PLoS ONE: En H2S-Nampt Dependent Energisk Circuit er afgørende for overlevelse og Cytobeskyttelsesaktivitet fra skader i kræftceller

abstrakt

Vi nylig vist, at cancerceller, der genvinder mod skader udviser øget aerob glycolyse dog den molekylære mekanisme, ved hvilken cancerceller overleve skaden og viser øget aerob glycolyse fortsat ukendt. Her viser vi, at forskellige cancerceller, der overlever hypoksisk eller oxidativ skade viser hurtig celleproliferation, og udvikle tolerance over for skader i forbindelse med øget produktion af hydrogensulfid (H

2S), som driver opregulering af nicotinamid phosphoribosyltransferase (Nampt). I overensstemmelse med eksistensen af ​​en H

2S-Nampt energisk kredsløb, i skader genvundet kræftceller, H

2S, Nampt og ATP produktion udviser en signifikant sammenhæng. Desuden behandling af kræftceller med H

2S donor, NaHS, sideordnet øger Nampt og ATP niveauer, og beskytter celler fra narkotika induceret skade. Hæmning af cystathionin beta-syntase (CBS) eller cystathionase (CTH), enzymer, der driver generation af H

2S, falder Nampt produktion mens undertrykkelse af Nampt vej af FK866, falder H

2S og ATP niveauer. Skader genvundne celler isoleret fra tumorer dyrket subkutant i atymiske mus viser også øget produktion af H

2S, Nampt og ATP niveauer, der er forbundet med øget glykolyse og hurtig spredning. Tilsammen viser disse data, at ved indvinding fra potentiel dødelig skade, H

2S-Nampt dirigerer energiforbrug og aerob glykolyse i cancerceller, fører til deres eksponentiel vækst, og forårsager en høj grad af tolerance over for skader. Identifikation af H

2S-Nampt som en vej er ansvarlig for induktion af skader tolerance i cancerceller kan ligge til grund resistens over for behandling og giver mulighed for at målrette denne vej som et middel til behandling af cancer

Henvisning.: Sanokawa-Akakura R, Ostrakhovitch EA, Akakura S, Goodwin S, Tabibzadeh S (2014) AH

2S-Nampt Dependent Energisk Circuit er afgørende for overlevelse og Cytobeskyttelsesaktivitet fra skader opstået i kræftceller. PLoS ONE 9 (9): e108537. doi: 10,1371 /journal.pone.0108537

Redaktør: Stefan Strack, University of Iowa, USA

Modtaget: Maj 29, 2014; Accepteret: August 27, 2014; Udgivet: 23 September, 2014

Copyright: © 2014 Sanokawa-Akakura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

I de senere år har det vist sig, at gasotransmitters, nitrogenoxid (NO), kulmonoxid (CO) og hydrogensulfid (H

2S), spiller en afgørende rolle i forskellige fysiologiske funktioner, herunder vaskulær tonus, værtsforsvar mod patogener, Neuromodulation, apoptose, og energiomsætningen i pattedyrceller [1]. Blandt disse gasformige molekyler, er H

2S produceret under aminosyre metabolisme ved de trans-sulfuration og cystein afsvovling veje [2]. Endogen H

2S produktion katalyseres af tre enzymer, cystathionin beta synthase (CBS), cystathionase (CTH) også kendt som cystathionin y-lyase, og 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (MST) [3] -. [5]

H

2S fungerer som en stimulator af cellulære bioenergetik, bidrager til den øgede afhængighed af kræftceller på glycolytiske vej til ATP-produktion og fremmer angiogenese og cytoprotektion [6] – [8]. H

2S beskytter celler mod oxidativ stress [9], kan det påvirke cellulære responser til skade [10], [11] og er vist at udvise både pro-apoptotiske og anti-apoptotiske virkninger [12] – [14]. Selv om nogle foreslog, at H

2S har anti-cancer effekt [15], andre rapporterede, at det fremmer proliferation af HCT116 og SW480 colon cancerceller [16]. Fu

et al.

