PLoS ONE: En Multi-analyt-analyse for ikke-invasiv Påvisning af Blære Cancer

Abstrakt

Præcise urin analyser for blærekræft (BCA) afsløring ville gavne både patienter og sundhedssystemer. Gennem genomisk og proteom profilering af urinbestanddele, har vi tidligere identificeret et panel af biomarkører, der kan udkonkurrerer de nuværende urin-baserede biomarkører for ikke-invasiv detektion af BCA. Heri rapporterer vi den diagnostiske anvendelighed af forskellige multivariate kombinationer af disse biomarkører. Vi udførte en case-kontrolleret validering studie, hvor bortfalder urinen fra 127 patienter (64 tumorbærende fag) blev analyseret. Urin koncentrationer af 14 biomarkører (IL-8, MMP-9, MMP-10, SDC1, CCL18, PAI-1, CD44, VEGF, ANG, CA9, A1AT, OPN, PTX3, og ApoE) blev vurderet ved enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Diagnostisk ydeevne af hver biomarkør og multivariate modeller blev sammenlignet ved hjælp af receiveren opererer karakteristiske kurver og chi-square test. En 8-biomarkør model opnås den mest nøjagtige BCA diagnose (følsomhed 92%, specificitet 97%), men en kombination af 3 af de 8 biomarkører (IL-8, VEGF, og ApoE) blev også meget nøjagtig (følsomhed 90%, specificitet 97%). Til sammenligning er den kommercielle BTA-Trak ELISA-test opnåede en sensitivitet på 79% og en specificitet på 83%, og bortfalder urin cytologi opdages kun 33% af BCA sager i samme kohorte. Disse datashow at en multivariat urin-baserede assay markant kan forbedre nøjagtigheden af ​​non-invasiv BCA afsløring. Yderligere valideringsundersøgelser i gang for at undersøge den kliniske anvendelighed af denne panel af biomarkører for BCA diagnose og overvågning sygdom

Henvisning:. Goodison S, Chang M, Dai Y, Urquidi V, Rosser CJ (2012) En Multi -Analyte Assay for ikke-invasiv påvisning af blærekræft. PLoS ONE 7 (10): e47469. doi: 10,1371 /journal.pone.0047469

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Juni 28, 2012; Accepteret: September 11, 2012; Udgivet: 19 oktober, 2012 |

Copyright: © Goodison et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Flight Attendant Medical Research Institute (CJR), Florida Department of Health James og Esther kong Team Science Award 10kt-01 (CJR), og National Cancer Institute RO1 CA116161 (SG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. SG, VU og CJR er medarbejdere /aktionærer Nonagen Bioscience Corp. Desuden er der er ingen patenter udstedt, produkter i udvikling eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. MC og YD har erklæret, at de ikke har en konkurrerende interesse.

Introduktion

Den ikke-invasiv påvisning og overvågning af blærekræft (BCA) er fortsat en udfordring. Annulleret urin cytologi (VUC) er fortsat den mest etablerede urin-baseret assay til dette formål, men mens VUC har en specificitet på 93%, analysen lider lav følsomhed (25-40%) og observatør-afhængig variabilitet [1] .Commercial tests måler nukleare matrix protein (NMP-22) og blære tumor antigen (BTA) er dukket op som diagnostiske urinprotein test for BCA, men disse single-markør assays mangler specificiteten af ​​VUC [2], [3]. Konceptet, at tilstedeværelsen eller fraværet af en molekylær markør vil støtte klinisk evaluering har ikke vist sig at være tilfældet. Dette er ikke overraskende, når man tænker variationen mellem individer, cross-talk mellem molekylære veje, og heterogenitet solide tumorer.

Fremkomsten af ​​high-throughput teknikker har gjort det muligt en evolution fra single-markør forskning til en mere global strategi vurdering, og vi har brugt disse til at identificere lovende nye biomarkører for BCA. Brug af genomforskning [4] og proteomics [5] tilgange til profil de opløselige og cellulære komponenter af udtømt urin, har vi identificeret et panel af biomarkører, der viser lovende for udvikling til nøjagtige assays til ikke-invasiv BCA detektion. Vi har udført en række valideringsundersøgelser [6] – [9] til at vurdere potentialet kliniske anvendelighed af en række af disse biomarkører. I denne undersøgelse kombinerede vi data for 14 af vores kandidat biomarkører i en kohorte af 127 forsøgspersoner for at udlede et nøjagtigt og robust multivariat analyse for ikke-invasiv detektion af BCA.

