PLoS ONE: AMPK aktivatorer Undertryk livmoderhalskræft Cell Vækst gennem hæmning af DVL3 Mediated Wnt /β-Catenin Signaling Activity

Abstrakt

De seneste oplysninger har foreslået, at AMPK-aktivatorer kan anvendes som terapeutiske lægemidler undertrykke kræft cellevækst . Men den molekylære mekanisme af deres supprimerende funktion i cancerceller er stadig uklar. Her viser vi, at AMPK-aktivatorer forringe livmoderhalskræft vækst kræftcelle gennem reduktion af DVL3, en positiv regulator i Wnt /β-catenin signalering og et onkogen aktør i livmoderhalskræft tumorigenese. Ved western blot og immunhistokemiske analyser, vi viste, at DVL3 ofte blev opreguleret og signifikant associeret med forhøjet β-catenin (

P

= 0,009) og CyclinD1 (

P

= 0,009) udtryk i livmoderhalskræft . Tvungen udtryk for DVL3 forhøjet β-catenin og augmented livmoderhalskræft vækst kræftcelle, kontrollere, at DVL3-medieret Wnt /β-catenin aktivering er involveret i livmoderhalskræft onkogenese. På den anden aspekt, bemærkede vi, at den cervikale vækst cancercellen bemærkelsesværdigt blev undertrykt af AMPK aktivatorer og sådan cellevækstinhiberingen var i samtidig med reduktionen af ​​DVL3 proteinniveau i dosis- og tidsafhængige måder. Desuden, svækket mTOR signaleringsaktivitet også reduceret DVL3 ekspression. I modsætning hertil kunne co-behandling med forbindelse C (AMPK inhibitor) signifikant ophæver metformin induceret reduktion DVL3. Desuden kunne co-behandling med AM114 eller MG132 (proteosomal inhibitorer) delvis genoprette DVL3 ekspression under behandlingen af ​​metformin. Yderligere

in vivo

ubiquitinering assay viste, at metformin kan reducere DVL3 ved ubiquitin /proteasomalaktivitet nedbrydning. Så vidt vi ved, er dette den første rapport, der viser de sandsynlige molekylære mekanismer i at AMPK aktivatorer undertrykke cervikal vækst cancercelle ved at ændre DVL3 proteinsyntese via AMPK /mTOR signal- og /eller delvist at fremme proteasomalaktivitet nedbrydning af DVL3.

Henvisning: Kwan HT, Chan DW, Cai PCH, Mak CSL, Yung MMH, Leung THY, et al. (2013) AMPK aktivatorer Undertryk livmoderhalskræft Cell Vækst gennem hæmning af DVL3 Mediated Wnt /β-Catenin Signaling aktivitet. PLoS ONE 8 (1): e53597. doi: 10,1371 /journal.pone.0053597

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: August 22, 2012; Accepteret: November 30, 2012; Udgivet: januar 2, 2013 |

Copyright: © 2013 Kwan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Wong Tjek Hun Charitable Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er en af ​​de mest almindelige gynækologiske kræftformer i hele verden. Til dato den mest kendte årsag til livmoderhalskræft er det humane papillomavirus (HPV) -infektion. Vedvarende HPV-infektion fremmer udviklingen af ​​forstadier til kræft til livmoderhalskræft [1]. Imidlertid HPV-infektion alene ikke tilstrækkelig til at transformere epiteliale værtsceller til cancerceller. Således kan andre faktorer, såsom opregulering af onkogener og afvigende aktivering af relaterede signalveje, være involveret i cervikal carcinogenese [2]. Nylige beviser har vist, at afvigende aktivering af Wnt /β-catenin signalering afgørende er involveret i udvikling af cancer [3], [4], [5]. Ophobningen af ​​β-catenin er kendetegnende i forårsager uregelmæssig aktivering af Wnt /β-catenin signalering, som er tæt forbundet med carcinogenese af livmoderhalsen [6], [7], [8], [9], og især i invasive cervikale carcinomer [10]. Således rettet mod denne vej kan være en lovende tilgang i molekylær terapi af denne sygdom.

AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) er en mester regulator af cellulære energisystem [11]. Aktiveret AMPK aktivitet svækker mekanistisk mål for Rapamycin (mTOR) signalering og dens tilsvarende p70S6 kinase og 4E-BP1 aktivitet [12], og derved hæmme proteinsyntesen [13], [14] og cellevækst. Det er derfor ikke overraskende, at lav AMPK aktivitet favoriserer carcinogenese [15], [16]. Til dette formål talrige farmaceutiske AMPK aktivatorer såsom A23187, A769662, 5-aminoimidazol-4-carboxamideribonucleoside (AICAR) og metformin er for nylig blevet vist at udøve anti-tumor effekt i en lang række humane cancere [17], [18], [19 ], [20], [21], [22], [23]. Især har metformin været brugt i flere igangværende kliniske forsøg [24], [25], [26], [27]. Men de molekylære mekanismer for de antitumorvirkninger af disse AMPK aktivatorer er endnu ikke blevet klart belyst.

I denne undersøgelse viste vi, at DVL3 blev signifikant opreguleret og er korreleret med Wnt /β-catenin-aktivitet i livmoderhalskræft. Endnu vigtigere, vi er de første til at bevise, at AMPK-aktivatorer hæmmer livmoderhalskræft kræft vækst cellen gennem svække DVL3-medieret Wnt /β-catenin signalering i livmoderhalskræft celler. Vi viste, at hæmning af AMPK /mTOR-medieret proteinsyntese og styrkelse af proteasomalaktivitet nedbrydning var de molekylære mekanismer i reduktionen af ​​DVL3 udstillet af AMPK-aktivatorer. Vores resultater implicerer betydningen af ​​DVL3 i livmoderhalskræft onkogenese og fremhæve den terapeutiske værdi af målretning DVL3 af AMPK-aktivatorer i livmoderhalskræft behandling.

Materialer og metoder

Cell kultur

Fem livmoderhalskræft cellelinjer (HeLa, SiHa, C33A, CaSki og C41) (American Type Culture Collection, Rockville, MD) (cellelinjer godkendelse blev gjort ved in-house STR DNA-profilering analyse) og to immortaliserede cervikale epiteliale cellelinjer ( NC104 og NC105) [6] (gave fra Prof. George. Tsao, Anatomisk Institut, The University of Hong Kong) blev anvendt i denne undersøgelse. Alle cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO2 i minimum essentielt medium eller Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Gibco-BRL, Gaithersburg) med 10% føtalt bovint serum (Gibco) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco).

plasmider og celletransfektion

GFP-mærkede DVL3 udtrykkende konstruktion blev anvendt til GFP /DVL3 proteinekspression [28], mens pEGFP-C1-plasmid blev anvendt som negativ kontrol. Den pCMV2-Flag /DVL3 blev brugt til TOP /FOP luciferase reporter assay, mens både pSuper8XTOPFlash og pSuper8XFOPFlash konstruktioner venligt blev leveret af Dr. R. Moon (University of Washington, Washington, USA). LipofectAMINE

TM 200 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) blev anvendt til celletransfektion ifølge fabrikantens protokoller. Til etablering af GFP-DVL3 stabilt udtrykker celler, blev transficerede celler udvælges med G418 i 2 uger og verificeret ved Western blot-analyse.

RNA-ekstraktion og kvantitativ revers transkriptase-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret ved TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. Komplementært DNA blev syntetiseret under anvendelse af revers transkription reagens kittet (Applied Biosystems, Foster City). Ekspressionen af ​​

DVL3

blev evalueret ved kvantitative revers transkriptase-PCR (Q-PCR) i et ABI PRISM ™ 7500-system (Applied Biosystems) under anvendelse af TaqMan ° genekspression assays; menneske

