitet [41, 45, 53] og deltager i dannelsen af ​​porer i membranen. Permeabilitet overgang (PT) altid efterfølges af afbrydelse af mitokondrie indre transmembranpotentialeændring A ^ m [54, 55]. Tab af potentialet er ofte observeret at være forbundet med de tidlige stadier af apoptose [56-58]. Vores analyse viser, at Bcl-2-protein-ekspression faldt i cellerne behandlet i begge forbindelserne.

Desuden er vores forsøg viser, at de to pennogenyl saponiner depolariseret membranpotentialet signifikant i HeLa-celler på en dosis-afhængig måde . Dette bekræfter involveringen af ​​den iboende mitokondrier pathway i cellen apoptose.

I denne undersøgelse har vi analyseret mekanismerne for antitumor virkning af de to saponiner og konkluderer, at både den ydre død receptor pathway og indre vej spiller en rolle i den apoptotiske virkning af forbindelserne i HeLa-celler. De særlige signalveje i cellen død kræver yderligere undersøgelser, især da de to pennogenyl komponenter isoleret fra

P

.

quadrifolia

jordstængler kunne være en potentiel lægemiddel i behandlingen af ​​menneskets livmoderhalskræft.