Patienter og metoder

Prøvetagning og dataindsamling

Under Institutional Review Board godkendelse og informeret samtykke (IRB # 560-2006), bortfalder urinprøver, og tilhørende kliniske oplysninger blev prospektivt indsamlet i en urogenital væv bank. Forud for enhver form for terapeutisk intervention, blev -100 mL udtømt urin opnået fra hvert individ. Halvtreds milliliter urin blev anvendt til kliniske laboratorieanalyser pr standardprocedurer. Den resterende urin prøve blev tildelt et unikt identifikationsnummer før øjeblikkelig laboratorium behandling. Hver urinprøve blev centrifugeret ved 600 ×

g

4 ° C i 5 min. Supernatanten blev dekanteret og portionsopdelt, mens urin pellet blev hurtigt nedfrosset. Både supernatant og pellet blev opbevaret ved -80 ° C inden analyse. Proteinindholdet i portioner blev målt under anvendelse af et Pierce 660-nm Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) og en NanoDrop spektrofotometer (ND-1000, ThermoScientific, Wilmington, DE, USA). Vævsbanken blev forespurgt til egnede prøver til analyse, som omfattede ikke-fortløbende prøver fra 127 individer. Undersøgelsen kohorte bestod af 63 personer uden forudgående historie urothelia celle karcinom, brutto hæmaturi, aktiv tarmkanalen infektion urin eller urolithiasis (65% med udtømningssymptomer symptomer og 35% med mikroskopisk hæmaturi), og 64 personer med nydiagnosticeret urotelial celle karcinom. Prøver fra patienter med kendt nyresygdom eller dokumenteret nyreinsufficiens er ikke medtaget. Ifølge det internationale konsensus Panel om blære tumormarkører [10], denne kohorte fungerede som en fase II (validering studie). Data rapporteret ved brug af stard kriterier [11]. Alle individer blev evalueret i ambulant urologi klinik. Urinanalyse og VUC blev udført på alle fag. Alle emner undergik kontor cystoskopi og aksiale billeder af maven og pelvis.In kræft gruppen, postoperativ histologisk bekræftelse af urothelial celle karcinom, herunder kvalitet og scene, blev registreret. Relevante oplysninger om den kliniske præsentation, iscenesættelse, histologiske sortering [12], [13] og resultatet er vist i tabel 1. Median opfølgning af vores kontrol og kræft kohorter blev 11,5 og 12,0 måneder.

enzymmaerket Analyser for 14 Urinary Biomarkører og Hæmoglobin

Niveauer af human interleukin 8 (IL-8, Cat # ab46032 Abcam, Cambridge, MA, USA), Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9, Cat # DMP900 R 0,05 og alle rapporterede

s

værdier var to-sidet. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS-software-version 9.3.

Resultater

Demografiske, er kliniske og patologiske karakteristika for de 127 forsøgspersoner, som omfattede vores studiegruppe illustreret i Tabel 1. Fem personer (3 i kontrol gruppe, 2 i cancer gruppe) med manglende biomarkør-data blev udelukket fra endelige analysis.No emner i kontrolgruppen kohorte havde en unormal cystoskopi eller aksial billeddannelse. Desuden i opfølgningen, blev ingen af ​​kontrolpersonerne noteret at udvikle BCA eller endda grov hæmaturi. I kræft kohorte, 41% af forsøgspersonerne havde non-muskel invasiv sygdom og 19% af forsøgspersonerne havde lav kvalitet sygdom. Den mediane tumorstørrelse var 4,5 cm. I tråd med vores tidligere erfaringer [4], bortfalder urin cytologi (VUC) i kohorte opnåede 98% specificitet, men kun 33% sensitivitet.

