PLoS ONE: Dissocierede primære humane prostatacancerceller coinjiceret med udødeliggjort HS5 knoglemarvsstromaceller Generer Udifferentieret tumorer i NOD /SCID-γ mus

Abstrakt

Rekonstituering af tumor udvikling i immundefekte mus fra disaggregerede primære humane tumorceller er altid udfordrende. Det vigtigste mål med dette studie er at etablere et pålideligt assay system, der ville tillade os at reproducerbart rekonstruere menneskelige prostata tumor regenerering i mus ved hjælp af patientens tumor-afledte enkeltceller. Brug mange af 114 ubehandlede primære humane prostatacancer (HPCa) prøver vi har arbejdet på, her viser vi, at: 1) subcutaneum repræsenterer det mest følsomme sted, der tillader podning af de implanterede HPCa stykker; 2) primære HPCa celler i sig selv ikke regenerere tumorer i immundeficiente værter; 3), når co-injiceret i Matrigel med rUGM (rotte urogenital sinus mesenkym), CAF (carcinoma-associerede fibroblaster), eller HS5 (udødeliggjort knoglemarv afledte stromale) celler, primære HPCa celler undlader at indlede serielt transplanterbare tumorer i NOD /SCID-mus; og 4) dog HPCa celler co-injiceret med HS5 celler i mere immundefekte NOD /SCID-IL2Rγ

– /- (NSG) mus let regenerere serielt transplanterbare tumorer. Den HPCa /HS5 rekonstitueret prostata ‘tumorer fremlægge en samlet epitelial morfologi, er af den human oprindelse, og indeholder celler er positive for AR, Ck8, og racemase. Cytogenetisk analyse giver yderligere bevis for tilstedeværelsen af ​​karyotypiske abnorme HPCa celler i HPCa /HS5 tumorer. Af betydning, HPCa /HS5 xenotransplantattumorer indeholder EpCAM

+ celler, der er både klonogene og tumorigene. Overraskende, alle HPCa /HS5 rekonstituerede tumorer er udifferentierede, selv for HPCa celler afledt fra Gleason 7 tumorer. Vores resultater viser, at primære HPCa celler co-injiceret med udødeliggjort HS5 stromaceller generere udifferentierede tumorer i NSG mus og vi giver bevis for, at ikke-differentierede HPCa celler kan være

de

celler, der besad tumorigent potentiale og regenererede HPCa /HS5 xenotransplantattumorer.

Henvisning: Chen X, Liu B, Li Q, Honorio S, Liu X, Liu C, et al. (2013) Dissocierede primære humane prostatacancerceller coinjiceret med udødeliggjort HS5 knoglemarvsstromaceller Generer Udifferentieret tumorer i NOD /SCID-γ mus. PLoS ONE 8 (2): e56903. doi: 10,1371 /journal.pone.0056903

Redaktør: Amit Singh, University of Dayton, USA

Modtaget: 30 oktober, 2012; Accepteret: 15 januar 2013; Publiceret: 22 feb 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra NIH (R01-CA155693-01A), Department of Defense (W81XWH-11-1-0331), CPRIT finansiering (RP120380), og MD Anderson Cancer center center for Cancer Epigenetik og Laura og John Arnold Foundation RNA center pilot tilskud (til DGT) og af to center tilskud (CCSG-5 P30 CA016672-34 og ES007784). XC blev støttet af Cockrell fellowship fra Institut for Molekylær Carcinogenese, M.D. Anderson Cancer Center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Den tilsvarende forfatter, Dr. Dean Tang, er i øjeblikket en akademisk Editor for PLoS ONE og at medforfatter Dr. Dean Tang er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den førende malignitet med anslået ~241,740 nye tilfælde og ~ 28,170 dødsfald i USA i 2012 [1]. Ætiologien for PCa stadig gådefulde og cellerne-of-oprindelsesbetegnelser for kastrationsresistent PCa (dvs. CRPC), den dødelige sygdom, der dræber de fleste patienter forbliver dårligt defineret. Menneskelige kræftformer huser en bestand af stamceller-lignende cancerceller operationelt betegnes cancer stamceller (CSCS), som menes at være ansvarlig for tumor initiering, promotion, progression, metastase, og behandling modstand [2]. Arbejde fra vores laboratorium og mange andres antyder, at human PCa også indeholder stamceller-lignende cancerceller [3] – [32]. Ligesom CSCS i andre tumorer [33], prostata CSCS er heterogen med mange delmængder med tydelig tumor-regenererende kapacitet. Af note, prostata CSCS rapporteret af flere grupper er mindre differentieret udtrykke lidt /ingen AR (androgen receptor) og PSA (prostataspecifikt antigen). For nylig, ved hjælp af en PSA-promotor-drevet GFP lentiviral reporter, har vi oprenset ud differentieret (PSA