Viste, at Ca

2+ stimulation medfører øget CTH udtryk og øger H

2S og ATP produktion [17]. Det blev vist, at endogen H

2S produktion drevet af 3-MST supplerer og afbalancerer de cellulære bioenergetik og vedligeholder elektron flow i mitokondrierne [18]. Colon cancerceller er blevet vist at udvise opreguleret ekspression af CBS og øget dannelse af H

2S, som dirigerer celleproliferation og angiogenese i tyktarmskræft [6].

Det er kendt, at tumorceller kan inddrive fra potentiel dødbringende skader fremkaldt af hypoxi, acidose eller ved stråling og lægemiddelbehandling [19] – [22]. Vi rapporterede for nylig, at kræftceller, der tilbagesøge skader fremkaldt af hypoxi, acidose og glukose afsavn show mitokondrie ombygninger, øget aerob glykolyse, og udviser en høj grad af ATP-produktion [23]. I denne undersøgelse, vi udforske rollen som H

2S i processen med genvinding af kræftceller fra skader. Beskadigede kræftceller udtømme deres energiforsyning på grund af reparationsmekanismer. Både ATP og NAD

+ (nikotinamidadenindinucleotid) er de vigtigste energikilder. Nicotinamid phosphoribosyltransferase (Nampt), et enzym, der kræves for NAD syntetisk bjærgning pathway [24], er afgørende for opretholdelsen af ​​cellulære energiforsyning. Derfor undersøgte vi rolle Nampt sammen med H

2S i kræftceller, der genvinder mod skader. Vi viser, at H

2S styrer inddrivelse af kræftceller fra skader ved at regulere Nampt dirigeret ændring i energiforbrug, som driver vedtagelse af aerob glykolyse og stigning i ATP og NAD

+ syntese. Samspillet af H

2S og Nampt giver kræftcellerne en høj spredning sats og en høj grad af tolerance over for skader.

Materialer og metoder

Materialer

H

2O

2, NaHS, bleomycin,

O

– (carboxymethyl) hydroxylamin hemihydrochlorid (CHH) DL-propargylglycin (PAG) og FK866 blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Antistoffer mod CBS (A-2), CTH (G-1) og β-actin (C-2) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer mod Nampt (Visfatin, PBEF) og Bax blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, MA). Antistof mod γ-H2AX blev erhvervet fra Millipore (Billerica, MA). Sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase blev købt hos Jackson ImmunoResearch Laboratories (Baltimore, PA).

Cellekultur

HepG2, MDA-MB-231 og MDA-MB-435s blev opnået fra ATCC ( Manassas, VA) dyrkes i DMEM med 2 mM glutamin, 25 mM glucose og 10% føtalt bovint serum, i 37 ° C inkubator med 5% CO

2. Skader blev induceret i cancerceller ved hypoxi, glucosemangel og hydrogenperoxid. Til induktion af hypoxi (DR

H) blev celler inkuberet i 18 timer i 1% O

2. For glucose deprivation (DR

G-) blev celler dyrket i 18 timer i et medium uden glucose i nærvær af 5% CO

2. Til induktion af skader ved hydrogenperoxid (DR

H2O2), blev cellerne behandlet med 800 uM H

2O

2 for 3 timer.

Dyreforsøg

Animal pleje og alle procedurer blev udført efter godkendelse af Institutional Animal Care udvalg af University of California, Irvine (protokol # 2012-3042). Otte uger gamle athymiske nøgne (nu /nu) hanmus (n = 10) blev erhvervet fra Charles River Laboratories (San Diego, CA). Mus blev bedøvet ved inhalation af isofluran før injektion af tumorceller. Hver mus modtog 1 x 10

5 tumorceller i et samlet volumen på 100 pi subkutant i fire steder i midten af ​​abdominale og nedre flanke områder. Mus blev overvåget 2 gange om ugen i løbet af tumorvækst eksperiment. Tyve dage efter injektion af celler blev mus aflivet ved carbondioxid inhalation når tumorerne voksede til størrelsen af ​​10-15 mm i diameter. Tumorer blev fjernet til isolering af levedygtige celler kræft (T

V) eller skade genvundet celler fra

in vivo

dyrket tumor (T

DR).