De gennemsnitlige og mediane niveauer af de 14 biomarkører i urin er vist i tabel 2. niveauerne af 10 af de biomarkører var signifikant forhøjet hos personer med BCA, i forhold til personer uden BCA. CD44 og OPN var signifikant, men negativt, forbundet med BCA, og SDC1 og PTX3 blev ikke signifikant associeret med BCA. Da de fleste patienter til stede på urologi klinik med hæmaturi, må man overveje, om specifikke biomarkør analyser afsløre en tumor antigen eller et serum protein indført i prøven via blødning. For at kontrollere for denne mulighed, vi kvantificeres hæmoglobinniveauet i alle prøver og evalueret korrelationen af ​​alle 14 biomarkører med denne foranstaltning af hæmaturi. Denne analyse viste, at niveauet af CCL18 og A1AT havde en høj korrelation til urin hæmoglobin (Spearman korrelationskoefficient 0,8)., Og så disse ikke indgik i de multivariate modeller, der er beskrevet nedenfor

Figur 1 illustrerer den diagnostiske udøvelse af forskellige kombinationer af biomarkører. Når alle 8 positivt associeret BCA biomarkører blev kombineret, den samlede diagnostiske nøjagtighed var 94%, med en følsomhed på 92% og en specificitet på 97%. Logistisk regression og en 1000 Bootstrap prøve strategywere udført for at bestemme optimale diagnostiske biomarkør kombinationer, dvs. høj nøjagtighed med så få biomarkører som possible.For hver Bootstrap prøve, blev kandidat delmængder rangeret hjælp Bayesian information kriterium [15]. Analyser viste, at kombinationen af ​​IL-8, VEGF, og ApoE blev rangeret nummer et 410 gange (41%), at kombinationen af ​​VEGF og APOE rangeret nummer et 379 gange (38%), og alle andre kombinationer rangeret nummer et mindre end 100 gange ( 10%). Kombinationen af ​​IL-8, VEGF, og ApoE opnået en ydeevne næsten så godt som alle 8 biomarkører tilsammen (figur 1). Det 3-biomarkør assay havde en AUC på 0,968 (95% konfidensinterval [CI], 0,942-0,992), en følsomhed på 90% og specificitet på 97% (samlede nøjagtighed 93%). Kombinationen af ​​VEGF og APOE havde en reduceret samlede nøjagtighed (89%). Den 2-biomarkør assay havde en AUC på 0,957 (95% konfidensinterval [CI], 0,927-0,987), en følsomhed på 81% og en specificitet på 97%. Til sammenligning er BTA-Trak kommercielle assay opnåede en sensitivitet på 79%, specificitet 83%, og den samlede nøjagtighed på 81% (figur 1).

ROC kurver blev plottet til at sammenligne ydeevne for den samlede 8 -biomarker kombination, en 3-biomarkør kombination (IL-8, VEGF, ApoE), en 2-biomarkør kombination (VEGF, ApoE) og BTA-Trak test. Baseret på arealet under ROC-kurven (AUROC) blev Youden Indeks cutoff værdier, der maksimerede summen af ​​sensitivitet og specificitet bestemt for hver biomarkør (krydset kvadrat på kurven). Tabel giver ydeevne værdier for hver kombination. PPV, positive prædiktive værdi. NPV, negativ prædiktiv værdi.

Diskussion

Kræft i urinblæren er blandt de fem mest almindelige maligne sygdomme på verdensplan. Ved præsentationen, mere end 80% af blæretumorer er ikke-muskel invasive papillære tumorer, som har en 5-års overlevelse på 90%, men ca. 70% af patienter med disse læsioner udvikle tumor tilbagefald inden to år første diagnose . Den gentagelse fænomenet non-muskel invasiv BCA gør den til en af ​​de mest udbredte kræftformer i hele verden. Når BCA opdages og behandles, vil patienterne rutinemæssigt få hyppig overvågning cystoskopi at overvåge for tumor tilbagefald. Hvis venstre ubehandlet, i første omgang ikke-invasive tumorer kan udvikle sig til muskel-invasiv tumorer, som har en væsentligt reduceret 5-årige overlevelsesrate. Således nøjagtig påvisning af BCA, ideelt set gennem ikke-invasiv urin-baseret analyse, er fortsat et presserende mål.