DVL3

(Assay ID: Hs00610263_m1). Den menneskelige

18S rRNA

(Assay ID: Hs99999901_m1) blev anvendt som en intern kontrol

Protein Extraction, Western blotting og immunhistokemisk (IHC) analyser

Protein lysat blev ekstraheret. ved lysering celler bundfælde med 1x lysepuffer (10X lysepuffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 1:100 PMSF, proteaseinhibitor og destilleret vand). Til Western blot-analyse blev prøver indeholdende en fast mængde protein separeret ved SDS-PAGE og elektroblottet til Hybond-P-membraner (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH, USA). Membraner blev derefter blottet med 5% skummetmælk i 30 minutter og inkuberet med primære antistoffer; anti-pp70S6kinase, anti-p70S6 kinase, anti-pAMPKα, anti-AMPKα, anti-CyclinD1 (cellesignalering Technology), anti-DVL1, anti-DVL2, anti-DVL3, anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA , USA) og anti-β-catenin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) natten over ved 4 ° C. Anti-mus eller anti-kanin sekundært antistof konjugeret til peberrod peroxid (Amersham Pharmacia Biotech, OH) blev anvendt og visualiseret ved forøget kemiluminescens (Amersham). Til immunohistokemisk analyse blev livmoderhalskræft vævsarray (CXC1021) (5 tilfælde af normal cervix /cervicitis og 97 tilfælde livmoderhalskræft) (Pantomics Inc, CA, USA) anvendes til immunhistokemisk farvning for DVL3, β-catenin og CyclinD1. Snittene blev immunfarvet med primær anti-DVL3 (1:200 fortynding) (NB110-59941, Novus Biologicals, Littleton, CA USA), anti-β-catenin (BD Biosciences) (1:200 fortynding) og anti-CyclinD1 (1 :100 fortynding) (H-295, Santa Cruz Biotehcnology). Inkubation med Tris-bufret saltvand blev anvendt som negative kontroller. Deres ekspressionsniveauer blev bedømt manuelt ved at gange den procentdel af andelen af ​​immunpositive farvning område (0-100%) og intensiteten af ​​farvning (+1, svag; 2, moderat, 3, intens, og +4, meget intens ). Fold ændring af hvert gen blev beregnet ved at dividere ekspressionsniveauet af hvert cancer prøve ved middelværdien af ​​dets ekspressionsniveau af normal cervix /cervicitis. Afskæringspunktet (antal folder) af hvert gen blev derefter bestemt ved dens ekspressionsniveauer og statistisk signifikans. Alle vævssnit blev undersøgt og scoret uafhængigt af to efterforskere.

Luciferase Reporter Assay

HEK293 celler blev forbigående transficeret med 0, 50, 100, og 200 ng pCMV2-Flag /DVL3 samt som enten en pSuper8XTOPFlash eller pSuper8XFOPFlash luciferase reporter konstrukt. Alle transfektioner blev normaliseret med pcDNA3.1 (+) vektor. Luciferaseaktiviteten blev bestemt under anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Transfektionseffektiviteten blev normaliseret med

Renilla

luciferaseaktivitet. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer i 3 uafhængige forsøg.

In vivo

Ubiquitinering Assay

Proceduren blev beskrevet som tidligere [29]. Kort fortalt blev C33A eller Hela-celler podedes på 100 mm dyrkningsplader. PcDNA-HA (Ub)

8 var forbigående transficeret ind i de ovennævnte celletyper henholdsvis ved hjælp Lipofeactamin 2000 transfektion kit (Invitrogen). Cellelysatet blev høstet ved anvendelse af NET lysepuffer (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl og 5 mM EDTA) med 1% NP40, pH 8,0, 0,1 mM PMSF og 1 mM Komplet TM proteaseinhibitorcocktail (Roche)) på cellepelleten. Et mg cellelysat blev inkuberet med 1 ug af muse-anti-IgG og anti-DVL3 (Santa Cruz) ved 4 ° C. Efter inkubation blev 40 pi protein A /G Plus-agaroseperler (Santa Cruz) tilsat til hver prøve og blandet ved rotation natten over ved 4 ° C. Efter centrifugering blev perlerne vasket fire gange med NET lysepuffer efterfulgt af tilsætning af prøve-buffer indeholdende DTT og kogt i 10 min forud for elektroforese. Proteasominhibitorerne, MG132 og AM114, blev opnået fra Calbiochem (La Jolla, CA).

Cellelevedygtighed assay

Celleproliferation kit (XTT) (Roche) blev anvendt til måling af cellelevedygtighed for 5 dage efter fabrikantens protokol. Tre uafhængige forsøg blev udført tredobbelt.

klongenicitetsassayet

Celler lodes vokse i 2 uger. Efter 2 uger blev mediet fjernet efterfulgt af inkubation med methanol i 30 minutter og derefter farvet med krystalviolet i 1 time. Efter farvning blev cellerne vasket med PBS. Tre eksemplarer af bestemt hver prøve og tre uafhængige forsøg blev udført, og antallet af celler blev talt af Gel-Doc systemet.

