PLoS ONE: Cystein (C) -X-C receptor 4 gennemgår Transportin 1-Dependent Nuclear Lokalisering og Forbliver Functional på Nucleus af metastatisk prostatacancer celler

abstrakt

G-protein-koblet receptor (GPCR), cystein (C) -X-C receptor 4 (CXCR4), spiller en vigtig rolle i prostatacancer metastaser. CXCR4 betragtes generelt som en plasmamembranreceptor, hvor den transmitterer signaler, der understøtter transformation, progression og eventuel metastase. På grund af den centrale rolle CXCR4 i tumorigenese, terapi tilgange såsom antagonist og monoklonale antistoffer har fokuseret på receptorer, der findes på plasmamembranen. Var et nyt koncept for G-protein-koblede receptorer, er, at de kan lokalisere til og associeret med kernen, hvor de bevarer funktion og mediere nukleare signalering. Heri, viser vi, at CXCR4 forbundet med kernen af ​​maligne prostata cancer væv. Ligeledes ekspression af CXCR4 blev detekteret med nukleare fraktioner blandt flere prostatakræft-cellelinier, sammenlignet med normale prostata-epitelceller. Vores undersøgelser identificeret en nuklear pulje af CXCR4 og vi definerede en nuklear vej transport for CXCR4. Vi afslører en formodet nuklear lokalisering (NLS), ‘RPRK «i CXCR4, der bidrog til den nukleare lokalisering. Derudover nuklear CXCR4 interageret med Transportinβ1 og Transportinβ1-binding til CXCR4 forfremmet sin nukleare translokation. Vigtigere er det, G

αi immunpræcipitation og calcium mobilisering undersøgelser viste, at nukleare CXCR4 var funktionelle og deltog i G-protein-signalering, afslører, at den nukleare pulje af CXCR4 bevaret funktion. I betragtning af den antydning af, at funktionelle, nuklear CXCR4 kan være en underliggende mekanisme prostatakræft tilbagefald, øget metastatisk evne og dårligere prognose efter tumorer er blevet behandlet med terapi, der er målrettet plasmamembranen CXCR4, disse undersøgelser omhandler en hidtil ukendt mekanisme af nuklear signalering for CXCR4, et hidtil ukendt mekanisme af klinisk målretning og demonstrere et aktivt nukleare pulje, der giver vigtig ny viden til at belyse, hvad der har været primært kliniske rapporter om nuklear CXCR4

Henvisning:. Don-Salu-Hewage AS, Chan SY, McAndrews KM, Chetram MA, Dawson MR, Bethea DA, et al. (2013) Cystein (C) -X-C receptor 4 gennemgår Transportin 1-Dependent Nuclear Lokalisering og Forbliver Functional på Nucleus af metastatisk prostatacancer Cells. PLoS ONE 8 (2): e57194. doi: 10,1371 /journal.pone.0057194

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: 20. november 2012; Accepteret: 18 januar 2013; Publiceret: 28 feb 2013

Copyright: © 2013 Don-Salu-Hewage et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet, delvist af National Institutes of Health giver 2R25GM060414, P201MD002285 (CVH), F31CA153908 (MAC), 2G12RR003062-22 (CVH) og AAAS Kvinders internationalt forskningssamarbejde (WIRC) for Minority Serving institutioner (MSI), en National Science Foundation tilskud (CVH). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den næststørste årsag til øget kræftforekomst og kræftrelaterede dødsfald blandt mænd i USA [1], [2]. Trods behandling, er de høje dødelighed i PCa tilskrives metastase, hvilket er den største hindring i PCa behandling [3]. Adskillige molekyler og mekanismer bidrager til kræftcelle metastase. For eksempel kemotiltrækkende cytokiner (kemokiner) forbedrer metastatiske potentiale PCa ved binding og aktivering af en familie af G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) [4], [5], [6], [7], indlede signaler kan forbedre celle adhæsion, invasion og bevægelse, og efterfølgende, tumor overlevelse på den nye lokalitet af metastase. GPCR’er udgør den største familie af transmembrane plasmamembran (PM) receptorer [8]. I konventionel GPCR signalering, er receptorer lokaliseret til PM og påvirke aktiviteten af ​​PM-lokaliserede enzymer, ionkanaler og /eller sekundære budbringere. Deres aktivering med en passende ligand udløser signalering via G-protein-alfa (G