+) og udifferentierede (PSA

– /lo) PCA celler til genekspression profilering og funktionelle undersøgelser og fandt, at PSA

– /lo cellepopulation huser langsigtede tumor-formerings celler, der modstår til kastration [25]. Vores undersøgelse tyder på, at den udifferentierede PSA

– /lo PCa cellepopulation sandsynligvis repræsenterer en præ-eksisterende celle-of-oprindelse for CRPC [25]

En KEY ubesvarede spørgsmål er, om lignende stilk-lignende PCa. celler med forbedrede tumor-formerings egenskaber også findes i primære humane PCa (HPCa) prøver. Grunden til, at dette vigtige spørgsmål har udtværet et endeligt svar ligger i det faktum, at vi har endnu til at etablere en pålidelig analysesystem, der reproducerbart af og tro mod kan rekonstruere tumor regenerering fra dissocierede HPCa enkelte celler [14]. Mest anvendte PCA modeller er afledt af enten genetisk modificerede mus, hvor specifikke gener overeksprimeres eller slået ud eller fra xenotransplantater ved anvendelse af humane cancercellelinier eller tumorstykker inokuleret orthotopisk eller ektopisk ind i immundefekte mus [34]. Af mange grunde, musemodeller af PCa besidder histopatologiske karakteristika, som ikke er helt repræsentative for menneskelig PCa, der er ofte kendetegnet ved flere genetiske ændringer, der ligger uden evne eventuelle gensplejsede modeller kan rekapitulere. Endvidere kan en specifik genetisk mutation resulterer i distinkte biologiske og histologiske fænotyper hos dyr versus i human [35]. I modsætning hertil er xenograftmodeller bredt undersøgt til brugervenlighed. De er af humane oprindelser, og derfor menes at bedre rekapitulere humane tumorer i forhold til de histopatologiske og molekylære egenskaber [34]

Adskillige udbredte PCA xenotransplantater, såsom LAPC og LuCaP serien [36] -. [ ,,,0],38], er blevet etableret ved at implantere humane prostata tumor stykker i mus. PCA xenografter kan også skabes ved at injicere etablerede PCA cellelinjer, såsom PC3, DU145, og LNCaP [39]. På grund af den velkendte kendsgerning, at lokaliseret PCA eller PCA-celler sjældent danne tumorer i immundefekte mus [39], de ovennævnte eksempler på xenotransplantater eller cellelinier blev alle etableret fra metastaser, og de udgør kun en minoritet af kirurgisk fjernet humant PCa og ikke helt afspejler heterogeniteten af ​​sygdommen [40]. For nylig er der blevet gjort en indsats for at generere PCA xenografter ved podning lokaliserede PCA stykker [41], [42] eller primære PCA celler rekombineret med neonatal mus mesenkym [43] i den renale kapsel. De regenererede xenotransplantater synes at ligne, histopatologisk de donor patient tumorer, men om de kunne være seriel passage er ukendt.

Det vigtigste mål for vores nuværende projekt er at etablere et pålideligt assay system, der ville tillade os at reproducerbar og trofast rekonstituering human prostata tumor regenerering i mus under anvendelse patientens tumorafledte HPCa enkeltceller. Vi har tidligere lavet nogle bestræbelser i retning af dette mål, men de fleste af vores rekonstitution protokoller helt undladt at regenerere tumorer [14]. Her, har vi udnyttet mange af de 114 ubehandlede prostatektomi prøver, der spænder fra Gleason score (GS) 6 til 10, til fremstilling af enkelt epitelcancerceller, som derefter blev rekombineret med forskellige stromale celler, herunder rUGM, carcinoma-associerede fibroblaster (cafeer), eller udødeliggjort knoglemarv-afledte stromale celler (HS5) og implanteret på forskellige anatomiske steder i enten NOD /SCID eller NOD /SCID-IL2Rγ

– /- (NSG) mus. Nedenfor præsenterer vi resultaterne af vores omfattende undersøgelser.