Dataanalyse

Students t-test (for parametriske data) og Mann- Whitney-test (for ikke-parametriske data) blev anvendt til analyse. Den klinisk-patologisk analyse mellem ekspressionen af ​​DVL3, β-catenin, CyclinD1 og kliniske parametre blev analyseret ved krydstabuleringer og Pearson Chi-Square test ved SPSS 13.0 software (SPSS, Chicago, IL). Alle data blev udtrykt som middel ± SD. En

P

-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

DVL3 ofte opreguleret i livmoderhalskræft celler

Nye beviser har vist at DVLs kan opregulere β-catenin og fremmer cellevækst i colorektal cancer [30], malignt pleura mesotheliom [31] og ikke-småcellet lungecancer [32] etc. Vi undersøgte således ekspressionsmønsteret for DVLs ( DVL1, DVL2 og DVL3) i livmoderhalskræft cellelinier ved western blot analyse. Vores data viste, at DVL3 men hverken DVL1 eller DVL2 var signifikant opreguleret i et panel af cervikale cancercellelinier (Hela, SiHa, CaSki, C33A og C41) sammenlignet med immortaliserede cervix cellelinier (NC104 og NC 105) (figur 1A ), hvilket tyder på, at DVL3 overvejende er opreguleret i livmoderhalskræft celler. Vi næste undersøgte mRNA niveau af

DVL3

i disse cellelinjer med realtid kvantitativ revers transkription PCR (q-PCR). Tilsvarende

DVL3

mRNA-niveauer var signifikant højere i livmoderhalskræft cellelinjer i forhold til de normale immortaliserede livmoderhalsen cellelinier (Figur 1B). Tilsammen indikerer disse resultater, at DVL3 er den største isoform af DVLs ofte opreguleret i livmoderhalskræft celler.

(A) Western blot-analyse viste, at kun størrelsen af ​​DVL3 men ikke DVL1 og DVL2 var signifikant op- reguleret i cervicale cancercellelinier sammenlignet med de normale cervix cellelinier. (B) Real time q-PCR afslørede mRNA af

DVL3

var selvfølgelig højere blandt livmoderhalskræft cellelinjer sammenlignet med de normale livmoderhalsen cellelinjer. Værdien af ​​NC105 blev anvendt til at normalisere andre cellelinjer. (C) Immunhistokemisk analyse viste, at både DVL3 og β-catenin blev opreguleret på livmoderhalskræft væv sammenlignet med normale livmoderhalsen prøver. DVL3 blev fordelt i den cytoplasmatiske region henviser β-catenin var placeret i både det cytoplasmatiske og nukleare områder. (Forstørrelse: 20x) (D) Luciferase reporter assay viste, at forbigående transfektion af DVL3-udtrykkende plasmid kunne øge β-catenin transkriptionel aktivitet i HEK293 celler

Overekspression af DVL3 og β-catenin i livmoderhalskræft.

for at undersøge betydningen af ​​DVL3 og β-catenin i livmoderhalskræft, vi undersøgte udtryk for DVL3 og β-catenin på en livmoderhalskræft væv array (CX1021) ved hjælp af immunhistokemiske (IHC) analyse. Immunoreaktiviteten af ​​DVL3 blev kun observeret i cytoplasmaet henviser β-catenin lokaliseret i begge kerner og cytoplasmatiske regioner i både normale og cervicale cancerceller (fig 1C). IHC-analyse viste, at bemærkelsesværdige øgede udtryk for DVL3 og β-catenin blev observeret i cervikale tumorsnit sammenlignet med den normale cervix sektioner (tabel 1 og 2). Statistisk analyse viste, at høj ekspression af DVL3 (rang 5 folder) var signifikant korreleret med højt niveau af β-catenin (rang 7 folder; P = 0,009) (tabel 1). Men der var ingen signifikant sammenhæng mellem DVL3 udtryk og andre kliniske parametre, såsom tumor stadier (

P

= 0,369), sortering (

P

= 0,658), metastaser (

P

= 0,243), β-catenin (

P

= 0,009) og CyclinD1 (

P

= 0,009). På den anden side, den opregulering af β-catenin (rang 7 folder) var signifikant forbundet med høj kvalitet tumorer (

P

= 0,049) og overekspression af CyclinD1 (

P

= 0,009), men der var ingen signifikant sammenhæng med tumor stadier (

P

= 0,189) og metastaser (

P

= 0,345) (tabel 2). Tilsammen disse resultater tyder på, at øget ekspression af DVL3 er korreleret med β-catenin som er involveret i livmoderhalskræft udvikling af kræft.