For at validere et panel af lovende biomarkører opdaget ved hjælp af genomics og proteomics tilgange [4], [5] har vi foretaget en række undersøgelser under anvendelse af ELISA-baserede assays [6] – [9]. I denne undersøgelse undersøgte vi et supplerende og kombineret alle data -14 biomarkører i en kohorte af 127 subjects- at udlede de mest nøjagtige diagnostiske multi-analyt-assays. Vi overvåges også udførelsen af ​​den kommercielle BTA-Trak analysen i de samme tilfælde til sammenligning, og vi kvantificeres hæmoglobin i hvert enkelt tilfælde for at undersøge mulige sammenhænge mellem biomarkører og hæmaturi. To biomarkører, CCL18 og A1AT, viste sig at have en relativ høj korrelation med urin hæmoglobin, øge muligheden, at kilden til disse proteiner er, i det mindste delvis, serum indføres gennem blødning. Vi vil fortsætte med at undersøge disse to biomarkører i uafhængige kohorter, men de blev ikke medtaget i den logistiske regressionsanalyser udført for at identificere optimale diagnostiske biomarkør kombinationer. En 8-biomarkør panel (IL-8, MMP-9, PAI-1, VEGF, ANG, CA-9, ApoE, MMP-10) viste sig at være den mest nøjagtige (samlet nøjagtighed på 94%) multi-analyt-assayet for påvisning af BCA i 127-emne kohorte. Med multiplex molekylære signaturer, er det sædvanligt, at et par af de komponenter vil give meget af den prædiktive effekt, men yderligere markører vil gøre modellen mere robust over for fejl [4]. Ved at teste alle mulige kombinationer via en bootstrap strategi, afslørede vi, at tre af de 8 biomarkør panel (IL-8, VEGF og ApoE) bidrog mest information. Som en stand-alone analysere den 3-biomarkør panel opnåede et samlet nøjagtighed på 93% og opretholdes, både høj følsomhed (90%) og specificitet (97%). At opnå en høj nøjagtighed med så få biomarkører som muligt er optimal for praktiske grunde, men det er vigtigt, at vi overvåge alle de lovende biomarkører yderligere i større og mere forskelligartet kohorter, fordi forskellige kombinationer kan være mere robust i specifikke betingelser, såsom tilstedeværelse af infektion, eller være mere nøjagtig for tilbagefald versus den første diagnose.

komponenterne i 3-biomarkør panel (VEGF, IL-8, ApoE) er blevet forbundet med en række af cancere, herunder blærekræft, i varierende grad. I en undersøgelse af 26 forsøgspersoner, Crews

et al.

Vist, at forhøjede niveauer i urinprøver af VEGF korreleret med niveauer i udskåret væv [17]. I en undersøgelse af 219 Mellemøsten emner, urin niveauer af VEGF var signifikant højere hos patienter med BCA. I deres kohorte måling VEGF udkonkurrerede VUC, at opnå en diagnostisk sensitivitet på 76% [18]. Tilsvarende Bian demonstrerede en forbedret følsomhed urin VEGF sammenlignet med VUC, nå 69% vs. 38% [19]. I en anden undersøgelse af patienter med forhøjede urin VEGF niveauer havde en højere risiko for recidiv [20]. Tidligere rapporter har impliceret IL-8 i blære tumor biologi og dets anvendelse som en potentiel biomarkør for BCA er blevet undersøgt i få studier. IL-8 er blevet vist at have mitogene og angiogene egenskaber, og høje niveauer resulterer i forøget tumorgenicitet, progression og metastase i musemodeller, angiveligt via regulering af nuklear faktor kappa-B [21]. Kliniske undersøgelser har vist, at forhøjede niveauer i urinprøver af IL-8 kan være forbundet med tilstedeværelsen af ​​blærecancer. I en undersøgelse af 140 forsøgspersoner, en IL-8-analysen opnåede en sensitivitet på 59% og en specificitet på 90% [22], og i en undersøgelse af 79 forsøgspersoner blev en følsomhed på 50% og en specificitet på 90% rapporterede [23]. Disse resultater er meget i tråd med vores resultater ved vurderingen IL-8 som individ [7] biomarkør. Dataene er knappe på rolle ApoE i kræft. Funktioner omfatter forbedring af lipid transport i celler og formidling af signaltransduktion efter binding til lipoprotein receptorer [24], [25]. ApoE har vist sig at interagere med det midlertidige epitel respons-gen (TERE1), et tumorsuppressorgen, i blære tumorceller, hvilket resulterer i øget celle omsætning og resistens over for apoptose [26], [27]. For nylig Lindén

et al.