Materialer og metoder

Alle dyrerelaterede undersøgelser i dette projekt er blevet godkendt af MD Anderson Cancer Center IACUC (Institutional Animal Care og brug Udvalg ; ACUF # 08-05-08132). Den aktuelle forskning indebærer ikke mennesker (dvs. levende enkeltpersoner eller identificerbare private oplysninger), selv om det indebærer primære HPCa prøver fra vores samarbejder klinikere under dækningen af ​​IRB (Institutional Review Board) Protokol nummer LAB04-0498. Alle andre undersøgelser præsenteret heri var den investigator-initieret og ikke kræver godkendelse fra andre tilsynsmyndigheder.

Celler, reagenser og Dyr

PC3, DU145, blev opnået LNCaP og Swiss 3T3-celler fra ATCC. Den HS5 cellelinje, som blev genereret fra human knoglemarv og udødeliggjort af transduktion med human papilloma virus E6 /7 gener [44], blev venligst leveret af Dr. M. Andreeff (M.D Anderson Cancer Center). Carcinom forbundet fibroblaster (CAF) blev fremstillet som tidligere beskrevet [45]. Alle celler blev dyrket i anbefalede medier indeholdende 7% varmeinaktiveret FBS, 100 pg /ml streptomycin og 200 U /ml penicillin (Gibco). Testosteron blev købt fra Sigma. TrpC xenograft linje blev tilvejebragt af Dr. Palapattu [46]. Immunsvækkede mus (NOD /SCID, NSG, rag2;. Se ref 14 om egenskaberne af disse animalske stammer) blev oprindeligt indkøbt fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og ynglende kolonier blev etableret i vores dyr facilitet og vedligeholdes i standard betingelser i henhold til de institutionelle retningslinier. Antistoffer anvendt i denne undersøgelse er vist i tabel S1.

Histologisk og immunhistokemisk (IHC) Analyser Salg

tumorvæv høstet fra patientens tumorer og rekonstituerede xenotransplantater blev fikseret i 10% neutral bufret formalin i 24 timer efterfulgt af 70% ethanol og indlejring i paraffin. Sektioner (4 um) blev skåret og farvet med hematoxylin og eosin (HE). For IHC blev snit afparaffineret og hydreret og endogen peroxidaseaktivitet blokeredes med 3% H

2O

2 i vand i 10 minutter. Antigen genfinding blev udført med 10 mM citratpuffer (pH 6,0) i 10 minutter i en mikrobølgeovn efterfulgt af en 20-min køle ned og grundig vask. Objektglas blev inkuberet med Biocare Blocking Reagent (# BS966M med casein i bufferen) i 10 minutter for at blokere ikke-specifik binding. Objektglas blev inkuberet med forskellige primære antistoffer i 30 minutter ved stuetemperatur og vasket i phosphatpuffer to gange og derefter inkuberet i biotinyleret gede-anti-kanin eller muse IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ved en 1:500 fortynding i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter grundig vask blev de inkuberet med SA-HRP (Biogenex, San Ramon, CA) i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af vask. Endelig blev disse slides inkuberes med Biogenex DAB substrat (farve udvikling nøje overvåges under et mikroskop) og let modfarvet med hæmatoxylin. Billeder blev taget med et MagnaFire kamera, og det hele mount slides blev scannet ved hjælp af et Aperio ImageScope system.

Aperio-assisteret morfometrisk analyse

HE eller IHC farvede objektglas indeholder patient eller xenotransplantattumorer var scannet ved hjælp af Aperio ScanScope imaging platform (Aperio Technologies, Vista, CA, USA) med en 20 × mål på en rumlig sampling periode på 0,47

μ

m per pixel. Hele dias billeder blev set og analyseret ved hjælp af stationære pc’er udstyret med den gratis ScanScope software.

Rensning af tumorceller fra primære Patient Prøver og xenotransplantattumorer

Grundlæggende procedurer er for nylig blevet beskrevet [14 ]. Primære PCA prøver blev opnået ved radikal prostatektomi med patienternes samtykke i henhold til de MDACC Institutional Review Board retningslinjer (IRB LAB04-0498). Ingen af ​​patienterne modtog nogen behandling før operation.

For patientprøver

, tumorvæv frisk opnået fra prostatektomi blev hakket i ~ 1 mm

3 stykker og væv udsættes for enzymatisk fordøjelse (type I collagenase plus DNase ved 50 U /ml) for 8-10 timer ved 37 ° C. Efter fordøjelse, er epitelceller organoids beriget med en kort centrifugering efterfulgt af trypsin fordøjelse (0,05%, Gibco) på en rocker ved 37 ° C i 15-30 min for at frigive epitelceller.

