PLoS ONE: Ekstracellulær sulfataser, Elementer i Wnt signalvejen, positivt Regulere Vækst og Tumorigenicitet for Human kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Baggrund

heparansulfatproteoglycaner (HSPGs) er betjeningselementer i Wnt signalering, som binder ekstracellulært at Wnt ligander og regulere deres evne til at interagere med signaltransduktion receptorer på celleoverfladen. Sulf-1 og sulf-2 er nye ekstracellulære sulfataser der virker på interne glucosamin-6-sulfat (6S) ændringer inden HSPGs og dermed modulerer HSPG interaktioner med forskellige signalmolekyler, herunder Wnt-ligander. Emerging beviser indikerer betydningen af ​​reaktiveret Wnt signalering i en række kræftformer, herunder pancreas adenocarcinom.

Princip Rettens

Begge sulf proteiner blev opreguleret i humane pancreas adenocarcinom tumorer og blev bredt udtrykt i human pancreas adenocarcinom cellelinier. Ekspression af humane ekstracellulære sulfataser sulf-1 og sulf-2 forstærket Wnt signalering i et rekonstitueret system. Tre af fire pancreasadenocarcinom cellelinjer testede udviste autokrin Wnt signalering, i at ekstracellulær Wnt-ligander skulle initiere nedstrøms Wnt signalering. Eksponering af disse pancreasadenocarcinom celler til en katalytisk inaktiv form af sulf-2 eller siRNA-medieret inaktivering af endogen sulf-2 hæmmede både Wnt signalering og cellevækst. Sulf-2 nedregulering i to af disse linjer resulterede i markant reduceret tumorigenese i immunsvækkede mus.

Konklusioner /Betydning

Vi har identificeret den Sulfs som forstærkere af autokrine Wnt signalering i bugspytkirtelkræftceller og har demonstrerede deres bidrag til vækst og tumorgenicitet af disse celler. Siden Sulfs er ekstracellulære enzymer, ville de være attraktive mål for terapi af kræft i bugspytkirtlen. Vores resultater er i modstrid med den fremherskende opfattelse i litteraturen, at Sulfs er negative regulatorer af tumorigenese

Henvisning:. Nawroth R, van Zante A, Cervantes S, McManus M, Hebrok M, Rosen SD (2007) Ekstracellulær sulfataser, elementer i Wnt signalvejen, positivt regulere vækst og tumorfremkaldende i human bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 2 (4): e392. doi: 10,1371 /journal.pone.0000392

Academic Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, Inc., USA

Modtaget: Marts 18, 2007; Accepteret: 28 Mar 2007; Udgivet: 25 April, 2007

Copyright: © 2007 Nawroth et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forskningen blev understøttet af en Susan Komen Breast Cancer Foundation Grant PDF0402844 (RN og SDR), den tyske Research Foundation Grant NA439 /1-1 (RN), Ministerio de Educación, Cultura y Deporte af den spanske regering (SC) og National Institute of Health Grants GM57411 (SDR), CA122025 (SDR), HL075602 (SDR) og CA112537 (MH). Udarbejdelsen af ​​lentivirus blev støttet af Sandler lentivirus Core Facility på UCSF. De sponsorer havde ingen rolle i design og gennemførelse af undersøgelsen, i indsamling, analyse og fortolkning af data, og i forberedelsen, anmeldelser, eller godkendelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklærede, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

bugspytkirtlen adenocarcinom er den mest almindelige form for kræft i bugspytkirtlen, og en af ​​de mest dødbringende maligniteter med en 5 års overlevelse på 3% og en median overlevelse på mindre end 6 måneder [1]. Der har været nylige interesse i rollen som embryonale signalveje i cancer. Betydelige beviser har vist, at disse veje forblive funktionsdygtigt i et begrænset antal celler i den voksne, og at dysregulering af disse veje bidrager til dannelse og persistens af tumorer [2], [3]. I denne henseende, reaktivering af Notch har Hedgehog og Wnt veje tiltrukket seneste interesse i kræft i mave-tarmkanalen, herunder pancreas adenocarcinom [2], [4], [5].

dysregulering af Wnt signalering i bugspytkirtlen adenocarcinom er fokus for denne undersøgelse. Wnts omfatter en stor familie af udskilte proteiner, som regulerer cellevækst, apoptose, motilitet og differentiering under fosterudviklingen [3]. Kort fortalt er aktivering af den kanoniske Wnt pathway initieres ved binding af Wnt ligander til signaltransduktion receptorer på celleoverfladen, hvilket fører til akkumulering af ikke-phosphoryleret β-catenin i cytoplasmaet. Efter sin translokation til kernen, β-catenin danner et kompleks med medlemmer af TCF /LEF-familien af ​​transkriptionsfaktorer, og aktiverer målgener [3].