Måling af H

2S produktion i ekstra og intra-celler

Måling af ekstracellulær H

2S niveau blev udført ved hjælp af Free Radical Analyzer (TBR4100 og ISO-H2S-2, verden Precision Instruments, Sarasota, FL) efter fabrikantens anvisninger . Kort fortalt blev celleantal indstillet til 1 x 10

6 levedygtige celler i PBS, og cellesuspensionerne blev inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Celler blev derefter centrifugeret, og supernatanterne blev underkastet målinger. Før hver måling blev sensoren polariseret og kalibreret ved tilsætning fire portioner af Na

2S stamopløsning ved slutkoncentrationer på 0,25, 0,5, 1,0 og 2,0 uM. Påvisning af intracellulær H

2S blev udført af H

2S fluorescerende probe HSN2 (en slags gave fra professor Michael D. Pluth, University of Oregon, Kemisk Institut, Eugene, Oregon).

Hele celleprotein ekstraktion og Western blotting

proteiner fra celler blev ekstraheret i lysepuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM na

3VO

4, 50 mM NaF, og protease inhibitor cocktail). Protein-målinger blev udført ved Bio-Rad protein assay baseret på Bradford dye-binding-metoden (Bio-Rad Lab, Hercules, CA).

blotting bånd blev detekteret ved forøget kemiluminescens ECL (Amersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagenser GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA) ved hjælp af C-Digit Digital Imager (LI-COR, Lincoln, NE) og densitometrisk analyse blev udført ved hjælp af MyImage Analysis software (Thermo Scientific). β-actin tjente som en loading kontrol.

Cellelevedygtighed måling

Relativ celleantal blev målt ved XTT-assay (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Celler blev inkuberet med XTT og phenazinmethosulfat (PMS) ved 37 ° C i 2 timer og absorbansen blev aflæst ved 450 og 650 nm som reference.

revers transkription-polymerase-kædereaktion (PCR) og kvantitativ PCR ( qPCR)

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Siγma-Aldrich, St. Louis, MO). Omvendt transskription blev udført ved hjælp af High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). RT-PCR blev udført ved hjælp af de specifikke for den menneskelige CBS primere (fremad: GAACCAGACGGAGCAGACAA; reverse: GTCGCTCAGGAACTTGGTCA), for den menneskelige CTH (fremad: AAAGACGCCTCCTCACAAGG; omvendt: AAGGCAATTCCTAGTGGGATTTC) og for den menneskelige MTS (fremad: CGCCGTGTCACTGCTTGAT; omvendt: CAGGTTCAATGCCGTCTCG ). Genekspression blev vurderet ved PCR under anvendelse af

Taq

5 × Master Mix (New England Biolabs. Ipswich, MA) med et indledende denatureringstrin 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler med hver ved 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sekunder, og 68 ° C i 1 min.

Kvantitativ evaluering blev udført ved anvendelse MyImage Analysis software (Thermo Scientific, New Hampshire). For normalisering af data,

β-actin

blev forstærket med specifikke primere (forward: AAGCCACCCCACTTCTCTCT; omvendt: GAGACCAAAAGCCTTCATACATCT). qPCR blev udført under anvendelse Quanti tect SYBR Green PCR-kittet. qPCR blev udført ved hjælp af de specifikke for den menneskelige NAMPT primere (fremad: ATC CTG TTC CAG GCT ATT CTG, reverse: CCC CAT ATT TTC TCA CAC GCA T).

XF (ekstracellulær flux) bioenergetic analyse

XF24 ekstracellulær Flux Analyzer fra Seahorse Bioscience (N. Billerica, MA) blev anvendt til ekstracellulære væske bioenergetic analyse [25]. Under typiske

in vitro

celle dyrkningsbetingelser, ekstracellulær forsuring sats (ECAR) er bidraget med mælkesyre produktion som følge af glykolyse. For at undersøge den aerobe glycolyse, fem biologiske replikatkulturer kontrolmetoder (3 × 10

4) og fem uafhængigt genererede DR-celler (3 x 10

4) blev udpladet i hver brønd i XF 24 dyrkningsplade og celler blev inkuberet natten over ved 37 ° C i nærvær af 5% CO