α) og /eller beta-gamma (G

βγ) underenheder [9], hvilket fører til kontekstafhængige resultater, som kan positivt og /eller negativt regulere aktiviteten af ​​effektormolekyler i signalering kaskader i cellen [10], [11]. Derudover aktiverede GPCRs også udløse en serie af molekylære interaktioner, der giver mulighed for feedback regulering af G-protein-kobling og receptor endocytose at dæmpe receptor signaler [12], [13], [14], [15], [16], [17 ], [18]. Müller

et al

. beskrevet første gang involveringen af ​​chemokin GPCR receptorer i cancermetastase [19] og Akashi

et al.

rapporterede, at chemokin GPCR, CXCR4, blev stærkt udtrykt i human malign PCa forhold til normal prostata [20]. Talrige undersøgelser har dokumenteret inddragelsen af ​​CXCR4 i vigtige trin i PCa metastase: (i) signaler; [21], [22]; (Ii) invasion og migration [23]; og (iii) oprettelse af en vaskulær netværk [24]. Derfor har flere terapeutiske midler til cancerceller metastase blevet designet til at antagonisere CXCR4-medieret signalering [25], [26]. I konventionel CXCR4 signalering, stromal celleafledt faktor 1 alfa (SDF1α) er den eksklusive ligand for CXCR4 [27], hvilket fører til aktivering af veje gør denne receptor gunstigt for tumorigenese: (i) G-protein-koblet receptor (GPCR) signalering ; (Ii) PI3K /AKT; (Iii) MAPK; (Iv) JAK /STAT; (V) Src kinase og (vi) HER2 [28], [29], [30].

Det er interessant, er blevet detekteret GPCRs i subcellulære organeller adskiller sig fra sin klassiske PM sted [31]. Disse organeller omfatter Golgi-apparatet [32], endoplasmatisk reticulum [33], cytoskelettet [34] og kernen /kernemembranen [35]. Hanyaloglu og von Zastrow postuleres, at standard genanvendelse af GPCR’er ved endosomer kan bidrage til øget re-levering af GPCR’er til PM, eller til alternative organeller i cellen, uden at ødelægge deres signalering kapacitet [36]. Ikke desto mindre er disse skiftevis-lokaliserede GPCR receptorer afslører et nyt niveau af kompleksitet, der kan være vigtige i at modulere deres funktion. Der er observeret et stigende antal GPCR’er i kernen eller kernemembranen, såsom lysophosphatidsyre receptorer, metabotropiske glutamatreceptorer, blodplade-aktiverende faktor receptorer, angiotensin 2 type I receptorer, prostaglandin receptorer, endotelinreceptorer, Gonadotropin Releasing Hormone type I receptoren [ ,,,0],37] og

β

adrenerge receptorer [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44]. Nukleare GPCR’er er blevet foreslået at regulere en række fysiologiske processer, herunder celleproliferation, overlevelse, inflammatoriske responser, tumorgenese, DNA-syntese og transkription [43], [45], [46], [47], [48], [49 ], [50]. Nukleare GPCR’er kan være konstitutivt aktiv, eller aktiveret af interne, nyligt syntetiserede ligander, der er bundet til sekretion [51]. Efterfølgende klassiske second messenger signalveje, såsom adenylylcyclase-induceret proteinkinase A (PKA) aktivering [38], phospholipase-induceret frigivelse af intranucleær calcium, diacyglycerol-induceret proteinkinase C (PKC) [39], [52], ERK1 /2, p38 MAP-kinaser og proteinkinase B (PKB) [49], [50] har vist sig at blive aktiveret af nukleare GPCR’er.