For xenotransplantater

, blev tumorvæv inkuberet med 1 × Accumax (1200-2000 U /ml proteolytisk aktivitet indeholdende collagenase og DNase; Innovative Cell Technologies, Inc.) ved 10 ml per gram væv i 30 minutter ved stuetemperatur under roterende betingelser. Single-cellesuspension blev opnået ved filtrering af supernatanten gennem et forud befugtet 40-um cellefilter og cellesuspensionen blev derefter forsigtigt påført på et lag af Histopaque-1077 (Sigma) gradient oprensningstrin for at fjerne hovedparten af ​​røde blodlegemer, dødt celler og rester. Endelig blev den resulterende celle blandingen underkastet en MACS afstamning celle depletion kit (Miltenyi Biotec) og cocktail (anti-CD3, 14, 16, 19, 20, 45, 56, og 140b for patientens tumorer; H2K

d for xenotransplantater) for at fjerne Lin

+ -celler, herunder hæmatopoietiske, endotel- og andre stromale celler (glat muskulatur, myoepithelial, fibroblast osv) for patientprøver eller muse stromaceller til xenotransplantattumorer henholdsvis.

tumortransplantation Eksperimenter

Oprenset PCA celler (ovenfor), enten alene eller i kombination med hjælpeceller herunder rUGM, CAF, eller HS5 celler, implanteres enten subkutant (sc) eller under nyrekapslen (KC) af svækket immunforsvar mus. Alternativt blev stykker eller fragmenter af HPCa podet subkutant, under KC, eller i muse anterior prostata (AP). Grundlæggende procedurer for disse transplantationer er tidligere blevet beskrevet [14]. Kort beskrevet

til s.c. implantationer

, tumorceller blev injiceret i 40 pi medium indeholdende 50% Matrigel, subkutant i 6-8 uger gamle hanmus suppleret med exogent testosteron.

For KC transplantationer

blev PCA celler blandet med 250.000 rUGM celler og væv rekombinanter blev foretaget i rotte-hale collagen og inkuberet natten over. De væv rekombinanter blev transplanteret næste morgen under den renale kapsel modtagende hanmus suppleret med testosteron pellets.

For AP podning

, små stykker af HPCa væv blev direkte implanteret. I nogle tilfælde blev HPCa celler ved forskellige numre først blandet med rotte-collagen og inkuberet i en vævsdyrkningsplade ved 37 ° C i 10-15 min. Så det størknede cellepellets blev forsigtigt dækket i medium og dyrket i 4 timer til natten over før implantation. En tværgående indsnit i underlivet for at blotlægge AP ved delvist at trække i blæren, sædblærer og prostata ud af bughulen. En 2-3 mm snit blev lavet i AP gennem tubulus mellem de to hovedkanaler ved hjælp af en 22-gauge kanyle. Ved hjælp af en brand-afrundet glas pipettespids blev kollagen prikker indsat i en lomme dannes under prostata tubulus. Derefter organer blev udskiftet og kropsvæggen og huden lukket.

I alle ovennævnte eksperimenter, tumorudvikling blev overvåget startende fra den anden uge. Tumorigenicitet blev målt hovedsagelig ved tumorincidensen (dvs. antallet af tumorer /antal injektioner), latenstid (dvs. tid fra injektion til detektering af tydelige tumorer), tumorvolumen, og endpoint tumorvægt.

Western Blotting

Helcellelysater blev fremstillet i komplet RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,5% Triton X-100, 10 mM EDTA) indeholdende proteasehæmmer blanding. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved MicroBCA kit (Pierce). Forskellige mængder af proteiner blev påsat en 15% SDS-PAGE. Western blotting blev udført som standard anvendelse af ECL Plus (PerkinElmer).