Wnt signalering blev først impliceret i cancer gennem analyse af brystkirtel tumorigenese induceret af muse-brysttumorvirus (MMTV) [6]. En stor del af tumorerne skyldtes aktivering af Wnt1 udtryk gennem indsættelse af MMTV provirus ind i

wnt1

gen. Tumorgenese menes at være baseret på en autokrin Wnt transformerende pathway, i hvilken Wnt-ligand-ekspression ved mammaepitelceller giver en vækst stimulus til de samme celler. Senest autokrin Wnt signalering blev påvist i brystcancer, ovariecancer og myelomacellelinier, [7], [8]. Denne mekanisme, ved hvilken ekstracellulære Wnt-ligander tilvejebringe et væsentligt incitament til celleproliferation, er forskellig fra den almindeligt forekommende i human coloncancer og flere andre former for cancer, ved hvilken konstitutiv aktivering af Wnt signalering er en konsekvens af mutationer i nedstrøms cytoplasmatiske elementer sådanne som

APC, CTNN1

(koder β-catenin) eller

AXIN2

[3].

Disse karakteristiske mutationer i downstream Wnt signalmolekyler er meget sjældne i pancreas adenocarcinom [9 ]. Men afvigende aktivering af Wnt signalering er en væsentlig egenskab ved human pancreas adenocarcinom, som afsløret af den nukleare lokalisering af β-catenin i en signifikant fraktion (30-65%) af tumorer [9], [10]. I overensstemmelse med den histokemiske beviser har biokemisk analyse etableret en markant forhøjelse af total β-catenin og dens øgede kernelokalisering i to tredjedele af pancreas adenocarcinomer [9]. Desuden er der i mekanistiske undersøgelser med pancreasadenocarcinom cellelinier, inhibering af Wnt-signalering resulterede i reduceret celleproliferation og overlevelse in vitro [11].

Et område af aktuel interesse er de ekstracellulære regulatoriske elementer i Wnt signalvejen. Blandt disse udskilles Wnt antagonister såsom Frizzled relaterede proteiner (SFRP), Wnt inhibitorisk faktor (WIF) og Dickkopf familie (DKK) [12]. Nedregulering af nogen af ​​disse antagonister initierer Wnt aktivering og bidrager til flere former for cancer [12]. En klasse af ekstracellulære proteiner, der positivt regulerer Wnt aktivitet er heparansulfatproteoglycaner (HSPGs). Glypicans eksempelvis er nødvendige for Wnt signalering under udvikling i Drosophila og hvirveldyr [13]. HSPGs er også nødvendige i eksempler på tumordannelse Wnt-afhængige [14], [15]. De mange funktioner HSPGs i væksten og differentieringen af ​​celler [16] medieres via deres evne til at binde til en forskelligartet repertoire af vækstfaktorer og morfogener. Binding afhænger sulfateringen mønster af glucosamin (N-, 3-O, og 6-O stillinger) og uronsyre (2-O-position) inden for de vedhæftede heparansulfat kæder. [16]. 6-O-sulfatering (6S) af glucosamin er af særlig betydning i bindingen af ​​mange vigtige ligander til HPSGs, herunder Wnts [17] – [19]. En nyligt værdsat mekanisme til at regulere signalering med disse ligander er ved post-syntetiske “redigering” af 6S mønster af HSPGs gennem virkningen af ​​en klasse af ekstracellulære sulfataser kendt som Sulfs [20].