2. Alle kulturer blev undersøgt i XFAssay medier i fravær af CO

2. Niveau af ECAR blev normaliseret til proteinindholdet.

Kvantificering af Nampt, ATP og NAD

+ /NADH

intracellulære Nampt niveauer blev målt ved hjælp af en Visfatin C-terminal (Human) VVM kit (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA, USA). ATP-niveauer i celler blev analyseret under anvendelse af Bioluminescent ATP Somatisk celle assaykit (FLASC, Sigma-Aldrich selskab) og kolorimetrisk ATP assay kit (Abcam, Cambridge, MA) ifølge fabrikantens instruktion. NAD

+ /NADH blev målt ved hjælp af NAD

+ /NADH assay kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan og Bio Assay Systems, Hayward CA) efter producentens anvisninger. Niveauer af Nampt, ATP og NAD

+ /NADH blev normaliseret til proteinindholdet.

Statistik

Alle analyser blev udført i 3-6 replikerer i mindst tre uafhængige forsøg. Data er vist som middelværdi ± SEM (standard error af middelværdien).

s

værdier blev bestemt ved at sammenligne data fra eksperimentelle versus kontrol celler fra mindst tre uafhængige forsøg eller seks replikater af det samme eksperiment. Midler og

s

værdier for eksperimentelle data blev analyseret ved at udsætte data til de to halet t-test. Data, der involverer mere end to grupper blev tilgås af envejs ANOVA med Bonferroni test for post-hoc analyse.

s

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

s

Værdier vises som 0,05 (*), 0,005 (**) eller . 0,0005 (***)

Resultater

Den generation af H

2S stiger som reaktion på stress

i modsætning til tidligere rapporter, hvor H

2S er blevet målt i cellelysat, vi udnyttet H

2S-elektrode til måling af frigivelsen af H

2S fra intakte celler. Vi fandt, at mængden af ​​H

2S frigivet fra celler var signifikant højere end målt i homogeniserede celleekstrakter (data ikke vist). I sammenligning med niveauerne af H

2S frigivet fra 293-celler og fibroblaster, cancerceller (HepG2, MDA-MB-231, MDA-MB-435s), der produceres signifikant mere H

2S (figur 1A). Vi udsatte epitelcancerceller af forskellig oprindelse (lever, bryst, og melanocyt) til barske betingelser, der findes i tumormikromiljøet, hvilket alle føre til celleskader herunder hypoxi (

H), glucose deprivation (

G-) og hydrogenperoxid (

H2O2). H

2S generation blev forøget i cancerceller som reaktion på akut stress såsom hypoksi, bleomycin, hydrogenperoxid og glucose deprivation (figur 1B). Stressrelaterede stigning i H

2S frigivet fra cancerceller var associeret med forøgelse af cystathionin beta-syntase (CBS), en af ​​de enzymer, der driver H

2S produktion, samtidig med stigningen i stress og apoptose-relaterede Bax og γH2AX , hvilket er en kritisk faktor for S /G

2 DNA-beskadigelse checkpoint kompleks (figur 1C, D). Interessant, stress induceret elevation i H

2S produktion korreleret med sværhedsgraden af ​​skader (figur 1E).

(A) Beløb af H

2S frigivet af 293 celler, fibroblaster (Fibro.), HepG2, MDA-MB-231 og MDA-MB-435s celler. (B) Niveauerne af H

2S i HepG2, MDA-MB-231 og MDA-MB-435s Pc celler udsat for hypoxi (0,5% O

2, 18 timer), glucose deprivation (glukose fri medium, 18 timer) eller behandling med bleomycin (35 nM, 18 timer), H

2O

2 (800 uM, 3 timer). Data er udtrykt som procent af H

2S frigivet fra ubehandlede celler. (C) Intracellulær CBS og Bax (venstre panel) vurderet ved Western blot-analyse i MDA-MB-435s PC celler, og PC celler behandlet med 400 eller 800 pM af H

2O

2 i 3 timer. (D) Niveauet for CBS og γH2AX med eller uden behandling med H

2O

2 (800 uM, 3 timer) i MDA-MB-435s celler. Protein tæthed blev normaliseret ved hjælp β-actin. (E) Mængde af H