Reverse Transcription (RT) -PCR Analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra tumorstykker eller dyrkede cancerceller under anvendelse af Trizol (Invitrogen), og anvendt i RT-PCR-analyse. PCR-primerne indeholdt humant AR (sense: 5′-GCTAAAGACTCGGAGGAAGCAAG-3 ‘; antisense: 5′-TGGGGGAAAACAGAGGGTTC-3′); PSA (sense: 5’-TGGGAGTGCGAGAAGCATTC-3 ‘; antisense: 5′-GCTGTGGCTGACCTGAAATACC-3′); β-actin (forstand: 5’-CTGGCACCACACCTTCTACAATG-3 ‘; antisense: 5’AATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’)

Karyotyping og Genomisk ustabilitet

Celler blev udsat for Colcemid (0,04

μ

g /ml) i 25 min ved 37 ° C og derpå til en hypotonisk opløsning (0,075 M KCI) i 20 minutter ved stuetemperatur. Celler blev fikseret i en methanol og eddikesyre (03:01 efter volumen) blanding i 15 minutter, og vasket tre gange i fiksativ. Objektglassene blev lufttørret, optimalt alderen, og G-banded anvendelse af trypsin-opløsning og farvet i Giemsa efter rutineprocedure. Billeder blev taget med et Nikon 80i mikroskop udstyret med karyotypering software fra Applied Spectral Imaging (ASI) Inc. (Vista, CA). og mindst 15 G-banded metafaser blev karyotyped.

Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og oprensning af EpCAM

+ -celler

HPCa /HS5 xenotransplantattumorer celler blev behandlet med FcR blokerende middel (Miltenyi Biotec) i 10-15 minutter ved 4 ° C og farvet med PerCP-eFluor 710 konjugeret anti-EpCAM-antistof og biotinyleret muse H-2K

d-antistof i 30 minutter ved 4 ° C. Celler blev derefter vasket med PBS og mærket med Alexa Fluor 405-konjugeret streptavidin (Invitrogen, S-32351) i 10 minutter ved 4 ° C. EpCAM

+ og EpCAM

– celler blev yderligere oprenset under anvendelse af FACS [21], [25]. Post-analyse viste renheder på begge populationer bliver . 98%

Sphere Formation Analyser

Grundlæggende procedurer for sfære dannelse analyser blev tidligere beskrevne [21], [25]. Vi oprensede EpCAM

+ -celler fra HPCa /HS5 xenotransplantattumorer via MACS og dyrket dem op i serumfrit prostata epitelial basalmedium (PrEBM) indeholdende B27 (Invitrogen), 20 ng /ml EGF og bFGF i Purecol (Advanced biomatrix, # 5005-B) overtrukket T-25 kolber. Når disse celler blev konfluerende, vi høstede cellerne via 0,05% trypsin /EDTA og udpladet de enkelte celler i 6-brønds plader ved ULA densiteten af ​​5.000-10.000 celler /brønd. Sfærer blev scoret i ca. 2 uger. For serielle kugle-formation analyser blev de første generation kugler høstet med 0,025% trypsin /EDTA, findelt med en 27-G kanyle, filtreret gennem en 40-um si, og genudplades som ovenfor. Denne proces blev gentaget i op til 3-4 generationer.

Statistik Analyse

tumorfremkaldende celle frekvenser blev sammenlignet under anvendelse likelihood ratio test. Forskelle i tumor-take rate blev bestemt af Andel testen. Statistisk signifikans blev defineret som

P

. 0,05

Resultater

HPCa Piece xenotransplantater Show Højere Tumor Tager på subkutan site end på andre websteder

Vores lab har hidtil arbejdet på 114 patientprøver frisk opnået fra prostatektomi. Nogle af disse prøver er blevet anvendt i tidligere undersøgelser [13], [14], [21], [22], [25], [31] og de fleste af dem blev anvendt i det aktuelle projekt (tabel S2). Af de 114 HPCa prøverne, havde 15,8% kombineret Gleason Score (GS) 6, 52,6% GS7, 11,4% GS8, og 20,2% GS9. Generelt blev HPCa prøver anvendes i 2 typer af eksperimenter:. Enten transplanteret, som små stykker, hos mandlige immunsvækkede mus til at generere xenotransplantater eller anvendes frisk isolerede enkeltceller til in vitro og in vivo studier (. Figur 1)

For xenografundersøgelser, vi implanterede tumor stykker (~2-3 mm

3) på tre forskellige anatomiske steder [14], dvs., underhud (SC) nyre kapsel (KC), eller forreste prostata (AP) i en af ​​de tre nedsat immunforsvar musestammer, dvs. NOD /SCID, rag2

– /-, eller NOD /SCID-IL2Rγ

– /- (NSG) mus. NOD /SCID-mus mangler både T og B-celler og har funktionelle underskud (dog ikke fuldstændig mangel) i NK-celler og rag2