DVL3 øger spredningen af ​​livmoderhalskræft celler

DVLs er vigtige signaltransduktionsmolekyler medierer Wnt /β-catenin signaleringsaktivitet at kontrollere cellevækst. For at løse hvorvidt DVL3 kunne fremme Wnt /β-catenin signaleringsaktivitet, blev den dobbelte luciferase reporter assay udføres. Transfektion af DVL3-udtrykkende plasmid ind i HEK293-celler forøget β-catenin transkriptionel aktivitet i en dosisafhængig måde (figur 1D), hvilket antyder, at DVL3 er en positiv regulator af Wnt /β-catenin signaleringskaskade. Dernæst at undersøge, om DVL3 fremmer celledeling via aktivering af Wnt /β-catenin vej hos livmoderhalskræft, to livmoderhalskræft cellelinjer (C33A og SiHa) med stabilt udtryk af DVL3 blev etableret under anvendelse af humane GFP-mærkede DVL3 udtrykker plasmid. Western blot-analyse afslørede, at β-catenin var signifikant forhøjet i GFP-DVL3 stabile kloner i C33A (C-G25 og C-G28) og SiHa (S-G18 og S-G20) (figur 2A). Funktionelt, afslørede XTT celleformeringsanalyse at ektopisk udtryk for DVL3 væsentligt forbedret celleproliferation i GFP-DVL3 stabile kloner af SiHa (

P

0,05) og C33A (

P

0,001) celler (figur 2B). Desuden klongenicitetsassayet afslørede, at der var 2-3 gange forøgelse i antallet af kolonier i SiHa-celler, der stabilt udtrykker GFP-DVL3 (S-G18 og S-G20) (

P

0,05) og C33A celler (C-G25 og C-G28) (

P

0,05) henholdsvis i forhold til deres vektor kontroller (Figur 2C). Kollektivt, disse resultater tyder på, at DVL3 forbedrer Wnt /β-catenin signalering aktivitet og fremmer udbredelsen af ​​livmoderhalskræft celler.

(A) Western blot viste, at stabilt over-udtrykker GFP-DVL3 forhøjet udtryk for β-catenin i C33A (C-G25 og C-G28) og SiHa (S-G18 og S-G20). (B) XTT assay viste en signifikant stigning af celleproliferation i livmoderhalskræft celler med stabil ekspression af GFP-DVL3 (C-G24 og C-G28;

P

0,05) (S-G18 og S- G20;

P

0,05). (C) Klonogen assay viste, at to gange og tre gange antallet af kolonier blev fundet i GFP-DVL3 ektopisk udtrykker C33A celler (C-G25 og C-G28) (

P

0,05) og SiHa-celler (S -G18 og S-G20) (

P

0,05) sammenlignet med deres vektor kontrol

AMPK aktivatorer reducere DVL3 i livmoderhalskræft celler

Talrige. undersøgelser har vist, at AMPK aktivatorer kan hæmme cellevækst i kræft, især i livmoderhalskræft

in vitro

[21], [33], [34]. Derfor undersøgte vi effekten af ​​AMPK-aktivatorer på ekspressionen af ​​DVL3 og dets forbundne Wnt /β-catenin signalering aktivitet i livmoderhalskræft celler. AICAR behandling resulterede i signifikant reduktion af DVL3 niveauer i tre cervikale cancercellelinier (figur 3A). En anden AMPK aktivator, A23187, aktiverer AMPK gennem sin opstrøms kinase (CaMKK) ved at forøge cytosolisk calcium [20], også reduceret DVL3 ekspression i C33A og SiHa-celler på en dosis-afhængig måde (figur 3C). For yderligere at vurdere virkningen af ​​A23187 på DVL3 udtryk, blev C33A og CaSki behandlet med 1,25 uM A23187 og høstet på forskellige tidspunkter. Formindskelse af DVL3 blev observeret efter 10 og 12 timer i C33A og CaSki henholdsvis og ingen DVL3 blev observeret efter 12 og 24 timer for begge cellelinier (figur 3D). For yderligere at vurdere, om nedsættelsen af ​​DVL3 medieret af AMPK-aktivatorer er en universel proces, to velkendte AMPK aktivatorer, A769662 og metformin, blev anvendt. A769662 er en thienopyridone som aktiverer AMPK gennem vekselvirkning med α- og β-underenheden af ​​AMPK. Efter A769662 behandling blev DVL3 ekspression ophæves i en dosis-afhængig måde i SiHa og C33A (figur 3B). Desuden metformin er en meget almindelig AMPK aktivator samt en potentiel anticancerlægemiddel [22]. Ved behandling af metformin, adskillige cervikale cancercellelinier vises differentielle reaktioner på metformin og viste udtømning af DVL3 på en dosis-afhængig måde (figur 3E), sammen med nogen ændring i mRNA-niveauet af