Nuclear lokalisering af proteiner er dikteret af nuklear import og eksport gennem nuklear pore komplekser [53]. Små proteiner ( 30-50 kDa) kan passere gennem kerneporen ved fri diffusion; Men de fleste lastproteiner kræver aktiv transport at komme ind i kernen [54]. Større proteiner bruger aktive transportmekanismer, som kræver bistand transportproteiner [55], [56], [57]. Mange proteiner målrettet mod kernen indeholder en klassisk nukleært lokaliseringssignal (NLS), som genkendes af en heterodimer import receptor består af importin alfa og importin beta. Mange af disse receptorer direkte genkende lastproteiner og målrette dem direkte til den nukleare pore [58]. I tilfælde af denne store familie, de målretningssignaler i skibets proteiner ofte ikke veldefineret [59]. Hvert protein, der lokaliserer til kernen skal have en funktionel NLS eller er forpligtet til at binde til lastproteiner som besidder en NLS (s). Importin alfa genkender NLS i bagagerummet protein mens importin beta henvender import komplekse til den nukleare pore [58], [60]. Importin beta er del af en større familie af transport receptorer ofte betegnes importins /exportins [59].

Mens en formodet NLS er blevet identificeret i CXCR4 [61], funktionen af ​​denne nukleare målrettet signal i forbindelse med CXCR4 er ikke blevet undersøgt. En særskilt importin-afhængige transport pathway har været impliceret i transporten af ​​C-C kemokinreceptor type 2 (CCR2) [62]. Favre

et al

. fandt, at en manipuleret, HA-mærket CCR2 forbundet med et medlem af importin familie af nukleare transport receptorer, Transportinβ1 (TRN1), i en CCR2-nul-cellelinje [62]. En vekselvirkning af CCR2 med TRN1 var forpligtet til at opdage CCR2 med nukleare fraktioner, hvilket tyder på, at CCR2 transporteres til kernen via TRN1 [62]. TRN1 har været impliceret i GPCR-internalisering og desensibilisering [63]. Desuden TRN1 tjener som en receptor for NLS-null proteiner i NLS-holdige fragt substrater [64], hvilket gør den til et vigtigt protein til import gennem den nukleare pore kompleks [65]. Tilsammen disse undersøgelser tyder på, at både den klassiske maskiner og TRN1 kerneimport er kandidater, der spiller en rolle i CXCR4 nukleare translokation [66].

Nuclear CXCR4 proteinekspression er blevet observeret i ondartet hepatocellulær, colorectal, renal celle og nasopharyngeale carcinomer [67], [68], [69], [70]. Disse undersøgelser, men blev rapporteret som kliniske observationer, og undlod at undersøge mekanismerne i CXCR4 lokalisering eller enhver biologisk funktion i forbindelse med den nukleare receptor. Disse data er i overensstemmelse med rapporter, der har vist funktionelle GPCR’ere forbundet med kernen, og yderligere bidrage til løbende kræft terapeutiske interventioner mod CXCR4. Vigtigere er det, kan en funktionel nuklear CXCR4 bidrage til PCa tilbagefald trods de nuværende antagonister og monoklonale antistoffer mod PM-bundet CXCR4 og må ikke være designet til at krydse PM, som ville være nødvendige for at modvirke aktiv CXCR4 på kernen. Desuden identifikation af transportveje kræves for nuklear lokalisering af CXCR4 kan afsløre yderligere mål for terapeutisk udvikling at hindre prostatakræft metastase og forbedre patientens overlevelse.