– /- mus mangler også T og B-celler mens NSG mus er den mest immundefekte mangler T, B , og NK-celler [14], [47]. Som opsummeret i tabel 1 og beskrevet i detaljer i tabel S3, i hver stamme af mus og med hver kvalitet af HPCa viste s.c implantater højeste tumor tage sammenlignet med KC og AP xenotransplantater. Endvidere i NOD /SCID-mus, som blev anvendt oftest observerede vi øge tumor tager med stigende tumorklassificering ved s.c. og KC sites (tabel 1. Tabel S3). Interessant nok blev den tumorklassificering-associeret forøgelse af tumoroptagelse ikke observeret i rag2 og NSG mus, og HPCa prøver xenotransplanted i NSG mus udviste ikke en stigning i tumor tager sammenlignet med dem implanteret i NOD /SCID-mus (tabel 1. Tabel S3 )

HPCa Celler, modsætning HPCa Pieces, kunne ikke Re-indlede Tumorer i NOD /SCID mus:. ingen signifikante virkninger med rUGM, CAF, og udødeliggjort Human (knoglemarv) Stromale (HS5) Celler

Efterfølgende spurgte vi, om frisk isolerede HPCa celler, snarere end tumorstykker, kunne også regenerere tumorer i nogen af ​​immunsvækkede mus. I begyndelsen, vi rekombineret HPCa celler med rUGM for KC transplantationer [48] – [50] eller blandes de HPCa celler i 50% Matrigel for s.c injektioner i mandlige NOD /SCID-mus [14]. I tre GS6 HPCa (HPCa9, 10, og 16) prøver, når 10.000 til 100.000 HPCa celler rekombineret med rUGM blev implanteret under KC, observerede vi 0/30 udvækst (se tabel 4 i ref. 14). Tilsvarende i to GS7 HPCa (HPCa11 og 14) prøver, når 10.000 til 200.000 HPCa celler rekombineret med rUGM blev implanteret under KC, observerede vi 0/17 udvækst (tabel 4 i ref. 14). Endelig, når 1 million af HPCa18 (GS7) celler blev injiceret subkutant i 50% Matrigel, var der ingen enkelt tumor ud af 4 injektioner (tabel 4;. Ref 14). Vi derefter renset CD44

+, CD133

+ eller CD44

+ CD133

+ (og tilsvarende markør-negative) HPCa celler fra 4 GS6 tumorer (HPCa 9, 10, 13, og 16), 4 GS7 tumorer (HPCa4, 6, 8, og 12), og 1 GS9 tumor (HPCa42) og implanteres stigende antal celler (fra 1000 til 2 millioner) subkutant (for GS9 HPCa celler) eller i KC eller AP (for resten) af de mandlige NOD /SCID-mus, og vi observerede 0/225 udvækster (tabel 6 i ref. 14). Vi renset også CD44

+ /CD44

– HPCa celler fra 3 GS8 (HPCa25, 32 og 33) og en GS9 (HPCa24) primær (1 °) implanteret og implanteret 1000 til 500.000 celler i 50% Matrigel på den mest følsomme sted, dvs. underhuden hos mandlige NOD /SCID-mus. Igen, vi ikke observere nogen svulst regenerering ud af 52 implantationer (tabel 6 i ref. 14). Endelig, når usorterede HPCa celler oprenset fra 3 GS6 tumorer (HPCa2, 10 og 16), 4 GS7 tumorer (HPCa3, 11, 14, og 18), 2 GS8 tumorer (HPCa15 og 37), og 2 GS9 tumorer (HPCa5 og 21), enten injiceres subkutant alene i Matrigel eller rekombineret med rUGM og derefter transplanteres under KC, gav anledning til 0/92 tumorer (tabel 7 i ref. 14). I alle disse transplantation eksperimenter blev de mandlige NOD /SCID-mus suppleret med eksogene testosteron pellets.

Dernæst vi co-injicerede usorterede eller markør-sorteres HPCa celler med CAF, som er blevet rapporteret til at fremme tumor udvikling nogle eksperimentelle systemer [51], enten subkutant eller under KC af testosteron-suppleret mandlige NOD /SCID-mus. Vi observerede 3 udvækster ud af i alt 56 injektioner (Tabel S4). Alligevel de 3 udvækster var ikke serielt transplanterbar (tabel S4).