QSulf-1 , det første medlem af sulf familien skal beskrives, blev opdaget i en analyse af muskel udvikling i vagtler embryo [20]. Dette blev efterfulgt af beskrivelsen af ​​dens orthologer i rotter [21], mus og human [22], og opdagelsen af ​​den nært beslægtede homolog, sulf-2 [22]. De Sulfs er neutrale pH-optimale endosulfatases der fjerner 6-O-sulfat fra interne glucosamin-rester i stærkt sulfaterede subdomæner heparin /HSPGs [18], [19], [22], [23]. De indledende undersøgelser af QSulf-1 viste en positiv rolle i reguleringen af ​​Wnt signalering under muskel specifikation i vagtler embryo [20]. Denne aktivitet afhænger af evnen af ​​QSulf-1 for at reducere interaktionen af ​​Wnt-ligander med HSPGs. Forfatterne foreslog en to state model, hvor HS kæder danner en høj affinitet HS-Wnt kompleks, som sekvestrerer Wnt fra at interagere med dens signal transduktion receptorer. Affiniteten af ​​Wnt for HS er svækket, når QSulf-1 modificerer 6S mønster af HS-kæder, så indledningen af ​​Wnt signalering [19].

er også blevet observeret sulf-afhængig fremme af Wnt signalering i andre udviklingsmæssige begivenheder [24]. In vitro tyder på, at Sulfs kan fremme andre signalveje, herunder angiogenese og BMP signalering [23], [25]. Vigtigere,

sulf

null mus viser reduceret kropsmasse [26], [27]. Denne fænotype er i overensstemmelse med positive regulatoriske roller for de Sulfs under normal udvikling.

Opdagelsen af, at kanoniske Wnt signalering er aktiveret i pancreas adenocarcinom (se ovenfor) har fokuseret vores opmærksomhed på den mulige inddragelse af Sulfs i denne kræft . I den foreliggende undersøgelse udviser vi opregulering af begge sulf proteiner i pancreas adenocarcinom-tumorer. Brug humane pancreas adenocarcinom kræft cellelinjer, vi etablere en rolle for sulf-2 i at fremme autokrin Wnt signalering, in vitro-cellevækst og tumorgenicitet. Denne positive bidrag en sulf til Wnt-afhængig tumorvækst er i slående kontrast til flere rapporter, hvor tvungen ekspression af Sulfs antagoniserer andre signalveje (f.eks FGF-2, og HGF) i tumorceller og undertrykker cellevækst [28] – [34].

Resultater

sulf-1 og sulf-2 er opreguleret i human bugspytkirtelkræft

Udvinding af offentlige DNA microarray datasæt og en kvantitativ PCR undersøgelse fastslå, at

SULF1

udskrifter er opreguleret i human bugspytkirtelkræft (tabel 1). Sidstnævnte undersøgelse viste, at det gennemsnitlige niveau af

SULF1

mRNA var 22,5 gange større i kræftvæv (n = 31) end i normale bugspytkirtlen (n = 19) [31].

In situ

hybridisering lokaliseret udtryk for

SULF1

til rørformede strukturer, sandsynligvis repræsenterer invasiv karcinom.

For at afgøre, om sulf proteiner blev udtrykt af pancreas adenocarcinom i kirurgiske prøver vi farvede snit fra syv arkiverede sager med sulf-1 og sulf-2-antistoffer og en IgG-kontrol (figur 1 A og B). Godartede interlobulære kanaler på samme vævssnit som invasiv carcinom tjente som en intern kontrol. I 7/7 tilfælde, de maligne epitelceller viste generelt moderat til stærk farvning for sulf-1 (figur 1B). For sulf-2, udviste 4/7 sager stærk farvning af disse celler, 2/7 tilfælde havde moderat farvning og 1 tilfælde var negativ. De fleste godartede kanaler viste ingen farvning eller kun spor farvning for sulf-1 (≈54%) eller sulf-2 (≈88%). Focal farvning for sulf-1 eller sulf-2 blev set i et mindretal af de godartede kanaler. Diffus svag farvning af fibroblaster for både Sulfs blev observeret i nogle områder af stroma, sædvanligvis associeret med inflammatoriske celler. Der var ingen farvning med IgG kontrol