2S og cellernes levedygtighed efter behandling med en række koncentration af H

2O

2. *;

s

0,05, **;

s

0,005, ***;

s

. 0,0005

Den øgede generation af H

2S i skader-genvundne celler øger tolerance over for skade

Ordningen i Figur 2A viser den metode, som vi brugte til at generere skaden genvundet kræftceller. Inden 24 timer efter skaden, få levedygtige celler forblev knyttet til kulturen kolben, mens størstedelen af ​​celler adskilt fra kulturen overflade. Beskadigede løsnede celler udviser et højt niveau af H

2S vil kunne begrænse skaden og kan forbedre overlevelsen potentiale (fig S1). For at fjerne de mitotiske celler, vi dyrkede celler i nye dyrkningsbeholdere i 24 timer. For at isolere beskadigede celler, som undlod at binde sig til kultur fartøjer, men havde potentiale til at komme sig skader, overførte vi flydende celler til nye dyrkningsbeholdere at tillade celler, der tilbagesøge skader på binde til kultur substrater. Serielle ugentlige passager af flydende celler til nye dyrkningsflasker tilladt isolering af skader genvundne celler med forskellig restitutionstid. Gennem dette papir, vi refererer til disse celler som skader-genvundet (DR) celler med angivne restitutionstid på én (DR

W1), to (DR

W2) eller tre uger (DR

W3) fra skader, mens vi henviser til de forældrekontrol celler som Pc-celler (figur 2A). Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at adskille de tre populationer af celler, der afspejler den tid der kræves til nyttiggørelse. For at vurdere, om isolerede DR celler genvundet fra skade, undersøgte vi ekspressionen af ​​pro-apoptotisk molekyle, Bax. DR celler viste et fald i Bax udtryk i en restitutionstid afhængig måde som en indikation for reparation, mens som forudsagt, Pc celler udsat for H

2O

2 for 3 timer (akut skade) udtrykte et højt niveau af Bax (Figur 2B). Endvidere cancerceller udvundet fra skader udviste også en øget produktion af H

2S sammenlignet med de ubeskadigede PC celler i en restitutionstid afhængig måde (figur 2C, D). Da endogen hydrogensulfid genereres af tre enzymer, CBS, CTH og MST, vi undersøgte mRNA og protein niveauer af disse enzymer i Pc og DR celler. Som vist i figur 2E, mRNA-niveauer af CBS og CTH steg i DR-celler også i en restitutionstid afhængig måde. Men MST var fraværende i Pc eller DR celler. I forhold til forældrenes ubeskadigede Pc celler, havde kræftceller inddrives fra skader øget CBS og CTH proteiner i direkte sammenhæng med tilbagebetalingsperioden. Blandt DR celler, disse celler med en længere restitutionstid mod beskadigelse viser den højeste opregulering af CBS og CTH (figur 2F). CBS blev opreguleret op til to gange efter helbredelse fra skader fremkaldt af glukose afsavn, hypoxi og hydrogenperoxid (Figur 2G). I forhold til Pc celler, DR celler genererer højere niveauer af H

2S havde en højere spredning sats og viste en højere grad af tolerance over for skader fremkaldt af bleomycin (Figur 2H, I). Disse resultater viser, at i celler udvundet fra skader, H

2S produktion kan spille en rolle i deres øget tolerance over skader.

(A) en ordning for isolering af Damage-inddrives (DR) celler. (B) Bax udtryk i H

2O

2 behandlede Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2-celler. (C) Mængde af H

2S frigivet af DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2-celler. Betydning mellem Pc og tre DR celler var

s

0,0005 i ANOVA statistisk analyse. (D) H

2S farvning af Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2 celler med 5 uM H

2S fluorescerende probe, HSN2. Målestokke 50 uM. (E) PCR-analyse af

CBS

,

CTH

og

MTS

gener i Pc, DR

H2O2 W1 og DR

H2O2 W3 HepG2-celler. (F) Western blot analyse af CBS og CTH i Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2-celler. (G) Western blot analyse af CBS i Pc og DR

H2O2 W1, DR

H W1 og DR

G W1 HepG2-celler. (H) spredning af HepG2 genvundet fra H

2O

2, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 celler som en procentdel af det i Pc celler. (I) levedygtighed Pc, DR