Materialer og metoder

Cell Culture, antistoffer og reagens betingelser

PC3, DU145, 22RV1 humane prostatakræft-cellelinier (PCA), blev RWPE1 human prostata-cellelinje og 293T humane embryonale nyre cellelinje opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). PC3, blev DU145, 22RV1 og 293T-celler opretholdt i komplet RPMI medier: RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% antibiotisk-antimykotisk ved 37 ° C i 5% CO

2. RWPE1 celler blev holdt i keratinocyt serum-frit medium (KSFM) indeholdende 50 mg /ml gentamycin, 0,05 mg /ml bovin hypofyse (BPE), og 5 ng /ml epidermal vækstfaktor (Invitrogen) ved 37 ° C i 5% CO

2. Alle celler blev holdt ved 60% til 80% konfluens. PC3-celler blev oprindeligt isoleret fra en prostata vertebral metastase, mens DU145 celler blev opnået fra prostata hjernemetastaser. 22RV1 celler fra en human prostatacarcinom epitelcellelinie afledt af en xenograft der blev serielt opformeret i mus, og RWPE1 celler blev isoleret fra normal human prostata epitel. Cellekultur forsyninger og kanamycin-sulfat (61-176-RG) var fra MediaTech; SDF1α (300-28A) var fra PeproTech. Følgende reagenser og humane antistoffer var fra Cell Signaling: 10 × cellelyse-buffer (9803), muse anti-kanin IgG (5127), anti-CD44 (156-3C11), anti-GFP (2956S) og anti-G

αi (5290). Anti-CXCR4 (MAB172) var fra R 1 ug pr 250 ug protein), efterfulgt af inkubation med protein A /G Plus-agaroseperler i 2 timer ved 4 ° C. Proteinbundne agaroseperler blev separeret fra lysater af en række 3 vaske med 1 × PBS og centrifugering (max speed /2 min /stuetemperatur [RT]). Perler i Lammelli puffer blev adskilt ved 10% SDS-PAGE, overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner og probet for CXCR4-IgG2b (1:1000). For at bekræfte, at PC3 celler udtrykte Fibronectin, 25 ug hele cellelysat blev høstet for western blot analyse. Beta-actin blev anvendt som en loading kontrol.

Immunhistokemi (IHC)

IHC analyse blev udført på en prostata sygdom spektrum vævsarray (Biomax) strækker sig fra normal til høj kvalitet metastatiske væv. Grupperingen bestod af 80 total vævskerner herunder adenocarcinom, metastatisk, hyperplasi, kronisk inflammation, tilstødende normale væv og normalt væv. Hver enkelt kerne havde en diameter på 1,5 mm og en tykkelse på 0,5 um. Kort fortalt blev formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver hentet i vaske xylen, ethanol og antigen-genvinding opløsning, pH 6,0, (Biocare Medical) ved 125 ° C i 30 sek. Prøver blev neutraliseret i 0,3% hydrogenperoxid i 15 minutter ved stuetemperatur (RT), vasket med 1 × PBS i et fugtigt kammer og blokeret med blokerende opløsning (5% normalt gedeserum /Tris-bufret saltvand /Tween-20; TBST) i 30 min. CXCR4 blev påvist med et muse-anti-humant CXCR4 monoklonalt antistof (R 1:1000) i blokeringsopløsning natten over ved 4 ° C, efterfulgt af et biotinyleret affinitetsoprenset ged anti-mus IgG (H + L) sekundært antistof ( vector Laboratories; 1:1000), i blokerende opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur. Prøver blev vasket grundigt mellem inkubationer, udviklet i diaminobenzidin (Vector Laboratories) i 3 minutter ved stuetemperatur, og modfarvet med Meyers hematoxylin anvendelse af standardteknikker. En negativ kontrol vævsprøve blev fremstillet ved inkubering i biotinyleret affinitetsoprenset ged anti-mus IgG (H + L) antistof, kun, som beskrevet ovenfor. Prøverne blev analyseret og fotograferet af Dr. Dezhi Wang [71] ved Center for Metabolic Bone Disease Core Laboratory, UAB School of Medicine, Birmingham, Alabama. Fordelingen af ​​positive celler for CXCR4 blev registreret til at skildre den diffuse eller fokal karakter af de positive celler som sporadiske (positive celler 5%); fokale (positive celler 11%, men mindre end 50%); eller diffuse (positive celler 50%). efter den gennemsnitlige tæthed af positive celler for CXCR4 (DAB farvet), for at se den åbenlyse forskel i styrken af ​​CXCR4 udtryk