A:. Repræsentative serielle sektioner af pancreas adenocarcinom blev farvet med sulf-1, sulf-2 og styre IgG. Godartede kanaler blev sammenlignet med områder af invasiv carcinoma på den samme sektion. B: Kvantitativ tabelopstilling over sulf immunhistokemi resultater i pancreas adenocarcinom tilfælde (0 = ingen eller spor farvning, 1 = moderat farvning, 2 = stærk farvning, ND = ikke bestemt). C: RNA blev isoleret fra 24 adenocarcinom cellelinjer blev cDNA forberedt, og udsat for PCR med primere til

SULF1

SULF2

β-

actin

som lastning kontrol . D: Immunoblots blev udført på cellelysater og konditioneret medium (CM) anvendelse af antistoffer mod sulf-1 (øverste felt) og sulf-2 (midterste og nedre panel). Kun sulf-2-protein blev detekteret i CM.

Næste bestemte vi ekspression af Sulfs i humane pancreas adenocarcinom cellelinier ved anvendelse af RT-PCR til undersøgelsen et panel af 24 cellelinjer. Disse blev afledt af enten primære eller metastatiske pancreas adenocarcinomer [5].

SULF1

afskrifter blev påvist ved RT-PCR i 12/24 og

SULF2

udskrifter i 21/24 af disse linjer (figur 1C). For at undersøge udtryk på proteinniveauet, undersøgte vi fire af disse cellelinjer, hvoraf 3 var positive for både

sulf

udskrifter (CFPAC-1, HS766T, L3.6sl) og 1 som var positive for kun

SULF2

(BxPC-3). Vi udførte immunoblots på detergentlysater og konditioneret medium (CM) er afledt af disse celler (Figur 1D). Sulf-1 protein blev påvist i kun én cellelinje (HS766T celler), hvorimod sulf-2-protein var til stede i alle 4. I detergentlysater, molekylvægten af ​​de vigtigste arter var 130 kDa, hvilket svarer til en ubehandlet form til både proteiner [22]. Sulf-2 protein blev frigivet i CM af alle 4 cellelinjer. I modsætning hertil blev sulf-1 ikke påvist i HS766T CM. Som tidligere observeret for flere brystcarcinoma cellelinier [25], blev sulf-2 protein påvist i CM et forarbejdet 75 kDa komponent.

sulf-1 og sulf-2 fremmer Wnt signalering

QSulf-1 er blevet vist at fremme aktivering af Wnt signalveje som reaktion på eksogene Wnt ligander [20]. Vi valgte at undersøge virkningerne af det humane Sulfs om Wnt signalering i en lignende rekonstitueret system, [20]. Vi overudtrykt den Sulfs i HEK 293T og co-dyrkes disse celler med fibroblaster, der udtrykte enten Wnt1 eller Wnt4. Wnt signalering aktivitet blev målt ved TCF-luciferase reporter-system (TOPflash /FOPflash), en standardmetode til måling β-catenin-afhængig transkriptionel aktivering [20]. Angivelse af hver sulf augmented Wnt signalering som respons på enten Wnt ligand, mens mocktransfekterede HEK 293T-celler ikke reagerede (supplerende figur, fig. S1). Således kan både HSulfs, ligesom QSulf-1 [20], fremme Wnt signalering.

Angivelse af SFRP-2 hæmmer Wnt signalering i pancreas adenocarcinom cellelinjer

Tidligere arbejde har etableret aktiv Wnt signalering inden for en række af de pancreatiske adenocarcinom cellelinjer, herunder de 4 linjer over [M. Pasca di Magliano og M. Hebrok, upublicerede observationer]. For at bestemme om Wnt signalering i disse 4 linier var autokrin karakter, anvendte vi secerneret Frizzled-relateret protein-2 (SFRP-2) som et ekstracellulært Wnt antagonist [35], [36]. Vi transient transficeret cellelinierne med et cDNA for SFRP-2 eller med tom vektor (ctrl) og målt Wnt aktivitet af TCF-luciferase reporter assay. SFRP-2-ekspression formindsket Wnt signalering ≈60% i 3 af de linjer, men havde ingen virkning på CFPAC-1-celler (figur 2). Disse resultater fastslår, at BxPC-3, HS766T og L3.6sl celler besidder en autokrin Wnt signalering pathway.