H2O2 W1 og DR

H2O2 W2 HepG2-celler med og uden behandling med bleomycin. *;

s

0,05, **;

s

0,005, ***;

s

. 0,0005

DR celler udviser øget glykolyse og forbedrede cellulære bioenergetik

Fordi hurtigt delende celler vedtage aerob glykolyse at fremme en øget biomasse efterfulgt af celle division, undersøgte vi niveauet for centrale glycolytiske mellemprodukter og enzymer i celler udvundet fra skader. DR-celler viste en forhøjet ekstracellulær forsuring rate (ECAR), som er en indikator for niveauet af glycolyse (figur 3A). DR-celler generere høje niveauer af H

2S havde en bedre bioenergetic profil som vist ved forøget niveau af cellulær ATP (figur 3B).

(A) ECAR i Pc HepG2-celler behandlet med eller uden 800 pM af H

2O

2 og DR

H2O2 W2 HepG2 celler. (B) ATP i Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2-celler. Betydning mellem Pc og tre DR celler var

s

0,005 i ANOVA statistisk analyse. (C) NAD

+ niveauer i Pc HepG2 (med eller uden H

2O

2), DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2-celler. NAD

+ blev normaliseret til det niveau af totalt protein. Betydning mellem Pc og der DR celler var

s

0,005 i ANOVA statistisk analyse. (D) NAD

+ niveauer i Pc og DR

H W1 HepG2-celler. (E) Western blot analyse af intracellulær Nampt og CBS i Pc og DR

H2O2 MDA-MB-231 celler. (F) Nampt niveauer vurderes ved ELISA i Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2 celler. Betydning mellem Pc og tre DR celler var

s

0,05 i ANOVA statistisk analyse. (G) Sammenhæng mellem Nampt udtryk og produktion af H

2S og niveau af ATP i Pc, DR

H2O2 W1, DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2-celler. Betydningen af ​​H

2S og Nampt var

s

0,05, og betydningen af ​​ATP og Nampt var

s

0,05 i ANOVA statistisk analyse. *;

s

0,05, **;

s

0,005, ***;

s

. 0,0005

For at imødegå, om undertrykkelse af glykolyse dæmper H

2S produktion, vi målte H

2S niveau i DR celler behandlet med HK1 inhibitor, 100 uM bromopyruvic syre, eller LDH-A inhibitor, 1 mM natrium oxamatet, for 15 timer. Som vist i figur S2, var der ingen statistisk signifikant forskel i niveauet af H

2S efter behandling med enten bromopyruvic syre eller natrium oxamat, hvorimod, som forventet, glycolytiske aktivitet blev væsentligt formindsket af begge inhibitorer. Disse data indikerer, at glycolytiske enzymer ikke regulere H

2S-Nampt kredsløb.

Celler inddrives fra skade stærkt påberåbt glykolyse, at øget efterspørgsel efter NADH /NAD

+. Derfor, som et mål for den bioenergetic tilstand, evaluerede vi niveauerne af NAD

+ og NADH. Selvom akut skade førte til et fald i niveauet af NAD

+, NAD

+ blev øget betydeligt i kræftceller, der inddrives fra skader fremkaldt af H

2O

2 og hypoxi (figur 3C, D ; fig S3). Reduceret form af NAD

+, NADH, blev øget betydeligt i DR-celler (Figur S4).

Nampt, som er nødvendig for NAD

+ syntetisk bjærgning vej [24], blev øget væsentligt på opsving i DR celler og denne stigning faldt sammen med opregulering af H

2S genererer CBS (figur 3E). DR celler med længere restitutionstid fra skade viste den største stigning i Nampt (figur 3F). Endvidere fandt vi, at Nampt niveauer korreleret med både niveauet af H

2S frigivet fra celler (R

2 = 0,9,

s Restaurant 0,05) og det intracellulære niveau af ATP (R

2 = 0,94,

s

. 0,05) (Figur 3G)

Sammen disse resultater viser, at kræftceller udvundet fra skader generere et højt niveau af H

2S og Nampt, og at de er stærkt afhængige af produktionen af ​​H

2S og aerob glykolyse for deres effektive stofskifte.