Histomophometry Måling af Farvning Intensitet for CXCR4 i Prostata Cancer Væv

Den gennemsnitlige tæthed af positive celler (DAB farvet) blev målt ved hjælp af Bioquant® billedanalyse Software (RtmBometrics) og et Olympus BX51 mikroskop med en Q-Imaging kamera. Softwaren analyserede en gennemsnitlig gruppe af pixels og returnerede en data værdi baseret på farveværdi af pixels i farvede prøver. Tre tilfældige områder af prostatavæv blev udvalgt ved en forstørrelse på (400X) for hver sektion baseret på størrelsen af ​​vævet. I hver tilfældig område, blev disse celler (en gruppe af pixels), der blev farvet positivt (brun) med CXCR4 antistof udvalgt af tærskelværdiansættelse værktøjet af softwaren. prøve lyskilde er kendt for at påvirke densitetsmåling; derfor blev alle sektioner målt anvender samme baggrund korrektion leveret af Bioquant.

Subcellulær Fraktionering

PCa og normale prostata-epitelceller (1 × 10

6) blev serum-udsultet i 3 hrs (22RV1 og RWPE1) eller 24 timer (PC3 og DU145), forud for behandling med SDF1α (100 ng /pl) i 30 min. Subcellulære fraktioneringer blev udført ifølge producentens instruktioner (Thermo Scientific). Kort fortalt blev cellerne lyseret i en serie af buffere og centrifugeringstrin for at opnå en ikke-nukleare fraktion og en intakt nukleare pellet efterfulgt af yderligere lysering at isolere kerneproteiner. Fyrre til hundrede mikrogram nukleare og ikke-nukleare fraktioner blev separeret ved SDS-PAGE-elektroforese og overført til PVDF-membraner. Ekspression af CXCR4 eller GFP-CXCR4 fusionsproteinet blev detekteret med et monoklonalt muse GFP-antistof (Santa Cruz, 1:500) eller anti-humant CXCR4 antistof (R 1:1000). Anti-topoisomerase I (Santa Cruz, 1:1000) og anti-CD44 (Cell Signaling; 1:1000) antistoffer blev anvendt til at sikre integriteten af ​​fraktioner og som indlæsning kontroller. Røntgenfilm blev scannet og Mængde One-software program blev anvendt til densitometrianalyse.

Indirekte Immuncytokemi (ICC) for CXCR4

Celler (3 × 10

5) blev udpladet på glas dækglas (Fisher), serum-udsultet som beskrevet, før behandlinger med SDF1α (100 ng /pl). Celler blev fikseret med iskold 100% methanol i 5 minutter ved -20 ° C og vasket med 1 × PBS. Uspecifikke proteiner blev blokeret i blokeringsopløsning (3% normalt donkey serum /1% BSA /0,1% Triton X-100 i 1 × PBS) i 30 minutter ved stuetemperatur, før inkubation med CXCR4 (R pEGFPN1-CXCR4 tjente som skabelon [72]. De fremadrettede og reverse primere af R146A, R148A og slettede NLS var (Integrated DNA Technologies): (i) R146A: FWD5′-CACGCCACCAACAGTCAGGCACCAAGGAAGCTGTTGGCTG-3 ‘, REV 5′-CAGCCAACAGCTTCCTTGGTGCCTGACTGTTGGTGGCGTG-3′; (Ii) R148A: FWD5`-CCAACAGTCAGAGGCCAGCGAAGCTGTTGGCTGAAA-3 fastsatte stikprøver, REV 5`-TTTCAGCCAACAGCTTCGCTGGCCTCTGACTGTTGG-3 fastsatte stikprøver; og (iii) NLS sletning: FWD5’-CGCCACCAACAGTCAGCTGTTGGCTGAAAAGG-3 ‘og REV5′-CCTTTTCAGCCAACAGCTGACTGTTGGTGGCG-3’. De resulterende plasmider var pEGFPN1-CXCR4R146A, pEGFPN1-CXCR4R148A og pEGFPN1-CXCR4ΔNLS. Positive CXCR4 mutante kloner blev selekteret med kanamycin og yderligere oprenset ved maxi-prep (Omega Bio-tek). Nøjagtigheden af ​​mutationerne blev bekræftet ved DNA-sekventering på en ABI 3130 xl Gene Analyzer Sequencer på Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA.