For nylig har human knoglemarv afledte mesenchymal stromale (eller stammer) celler (MSC’er) blevet vist at integrere i det tumor-associerede stroma og fremme bryst cancercelle metastase [52]. Vi spekulerede på, om MSC kunne lette tumor rekonstituering af primære HPCa celler. Den HS5 cellelinie, frembragt fra human knoglemarv blev udødeliggjort af transduktion med human papillomavirus E6 /7-gener [44], og har vist sig at understøtte proliferation af PCA-celler i kulturer [53], [54]. Vi dermed subkutant coinjiceret usorterede eller markør-sorteres (dvs. CD44) HPCa celler (fra 2 GS6, 3 GS7, 4 GS8, og 1 GS9 tumorer) med 100.000 HS5 celler i NOD /SCID-mus. Vi observerede 4 tumorer i alt 54 injektioner (tabel S5). Igen, de 4 regenererede tumorer kunne ikke serielt transplanteret (ikke vist). HS5 celler alene ikke generere tumorer i NOD /SCID-mus ved ≤ 100.000 celler (data ikke vist).

Tilsammen vores forudgående (ref. 14, tabel 4, 6 og 7) og strøm (tabel S4 og S5) undersøgelser viser, at

NOD /SCID-mus er ikke eftergivende til rekonstituering transplanterbare tumorer fra primære HPCa celler, selv ved tilstedeværelse af rUGM, CAF, eller MSC såsom HS5

.

HS5 Celler Fremkald HPCa Cells Igangsætte transplanterbare tumorer i NSG mus

Hvad nu hvis vi udnytter flere immundefekte NSG mus? Vi først injiceres frisk renset primære HPCa celler fra 5 patient tumorer (2 GS7, en GS8, 2 GS9) subkutant i NSG-mus. I alt 37 injektioner, vi ikke observere nogen tumorvækst efter 8 måneder (tabel 2). Da HS5 celler let øget tumor revitalisering af HPCa celler i NOD /SCID-mus (tabel S5), subkutant vi coinjiceret usorterede HPCa celler fra 9 patientprøver med HS5 celler i NSG mus og bemærkelsesværdigt, denne modificerede ‘rekombination protokol «induceret tumor dannelse i 41/59 (dvs. -70%) injektioner (tabel 3). HPCa celler afledt fra 3 GS9, 1 GS8, og 4 GS7 tumorer alle regenereret tumorer når co-injiceret med HS5 celler (tabel 3). Vi har også etableret 1 ° xenografter i rag2 mus fra stykker af 3 andre HPCa prøver (dvs. HPCa57, 58, og 70). Når de 1 ° xenograft celler blev renset ud og co-injiceret med HS5 celler i mandlige rag2 eller NSG mus, vi let opnået de 2 ° xenografter [21, 25; data ikke vist]. I alt har vi etableret 11 HPCa /HS5 xenografter fra 7 GS7 (HPCa57, 58, 70, 83, 84, 85, og 92), en GS8 (HPCa91), og 3 GS9 (HPCa80, 87, og 96) tumorer. Disse resultater tyder på, at HS5 celler yderst effektivt fremme tumor regenerering i NSG mus fra friske HPCa celler.

rekonstitueret

tumorer var meget tumorgene og kunne passeres på ubestemt tid (tabel S6, data ikke vist). Også de regenererede tumorer kunne give anledning til transplanterbare tumorer uafhængig af HS5 celler (Tabel S6). Desuden usorteret eller CD44-sorteret (både CD44

+ og CD44

-) HPCa celler var i stand til at re-initiere tumorer både subkutant og i den dorsale prostata (DP) og, signifikant, HPCa celler oprenset fra xenotransplantater oprindeligt etableret i NSG mus kunne regenerere tumorer i NOD /SCID-mus (tabel S6, data ikke vist)

Rekonstituerede “Prostata” tumorer er af den menneskelig oprindelse og Præsentere en udifferentieret og epithelmorfologi:. IHC, Biokemisk, og Molekylær karakterisering

Vi først udført histologiske og IHC karakterisering af de rekonstituerede tumorer. Som forventet HPCa57 patient tumor udviste typiske GS7 histologi med overfyldte tumor kirtler, hvor de fleste celler farvet positive for prostata luminal epitelcelle markører PSA, nuklear AR, og cytokeratin 8 (Ck8) (fig. 2A). Samtidig udviste tumor kirtler positiv farvning for racemase (alfa-methylacyl-CoA racemase, også kendt som AMACR eller P504S, der kodes af