H

2S, i en dosisafhængig måde, opregulerer Nampt, stiger aerob glykolyse og giver cytoprotektion

for yderligere at vurdere betydningen af ​​H

2S i erhvervelse af nye metaboliske egenskaber blev Pc celler behandlet med H

2S donor, NaHS. Svarende til vores observationer i DR-celler (figur 3A), behandling med NaHS forbedrede ECAR på en dosisafhængig måde, øget ATP og NAD

+ output og førte til betydelig stigning i niveauet af Nampt (figur 4A-F). I overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at H

2S giver cytoprotektion [8], [26], Pc celler forbehandlet med NaHS udstillet en højere modstand over for skader fremkaldt af enten hydrogenperoxid eller bleomycin (Figur 4G).

(A) ECAR i Pc HepG2-celler behandlet i 48 timer med 0, 1, og 100 uM af NaHS og DR

H W1 HepG2-celler. Sammenligning (B) af ATP i Pc HepG2-celler behandlet i 48 timer med 0, 10 og 100 uM af NaHS, DR

H2O2 W1 HepG2-celler og PC MDA-MB-231-celler behandlet i 48 timer med 0, 10 og 100 uM af NaHS. Data udtrykkes som procent af niveauet af ATP i ubehandlede celler. (C) Niveauer af NAD

+ i HepG2 og MDA-MB-231 PC celler behandlet med 0, 10 og 100 uM af NaHS i 48 timer. (D) Western blot-analyse af intracellulær Nampt i MDA-MB-231 PC celler behandlet i 48 timer med 0 og 100 uM af NaHS. (E) qPCR-analyse af

NAMPT

udtryk i Pc HepG2-celler behandlet i 48 timer med 0 og 100 uM NaHS. (F) Kvantificering af intracellulær Nampt ved ELISA i Pc HepG2-celler behandlet i 48 timer med 0, 10 og 100 uM af NaHS. (G) Levedygtighed i HepG2-celler forbehandlet i 24 timer med 0, 1, og 10 mM NaHS og derefter underkastet H

2O

2 (800 uM) eller bleomycin (35 nM, 18 timer). Levedygtighed blev bedømt ved trypanblå eksklusion. *;

s

0,05, **;

s

0,005, ***;

s

. 0,0005

Sammen vores resultater viser, at opregulering af H

2S og Nampt fører til glycolyse og bioenergetic ændringer er vigtige mekanismer i udviklingen af lægemiddelresistens og overlevelse af kræftceller.

H

2S-Nampt vej regulerer bioenergetik i DR celler

for yderligere at behandle forholdet mellem Nampt og H

2S produktion, DR celler blev behandlet med en inhibitor af Nampt, FK866. Behandling af celler med 200 nM af FK866 påvirkede ikke cellernes levedygtighed indikerer fravær af FK866 cytotoksicitet ved denne dosis i HepG2 (fig S5). Undertrykkelse af Nampt ved sin inhibitor, FK866, samt hæmning af CTH af D, L-propargylglycin (PAG), førte til nedsat H

2S produktion (figur 5A). I overensstemmelse med en sådan ændring i H

2S produktion, blev udtryk for både CBS og CTH svækket ved behandling af celler med FK866 (figur 5B, C). Niveauet af ATP blev også signifikant reduceret ved behandling af DR-celler med PAG og FK866 (figur 5D, E). Denne reduktion af ATP var i overensstemmelse med tidligere undersøgelse, der viser, at inhibering af Nampt af FK866 undertrykt produktionen af ​​ATP i ovariecancerceller [27]. Interessant behandling af DR-celler med inhibitor af CBS (CHH) og inhibitor for CTH (PAG) reducerede Nampt (figur 5F). Disse data tyder på, at Nampt kan fungere som en stimulator af H

2S-produktionsbedrifterne enzymer og dermed produktionen af ​​H

2S, mens H

2S forårsager opregulering af Nampt.