DVL3

i C33A og HeLa (figur 4A), hvilket tyder på, at reduktionen af ​​DVL3 reguleres af AMPK aktivatorer var forbundet med post-transkriptionelle begivenheder. Tilsammen disse data indebærer, at AMPK-aktivatorer kan reducere DVL3 og sådan virkning er en universel proces.

(A) Ved behandling af AICAR, ca. 80% reduktion af DVL3 niveau blev observeret blandt C33A, C41 og CaSki. (B) Ved behandling af A769662 ved forskellige doser (0, 50 og 100 um), en 20-30% og 80% -100% reduktion af DVL3 i SiHa og C33A kunne observeres henholdsvis. (C) Ved behandling med A23187 ved forskellige doser (0, 1,25 og 2,5 uM) i tyve timer, viste C33A og SiHa-celler 80-90% reduktion af DVL3 ekspression i en dosis-afhængig måde. (D) Ved behandling af 1,25 uM A23187, kan faldet i DVL3 observeres efter 10 og 12 timer i C33A og CaSki henholdsvis, mens en yderligere reduktion 100% af DVL3 blev observeret ved 12 og 24 timer for begge cellelinier. (E) Ved behandling af metformin, blev der observeret 60-80% reduktion af DVL3 i Hela, SiHa, CaSki, C41 og C33A i en dosisafhængig måde.

(A) Real time Q- PCR-analyse viste, at metformin ikke havde nogen effekt på ekspressionen af ​​

DVL3

mRNA-ekspression i C33A og HeLa-celler. (B) Western blot-analyse afslørede, at forbindelse C kunne aftage formindskelsen af ​​DVL3 medieret af metformin. (C) XTT celleproliferationsassay viste en signifikant reduktion af celleproliferation i C33A (

P

0,001), SiHa (

P

0,001) og HeLa-celler (

P

0,001) behandlet med metformin i en dosisafhængig måde. (D) Klonogen assay viste en bemærkelsesværdig reduktion af antallet af kolonier dannet i HeLa og C33A behandlet med metformin i en dosis-afhængig måde.

AMPK aktivering er afgørende for reduktionen af ​​DVL3 medieret af AMPK aktivatorer

Selvom den store rolle AMPK-aktivatorer er at aktivere AMPK aktivitet, mange rapporter har påvist, at nogle AMPK aktivatorer kan udøve off-target effekter [35], [36]. Det er derfor af interesse at undersøge, om AMPK aktivatorer medieret reduktion af DVL3 er udelukkende afhænger af AMPK signaleringsaktivitet. Vi anvendte en potent AMPK inhibitor, forbindelse C, for at modvirke effekten af ​​metformin på AMPK aktivering. Konsekvent, reduktion af DVL3 blev observeret efter behandling af metformin i C33A og SiHa (figur 4B), men formindskelsen af ​​DVL3 blev ophævet ved tilsætning af forbindelse C. (figur 4B). Disse data tyder på, at reduktionen af ​​DVL3 medieret af metformin er primært gennem AMPK signalering aktivitet.

AMPK aktivatorer forringe livmoderhalskræft celledeling gennem reduktion af DVL3 og Wnt /β-signalering aktivitet

Vi har påvist, at ektopisk ekspression af DVL3 kan øge celleproliferation i cervicale cancerceller. Derfor, for at opnå yderligere indsigt i funktionen af ​​forarmet DVL3 minimere Wnt /β-catenin signalering og celledeling medieret af AMPK-aktivatorer, blev C33A, SiHa og HeLa celler behandlet med metformin og deres spredning satser blev undersøgt af XTT assay. Vores resultater viste, at metformin signifikant undertrykt celleproliferation i C33A (

P

0,001), SiHa (

P

0,001) og HeLa-celler (

P

0,001) (figur 4C). Endvidere klongenicitetsassayet afslørede også, at antallet af kolonier blev reduceret med 20 og 50% i C33A og HeLa-celler (figur 4D). Disse resultater åbenbart, at hæmning af livmoderhalskræft vækst kræftcelle af AMPK-aktivatorer tilskrives reduktionen af ​​DVL3.