Forbigående Transfektioner

Forbigående transfektioner blev udført med 2 ug koncentreret DNA og jetPRIME® Polyp transfektion, pr producentens anvisninger. Kort fortalt blev PC3-celler inkuberet med jetPRIME®-DNA-komplekser i 15% FBS /RPMI i 4 timer og blev mediet erstattet med 15% FBS i RPMI i yderligere 18 timer, før serum-udsultning (24 timer). Celler blev derefter høstet for respektive eksperimenter.

Angivelse af Transportinβ1 (TRN1)

Serum-sultede celler (5 x 10

6) blev behandlet med SDF1α i 30 min før høst 60 ug helcellelysater til Western blot-analyse. Ekspression af TRN1 blev påvist med et monoklonalt muse-antistof (Santa Cruz, 1:1000); α-tubulin eller β-Actin blev anvendt som en loading kontrol

Immunopræcipitation

Et milligram PC3 hele cellelysater blev immunpræcipiteret for CXCR4. (Santa Cruz; 1 ug pr 250 ug protein) natten over ved 4 ° C, efterfulgt af inkubation med protein A /G Plus-agaroseperler (Santa Cruz) i 2 timer ved 4 ° C. CXCR4-bundne agaroseperler blev separeret fra lysat af en serie på 3 vaske med PBS og centrifugering ved maksimal hastighed i 1 min ved 4 ° C. Perler blev forarbejdet til western blot-analyse for TRN1 (Santa Cruz, 1:1000) og efterfølgende testet igen for CXCR4 med kanin-anti-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) antistof efterfulgt af inkubation med muse anti-kanin IgG (Cell Signaling) sekundær antistof. Tredive mikrogram af supernatanten opnået efter inkubation med agaroseperler også blev adskilt ved 10% SDS-PAGE, og behandlet til western blot-analyse for CXCR4 som beskrevet i karakterisering af CXCR4 antistof.

lille interfererende RNA transfektion

Transient transfektion af TRN1 specifik siRNA (Santa Cruz) blev udført på PC3-celler udpladet på dækglas under anvendelse JetPRIME®. Kort beskrevet blev celler (2 x 10

5) blev udpladet i 35 mm, 6 brønds skåle og transficeret med 50 nM TRN1-siRNA (Santa Cruz) i 15% FBS /RPMI medium ved 37 ° C i 5% CO

2 i 24 timer. Efterfølgende transficerede celler blev serum-udsultet i 24 timer, før immuncytokemi analyse.

Immunopræcipitation af G

αi

Serum-udsultede celler (5 x 10

6) var behandlet med SDF1α i 30 min før høst for immunfældning. Kort fortalt blev cellerne vasket i 1 × PBS og skrabes forsigtigt i NP-40 lysisbuffer (1 × PBS pH 7,4, 0,1% Triton × 100, 0,1% NP40 og 1 × cocktail inhibitor). Efter 30 minutters inkubation på is blev lysatet centrifugeret ved 600 rcf /5 min /4 ° C). Supernatanten blev forsigtigt dekanteret, og det nukleare pellet blev resuspenderet i lysepuffer, 10 gange volumenet af kerner pellet, og sonikeret på is i 3 sek. Lysatet blev centrifugeret ved 600 rcf /5 min /4 ° C, og 1 mg af supernatant blev immunopræcipiteret for CXCR4 (muse monoklonale, Santa Cruz) natten over ved 4 ° C efterfulgt af inkubering med Protein A /G Plus-agaroseperler ( Santa Cruz) i 2 timer ved 4 ° C. CXCR4-bundne agaroseperler blev separeret fra lysat af en serie på 3 vaske med NP40 lysepuffer og centrifugering (5000 pm /2 min /RT). Den afsluttende vask var med 1 × PBS. Perler blev behandlet for western blot analyse og membraner blev undersøgt for G