AMACR

gen), negativ (eller svagt positiv) farvning for CK5 (en prostata basal epithelial markør), og negativ farvning for P63 (en anden basal cellemarkør) (fig. 2A). De HPCa57 /HS5 rekonstituerede tumorer i NSG mus optrådte helt udifferentieret og manglede kirtelstrukturer og PSA-ekspression (fig. 2B). Cellerne kiggede samlede epitel, som understøttes af tilstedeværelsen af ​​nogle Ck8

+ og sporadisk CK5

+ -celler (fig. 2B). Interessant spredt AR

+ og P63

+ celler kunne observeres (fig. 2B). Farvning med humant-specifikke antistoffer mod mitochondrier og Ki-67, som begge ikke plette musevæv (Fig. S1), bekræftede den humane oprindelse af den regenererede HPCa57 tumor (fig. 2B). Lignende mønstre af morfologi og markør-ekspression blev observeret i HS5-rekonstituerede HPCa58 (fig. 3) og 9 andre HPCa prøver, dvs. HPCa70, 80, 83, 84, 85, 87, 91, 92, 96 (data ikke vist).

(A) Farvning af HE, AR, PSA, Ck8, CK5, P63 og Racamase i HPCa57 patientprøve. (B) HPCa57P1 xenograft tumor, der stammer fra co-injektion med 100.000 HS5 celler, blev brugt til at lave serielle snit, som blev farvet for HE, Hu-mito, Hu-Ki67, AR, PSA, Ck8, CK5 og P63. Både lav (dvs. 100x) og høj-effekt (dvs. 400x) forstørrelser blev vist. Pil viser CK5

+ celler.

(A) Farvning af HE, AR, PSA, Ck8, CK5, P63 og Racamase i HPCa58 patientprøve. (B) HPCa58P1 xenograft tumor, der stammer fra co-injektion med 100.000 HS5 celler, blev brugt til at lave serielle snit blev farvet for HE, Hu-mito, Hu-Ki67, AR, PSA, Ck8, CK5 og P63. Både lav (dvs. 100x) og høj-effekt (dvs. 400x) forstørrelser blev vist. Pil viser CK5

+ celler.

I overensstemmelse med IHC resultater, RT-PCR-analyse ved hjælp af menneske-specifikke primere viste, at ingen af ​​de HPCa /HS5 xenografter udtrykt

PSA

men de fleste udtrykte forskellige niveauer af menneskelig

AR

mRNA (fig. 4A). Især dyrkede murine fibroblaster (Swiss 3T3) og HS5 celler var negative for både

AR

og

PSA

mRNA (fig. 4A). Western blotting eksperimenter for 4 luminale cellemarkører, racemase, PSA, AR, og CK18 bekræftede mangel på PSA udtryk og afslørede varierende niveauer af de andre 3 markører i forskellige xenografter (fig. 4B-D). Bemærk, at dyrkede HS5 celler og HS5 tumorer (se nedenfor) udtrykte ikke CK18 (fig. 4D, pil), selv om de udtrykte lave niveauer af racemase (fig. 4B). Lejlighedsvis blev HS5 tumorer fundet at udtrykke lave niveauer af AR protein (fig. 4C), selv om de udtrykte knapt påviselig

AR

mRNA (fig. 4A). De fleste HPCa /HS5 xenotransplantater udtrykte højere niveauer af racemase end PC3-celler (fig. 4B). Interessant, Western blotting for P63 afslørede meget høje niveauer i PC3 og LNCaP celler, let påviselig udtryk i HPCa57 og HPCa96 xenografter, og meget lave niveauer i flere andre HPCa xenografter (HPCa58, 70, og 91) (fig. 4B). Disse resultater generelt tyder på, at

HPCa /HS5 implanteret indeholder humane prostata-epitelceller

. Som yderligere støtte, Western blotting af AR og CK18 om en række HPCa57 /HS5 xenotransplantattumorer, fra 1 ° generation (P1) til 4 ° generation (P4), afledt af sc eller DP implantationer, viste, at alle disse tumorer var positive for AR og CK18 (figur 4E).

(A) RT-PCR resultater af AR, PSA, og β-actin under anvendelse af humane-specifikke primere. LNCaP, trpC (behandling prostatacancer, 46) og DU145-celler blev anvendt som kontroller. (B-D) Western blotting af racemase, PSA, P63, CK18 og AR den HPCa-HS5 xenotransplantattumorer og tumorcellen-afledte sfærer. GAPDH og β-actin blev anvendt som indlæsning kontroller.