AMPK /mTOR aktivitet er afgørende for udtømning af DVL3

AMPK aktivatorer er i stand til aktivere AMPK og modulerer dets nedstrøms kaskade, såsom den translationelle styring af proteinsyntese gennem hæmning af mTOR pathway [12], [13], [14]. Vi derfor begrundede blokering af AMPK /mTOR aktivitet kan efterligne virkningerne af AMPK aktivatorer på formindskelsen af ​​DVL3. En mTOR-hæmmer (Rapamycin) blev anvendt til at hæmme mTOR aktivitet. Rapamycin undertrykker kinaseaktiviteter af mTOR at inaktivere p70S6k, derved afskaffe visse proteintranslation [37]. Ved behandling af Rapamycin blev DVL3 reduceret i cervikale cancercellelinier (C33A, C41, CaSki, HeLa og SiHa) i en dosis-afhængig måde. Endvidere blev inaktivering af p70S6k ved samtidig med reduktionen af ​​DVL3 observeret i HeLa og SiHa celler behandlet med 1 nM Rapamycin (figur 5A). Tilsammen kunne reduktionen af ​​proteinsyntese reducere DVL3 udtryk i livmoderhalskræft cellelinier og at formindskelsen af ​​DVL3 medieret af AMPK-aktivatorer er hovedsageligt gennem AMPK /mTOR signaleringskaskade.

(A) Rapamycin inaktiveret p70S6 kinase aktivitet og mislykkede proteinsyntese af DVL3 i alle cervicale cancercellelinier (C33A, C41, CaSki, HeLa og SiHa) i en dosis-afhængig måde. (B) proteasomalaktivitet inhibitor, AM114, restaureret den reducerede DVL3 medieret af metformin i C33A. (C) proteasomalaktivitet inhibitor, AM114, kunne ikke gendanne den reducerede DVL3 medieret af metformin i SiHa og HeLa. (D)

In vivo

ubiquitinering assay viste, at DVL3 blev nedbrudt som poly-ubiquitineret DVL3 protein ((Ub) n-DVL3) i C33A celle model. C33A celler blev transficeret med pcDNA-HA (Ub)

8 plasmid. Både MG132 eller AM114 og metformin blev brugt til at øge mængden af ​​polyubiquitinated DVL3 proteinprodukter ((Ub) n-DVL3). Cellelysater blev inkuberet med anti-DVL3, og immunopræcipitaterne blev probet med anti-HA. Den samme membran blev re-testet med anti-DVL3 at påvise ekspressionen af ​​DVL3.

AMPK aktivatorer også fremme proteasomalaktivitet nedbrydning af DVL3

Flere linjer af beviser har vist, at DVLs er stramt reguleret af proteasomalaktivitet nedbrydningsmekanismer hvor tab af faktorer involveret i ubiquitinering veje fører til DVLs ophobning [28], [38]. Således har vi ræsonnerede, at proteasomalaktivitet nedbrydning kan tjene som en alternativ mekanisme tilskrives AMPK aktivatorer medierede DVL3 reduktion. Vi anvendte AM114, en proteasomalaktivitet inhibitor, at undertrykke ubiquitin /proteasomalaktivitet nedbrydning. Ved samtidig behandling med AM114 og metformin, blev restaureret DVL3 ekspression observeret i C33A men ikke i SiHa og HeLa-celler (figur 5B og 5C).

in vivo

ubiquitinering assay yderligere påvist, at DVL3 i C33A celler kunne nedbrydes gennem ubiquitin /proteasom vej, fordi dannelsen af ​​DVL3-ubiquitinerede produkter blev observeret ved behandling af metformin og sådanne DVL3-ubiquitinerede produkter blev yderligere forbedret, når co-behandling med enten AM114 eller MG132 (figur 5D). Disse data viser, at proteasomalaktivitet nedbrydning også spiller en rolle i reduktionen af ​​DVL3 medieret af AMPK aktivatorer.