Rapporterede, at ApoE var en del af et panel af biomarkører detekteret af masse- spektroskopi, og kan være forbundet med ikke-muskel invasiv BCA [28].

Vi anerkender at vores undersøgelse har flere limitations.First som en tertiær pleje facilitet, er vi tilbøjelige til at se mere af høj kvalitet, høj stadie sygdom, hvilket afspejler sig i vores undersøgelse kohorte. For at bekræfte robustheden af ​​vores underskrift, skal efterfølgende undersøgelser vurdere større kohorter, der omfatter patienter med lav kvalitet, lav-stadie sygdom. For det andet, blev analyseret forarbejdede, opsparede uriner. Uriner blev centrifugeret og adskilt i cellulær pellet og supernatant før opbevaring ved -80 ° C. Det er muligt at nyligt udtømt urin prøver kan give forskellige resultater, og det er frisk urin, der ville være det materiale, der anvendes til point-of-care-assays. Vi undersøger i øjeblikket udførelsen af ​​udvalgte biomarkører i urinen behandles via en række forskellige protokoller, herunder frisk annulleret uriner. Dernæst følsomheden af ​​VUC i vores kohorte af overvejende høj kvalitet (grad 3) sygdom (33%) var lavere end det kunne forventes. Dette sætter spørgsmålstegn ved den kendte inter-observatør variation fortolke VUC. I efterfølgende undersøgelser, vil vi anvende to cytopatologer at fortolke disse resultater. Endvidere er det usikkert, hvordan det protein sammensætning af urinen supernatanten kan ændres under frossen lagring. Antallet af fryse-tø cykler blev holdt på 1-2 ved at dividere urinen supernatanten i flere små portioner. Endelig vores stikprøvestørrelse på 127 er lille, og de to grupper, der omfattede de 127 forsøgspersoner var relativt homogene, dvs. enten aktiv cancer, eller sager kontrol uden aktiv cancer, ingen historie af kræft, ingen urinvejsinfektion, ingen urolithiasis, og ingen brutto hæmaturi. Således var vi ikke i stand til at vurdere følsomheden /specificitet af vores biomarkører blandt forskellige stadier /grades.The specificitet lovende biomarkører skal testes i kohorter, der er kendt for at være problematisk med andre urin assays (f.eks hæmaturi, urinvejsinfektion , sten og tømme dysfunktion).

Identificeringen af ​​robuste BCA-associerede biomarkører og etablering af multiplex urin assays vil have flere kortsigtede og langsigtede virkninger. Mange af de validerede biomarkører i denne undersøgelse er ikke blevet associeret med cancer tidligere. Analyse af den rolle, disse proteiner i tumor cellebiologi kan belyse mekanismer i tumor initiering eller progression, og kan afsløre hidtil ukendte terapeutiske mål. Klinisk, nøjagtige BCA analyser vil have en klar indvirkning på indledende diagnostiske resultater, og på den kliniske behandling af patienter efter behandling. Hvis pålidelige urin diagnostiske biomarkør assays kan reducere antallet af nødvendige invasive og ubehagelige cystoscopies, vil en forbedring af patientens overholdelse og tilfredshed følge, og øget effektivitet og besparelser vil gavne sundhedsvæsenet. Det endelige mål er at være i stand til at detektere BCA i tide, således at patienten kan forvente en forbedret livskvalitet og samlede resultat.

Konklusioner

Gennem opdagelse fase undersøgelser, der anvendte avanceret profilering teknikker til den faktiske, foretrukne klinisk test analyt, i dette tilfælde, bortfalder urin, har vi identificeret molekylære signaturer, der kan opdage BCA med enestående præcision. Validering af kombinationer af disse urin biomarkører hjælp immunkemiske analyser bekræfter, at multi-analyt tests væsentlig grad kan forbedre den ikke-invasiv påvisning af BCA, og give en begrundelse for større, prospektive undersøgelser, der skal gennemføres.

Tak

forfatterne er taknemmelige for de 127 forsøgspersoner, der deltog i denne kliniske undersøgelse.