αi (Cell Signaling, 1:1000). Efterfølgende blev blots probet for CXCR4 med kanin-anti-CXCR4 (Santa Cruz, 1:500) antistof efterfulgt af inkubation med muse anti-kanin IgG (Cell Signaling) sekundært antistof. Topoisomerase1 (Santa Cruz) og anti-CD44 (Cell Signaling) blev anvendt til at vurdere renheden af ​​kerner lysater.

intranucleær Calcium (Ca

2+) Mobilisering

Serum-udsultede PC3 celler (2,5 x 10

5) blev høstet til opnåelse intakte kerner i NP-40 lysispuffer som beskrevet ovenfor, før udførelse assay ifølge producentens instruktioner (Enzo Life Sciences). Kort fortalt blev ubehandlede isolerede kerner resuspenderet i 100 pi FluoForte farvestof-loading opløsning (Enzo Life Sciences) i 45 minutter ved 37 ° C og 15 minutter ved stuetemperatur og derefter centrifugeret ved 600 rcf /5 min /RT. Opløsninger af AMD3100 (100 ng /pl) og pertussis toksin (PTX) (200 ng /ml) blev fremstillet i calciumfrit, phenol frit RPMI. Kerner prøver blev resuspenderet i 100 pi AMD3100 og PTX, opdelt i alikvoter i sort-walled, klar bund 96 brønd plader, og inkuberet i 1 time. Dernæst blev SDF1α tilsat til prøver i plader, (slutfortynding 100 ng /pi) og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Intranucleær calcium mobilisering blev bestemt ved intensiteten (stigning) i fluorescerende (FluoForte) -bundet Ca

2+ i medierne. Resultater blev målt på en mikropladelæser ved excitation 490 nm og emission 525 nm. Hver prøve blev fremstillet i tre eksemplarer pr eksperiment, og udført mindst tre gange.

Statistisk analyse

Når det er relevant, blev data analyseret af en parret t-test eller ANOVA hjælp af GraphPad Prism (GraphPad ) software. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

CXCR4 udtrykkes i kernen af ​​Prostata Væv

Forrige domæne analyse af CXCR4 foreslået, at CXCR4 indeholder en nuklear signal rettet mod mellem aminosyrerne 90-170 [73]. En bioinformatik analyse under anvendelse af PSORT II NLS forudsigelse software (https://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/) afslørede en formodet kernelokaliseringssekvens, »RPRK ‘[72], [74], [75], [76] mellem aminosyrerne 146-149 i CXCR4 (tabel 1). Derudover en HomoloGene /NCBI databasesøgning for NLS inden CXCR4 afslørede, at »RPRK« er blevet konserveret blandt arter, herunder kylling, mus, chimpanse og andre (tabel 2). Desuden CXCR4 er blevet påvist i kernen af ​​flere cancervæv [68], [70]. Baseret på disse data, testede vi, om der kunne detekteres CXCR4-proteinet i kernen af ​​prostatavæv. Ved hjælp af en prostata væv microarray spænder fra normal til høj kvalitet metastatiske læsioner, vi har registreret positive immunreaktivitet for CXCR4 i prostata prøver. Positiv immunreaktivitet blev detekteret som sporadiske (CXCR4 positive celler 5%), fokale (CXCR4 positive celler 11%, men mindre end 50%) eller diffuse (CXCR4 positive celler 50%), i forhold til den gennemsnitlige samlede densitet af positive celler for CXCR4 (DAB farvet). Prøver med immunohistokemiske snesevis af negativ, svag eller moderat farvning med sporadisk til fokale distributioner, blev anset for at have “lav” udtryk, mens diffuse fordelinger af farvning blev anset for at have “høj” udtryk for CXCR4. Farvningsintensitet var sporadisk til grupper, i kernen af ​​lav kvalitet prostatavæv (fig. 1A), mens høj kvalitet maligne væv (fig. 1A), viste øget farvningsintensitet og diffus ekspression af CXCR4 hele væv sammenlignet med lav kvalitet. I både lave og høje kvalitet tumorer, en fraktion af CXCR4 klart co-lokaliseret med kernen. Farvningsintensitet for CXCR4 var svag, eller endog nul, i normale væv (fig. 1A).