Discussion

I denne undersøgelse har vi vist, at DVL3 var aberrant overudtrykt og signifikant korreleret med forøget β-catenin i livmoderhalskræft. Vore data viste også, at DVL3 kunne fremme cervikal cancervækst gennem aktivering Wnt /β-catenin-signalvejen. Vigtigere, rettet vi den potentielle anvendelse af AMPK aktivatorer reducere DVL3 og dermed hæmme cervikal vækst kræftcelle. Ud over dette er den første rapport, der viser de mulige molekylære mekanismer i hvordan AMPK aktivatorer forringe livmoderhalskræft cellevækst gennem krydstale mellem AMPK og Wnt /β-catenin signalering.

Aberrant aktivering af Wnt /β-catenin signalering pathway er blevet dokumenteret i forskellige humane cancere, herunder livmoderhalskræft [39]. Faktisk har montering beviser vist, at DVLs som er positive regulatorer af Wnt /β-catenin signalvej ofte opreguleres i en række forskellige humane cancere [32], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46]. De overudtrykte DVLs er tæt forbundet med den øgede Wnt /β-catenin aktivitet i humane kræftformer [31], [32], [47]. Men meget lidt er kendt om de funktionelle roller DVLs i livmoderhalskræft. Heri, observerede vi, at DVL3, men hverken DVL1 eller DVL2, var signifikant opreguleret og forbundet med augmented Wnt /β-catenin signaleringsaktivitet og cervikal vækst kræftcelle.

Talrige undersøgelser har rapporteret, at de opstrøms kinaser af AMPK, ligesom LKB1, ofte muteret og slettes i lunge-, bryst- og især livmoderhalskræft [21], [48], [49], og derved sænke AMPK aktiviteter for cancercellevækst. Faktisk lav AMPK aktivitet er en almindelig begivenhed begunstige cancercellevækst [15], [16]. , AMPK er derfor en essentiel mål i behandlingen af ​​kræft. Vi og andre grupper har tidligere demonstreret, at adskillige AMPK aktivatorer kunne undertrykke cancercellevækst [21], [22], [50]. Men de molekylære mekanismer i undertrykkelsen stort set uudforsket. Tidligere viste Kohno gruppe at metformin reducerede proteinniveauet af β-catenin gennem regulering dens phosphorylering-afhængige nedbrydning [51]. Dette gav os en anelse om, at metformin kan regulere opstrøms regulatorer af Wnt /β-catenin signaleringskaskade. Heri, vi demonstreret, at bemærkelsesværdige reduktion af DVL3 kunne induceres af flere AMPK aktivatorer, hvilket antyder, at AMPK aktivatorer universelt reducere DVL3. I overensstemmelse med tidligere rapporter om anti-tumor effekt af metformin gennem nedregulering af CyclinD1 niveau prostatakræft og brystkræft [52], [53], reduktion af DVL3 udtryk er også samtidig med nedsat mængde β- catenin og dens downstream mål, CyclinD1, som er ansvarlig for cellecyklus kontrol. Overraskende, metformin alene påvirker protein niveau DVL3 men ikke dens mRNA, hvilket indikerer, at reguleringen af ​​DVL3 medieret af AMPK-aktivatorer er afhængig af post-transkriptionel modifikation.

Som flere AMPK aktivatorer kan reducere DVL3, spekulerede vi, at AMPK aktivitet er afgørende i en sådan regulering. For at teste, om AMPK aktivatorer udøver deres virkninger på DVL3 gennem aktivering af AMPK, en AMPK inhibitor, forbindelse C, blev co-behandlet med metformin i cervikale cancerceller til at modvirke virkningen af ​​AMPK aktivering. Som forventet, forbindelse C aftaget funktionen af ​​metformin til at dæmpe DVL3 ekspression. Disse resultater åbenbart, at AMPK-aktivatorer kan reducere DVL3 gennem modulerende AMPK aktivitet, og sådan virkning ikke er på grund af AMPK aktivatorer ‘off-målrettede funktioner. Faktisk

in vitro

celleproliferationsassays viste også, at anvendelsen af ​​AMPK aktivatorer (fx metformin) kan reducere celleproliferation. Vi giver solid dokumentation for, at AMPK aktivatorer, især metformin, udøver en nedregulering virkning på DVL3 og dermed reducere ekspressionsniveauerne af β-catenin og CyclinD1, og i sidste ende dæmpe celleproliferation. Endnu vigtigere, vi er de første til at vise, at AMPK-aktivatorer udøver deres anti-proliferative effekt ved at reducere DVL3 og Wnt /β-catenin signalering aktivitet. AMPK aktivering spiller en nødvendig rolle i at undertrykke tumorudvikling i livmoderhalskræft.