(A ) Mængde af H

2S frigivet fra DR

H W1 HepG2 celler behandlet med CTH-hæmmer, PAG (100 uM, 18 timer), og Nampt inhibitor, FK866 (200 nM, 24 timer). (B) Western blot-analyse af CBS i DR celler i fravær og nærvær af FK866 (200 nM, 24 timer). (C) Western blot-analyse af CTH i DR celler i fravær og nærvær af FK866 (200 nM, 24 timer). (D) ATP i DR

H2O2 W3 HepG2 celler i fravær (-) og tilstedeværelse (+) af PAG (100 um, 18 timer). (E) ATP i Pc, DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2 celler i fravær og tilstedeværelse af FK866 (200 nM, 24 timers). (F) Western blot-analyse af Nampt i DR

H2O2 W2 og DR

H2O2 W3 HepG2 celler behandlet med CBS-inhibitor, CHH (500 uM, 18 timer) eller CTH inhibitor, PAG (100 uM, 18 timer). *;

s

0,05, **;

s

0,005, ***;

s

. 0,0005

Tilsammen vores resultater viser, at opregulering af H

2S og Nampt og deres crosstalk forbedre bioenergetic effektivitet og lette inddrivelsen fra skader.

Ophobning af H

2S fører til højere glykolysen, bedre bioenergetik og øget spredning i skader genvundet kræftceller isoleret fra

in vivo

dyrket tumorer

for at identificere, om celler ligner

in vitro

eksisterer genereret DR-celler eller kan genereres i tumorer blev epitelcancerceller inokuleret i athymiske nøgne mus. Vi isoleret levedygtige cancerceller (T

V) og skader udvundet (T

DR) -celler, som beskrevet i vor tidligere undersøgelse [23]. T

DR celler isoleret fra

in vivo

genererede tumorer viste ophobning af H

2S samt øget udtryk for CBS og CTH (figur 6A, B). Svarende til

in vitro

data, niveauerne af NAD

+ og Nampt blev forhøjet i T

DR celler sammenlignet med niveauerne detekteret i Pc og T

V-celler (figur 6C, D). ECAR blev forøget i T

DR-celler og disse celler viste en bedre bioenergetic profil som vist ved øget niveau af ATP og en højere proliferationshastighed (Figur 6E-G).

(A) H

2S niveauer i T

V og T

DR celler isoleret fra HepG2 tumorer dyrket

in vivo

. (B) Ekspression af CBS og CTH i T

V og T

DR celler. (C) NAD

+ niveauer i T

V og T

DR celler isoleret fra HepG2 tumorer dyrket

in vivo

. (D) Nampt niveauer i T

V og T

DR celler isoleret fra HepG2 tumorer dyrket

in vivo

. (E) ECAR i T

V og T

DR celler isoleret fra HepG2 tumorer dyrket

in vivo

udtrykt som procent af ECAR niveauet i Pc. (F) ATP-niveau i levedygtige tumorceller (T

V) isoleret fra HepG2 tumorer dyrket

in vivo

udtrykt som procent af ATP-niveauet i Pc. (G) spredning af T

V og T

DR celler isoleret fra HepG2 tumorer dyrket

in vivo

udtrykt som procent af spredning af Pc. Celler blev podet i en koncentration på 2 × 10

4, og det samlede antal celler blev vurderet efter 24 og 48 timer af kultur. (H) En ordning for H

2S-Nampt afhængig bioenergetic kredsløb. Cell skader fører til øget H

2S og Nampt der sideordnet føre til metaboliske ændringer. Disse celler udviser eksponentiel vækst og tolerance over for skader. *;

s

0,05, **;

s

0,005, ***;

s

. 0,0005

På baggrund af disse resultater, foreslår vi en ordning, hvorved cancerceller inddrives fra skade ændre deres metaboliske profil via opregulering af H

2S- Nampt pathway (figur 6H). Således H

2S-Nampt afhængige energisk kredsløb er en kritisk regulator af stress tolerance, øget glykolyse, forbedrede bioenergetik og øget celleproliferation.

Diskussion

Den endogene produktion af H

2S er stærkt opreguleret i epitel kolorektale og prostatacancerceller, samt i tumorafledte endotelceller [28], [29]. I tråd med dette beviser, viser vi, at epiteliale kræftceller (lever, bryst, hud) innately producere store mængder af hydrogensulfid uafhængigt af deres oprindelse. H

2S øges yderligere i kræftceller på akut skade induceret af hypoxi, hydrogenperoxid og bleomycin, eller efter nyttiggørelse fra skade som følge af forøget ekspression af H

2S-producerende enzymer,

CBS

og

CTH

.