A

, Et humant prostatavæv array, strækker sig fra normal til høj kvalitet prostatacancer, blev evalueret ved IHC for CXCR4-ekspression under anvendelse af standardmetoder. Prøverne blev evalueret ved forstørrelse 40X, ved hjælp af en Q-Imaging kamera Olympus BX51 mikroskop med Bioquant® Billedanalyse Software (RtmBometrics). Normale prostatavæv demonstrerede lidt svag eller uopdaget brun farvning for CXCR4 (positive celler 5%), og ingen CXCR4 ekspression i kernen. Repræsentant lav kvalitet prostata væv (grad 2, fase II, T

2 N

0M

0, adenocarcinom) viste tilfældige /focal positiv farvning for CXCR4 i kernen (positive celler 11%, men mindre end 50%), hvilket indikerer lav ekspression af CXCR4. Repræsentant høj kvalitet metastatisk prostata væv (grad 4, trin IV, T

4 N

1M

1, adenocarcinom) viste diffus /intens farvning (positive celler 50%), hvilket indikerer høj ekspression for CXCR4 i nucleus. Scale bar repræsenterer 50 um.

B

, CXCR4 IgG2b monoklonalt museantistof blev evalueret for specificitet til CXCR4-proteinet ved Western blot-analyse i PC3 (CXCR4 positiv) eller 293T (CXCR4 null) cellelinier.

C

, CXCR4 antistof blev evalueret for specificitet til CXCR4 protein ved immunpræcipitation for CXCR4 og Western blot analyse for CXCR4.

D

, CXCR4 IgG2b antistof blev evalueret for specificitet til CXCR4 protein ved immunpræcipitering med Fibronectin IgG2b muse monoklonalt antistof (ubeslægtet isotypekontrol) og western blot-analyse for CXCR4; ekspression af fibronectin-protein blev bekræftet ved Western blot analyse. Beta-actin blev anvendt som en belastning kontrol. Vejviser

Vi har rapporteret, at PC3 celler var positive og 293T-celler var null, henholdsvis for CXCR4 protein [21]. At sikre specificiteten af ​​CXCR4 monoklonalt antistof (MAB172IgG2b) anvendes til at detektere det tilsvarende protein i kernen af ​​prostatavæv, vi re-analyseret PC3 og 293T for CXCR4 med CXCR4 antistof (MAB172IgG2b) ved Western blot analyse (fig. 1B). Svarende til vores tidligere undersøgelser, CXCR4 detekteret i PC3 men ikke i 293T helcellelysater (fig. 1B). Efterfølgende analyse af cellelysater ved immunopræcipitation med MAB172 IgG2b efterfulgt af Western blot-analyse med MAB172 IgG2b påvist CXCR4 kun i PC3 lysater (fig. 1C). For yderligere at bekræfte specificiteten af ​​MAB172IgG2b til CXCR4, blev PC3 cellelysater underkastet immunpræcipitation med fibronectin IgG2b, en isotypekontrol, efterfulgt af Western blot-analyse med MAB172 IgG2b (Fig. 1D). Fibronectin blev ikke opdaget af IP med CXCR4, men blev opdaget af western blot med en Fibronectin antistof (fig. 1D).

CXCR4 er til stede i nukleare Fraktioner af prostatacancerceller

Vi brugte biokemisk fraktionering for at bekræfte den nukleare lokalisering af CXCR4 detekteret i vores vævsfarvning. *, P 0,05. Kerner blev farvet med DAPI (blå). Sun

et al

. Wang

et al

.