De angivne pancreasadenocarcinom cellelinier blev transfekteret med SFRP-2-cDNA (SFRP-2) eller kontrol-vektor ( ctrl) og TOP /FOPflash reporter-system. Wnt aktivitet blev bestemt ved luciferaseaktivitet. De viste værdier er gennemsnit ± SD er 3 uafhængige bestemmelser. Forskelle mellem SFRP og kontrol var signifikant i Student t-test med p-værdier for . 0,002 for BxPC-3, HS766T og L3.6sl

katalytisk inaktiv menneskelig sulfatase protein hæmmer Wnt signalering og cellevækst

Vi næste spurgte, om de endogene Sulfs i disse cellelinjer var direkte involveret i Wnt signalering. Når vi overudtrykt den Sulfs, var der ingen effekt på Wnt signalering (data ikke vist). Da alle disse celler udtrykte signifikante niveauer af Sulfs, vi næste spurgt, om der kan være hæmmende virkninger, hvis vi udtrykte katalytisk inaktive former af disse proteiner. Vi har tidligere vist at mutation af to cysteiner i sulfatase domæne af hver sulf slået sulfataseaktivitet [22]. Transficerede vi et cDNA kodende inaktiv sulf-1 (S1ΔCC), sulf-2 (S2ΔCC) eller tom vektor (ctrl) i hver af de 4 cellelinjer og igen målt Wnt aktivitet. Som vist i figur 3A, ekspression af enten inaktive sulf inhiberede Wnt aktivitet ≈50% i alle undtagen CFPAC-1-celler. De 3 responderende linjer var den samme som udviste autokrin Wnt signalering (figur 2). Det faktum, at enten inaktive sulf udøvede tilsvarende virkninger på disse bugspytkirtelkræft cellelinjer antyder funktionel redundans af de to enzymer

A:. Fire pancreas adenocarcinom cellelinjer som angivet blev kortvarigt transficeret med cDNA’er, der koder enten en katalytisk inaktiv form af sulf-1 ( “S1ΔCC”) eller en katalytisk inaktiv form af sulf-2 ( “S2ΔCC”) eller med den tomme vektor ( “kontrol”). Mutanterne blev fremstillet ved at erstatte to tilstødende cysteiner med alaniner. Wnt signalering blev bestemt ved anvendelse af TOP /FOPflash reporter system. De viste værdier er gennemsnit ± SD er for 4 uafhængige bestemmelser og forskelle mellem mutant- og kontrolceller var statistisk signifikante med p-værdier 0,02 til BxPC-3, HS766T og L3.6sl celler (Student t-test). B: De pancreasadenocarcinom cellelinier blev dyrket med konditioneret medium afledt af hver af følgende: parentale HEK-293-celler ( “kontrol”), HEK 293T-celler, der stabilt udtrykker vildtype sulf-2 (betegnet “sulf-2”), eller udtrykker en katalytisk inaktiv form af sulf-2 ( “S2ΔCC”). Vildtype sulf-2-protein og mutanten var til stede i det konditionerede medium af de to producerende celler på tilnærmelsesvis ækvivalente niveauer. Wnt signalering blev bestemt som før med TCF-luciferase reporter assay. De viste værdier er gennemsnit ± SD er 3 uafhængige bestemmelser og forskelle mellem sulf-2-mutant og kontrol var statistisk signifikant for BxPC-3 (p = 0,002), HS766T (p = 0,01) og L3.6sl (p = 9 × 10

-6) (Student t-test). C: De pancreas adenocarcinom cellelinier blev dyrket i et transwell systemet over feeder lag bestående af: medium alene ( “Medium”); parentale HEK 293T-celler ( “HEK 293T”); HEK 293T-celler stabilt producerer vildtype sulf-2 ( “sulf-2”); eller en katalytisk inaktiv form af sulf-2 ( “S2ΔCC”). Cellevækst blev overvåget ved hæmacytometer tælling i 4 dage. De viste værdier er gennemsnit ± SD er 3 uafhængige bestemmelser.

Vi næste spørgsmål, om exogen tilsætning af katalytisk inaktiv sulf-protein også ville forstyrre Wnt signalering. Som en kilde til sulf-2-protein, vi brugte HEK 293T-celler, der var stabilt transficeret enten med vildtype-human sulf-2 (S2) eller katalytisk inaktiveret sulf-2 (S2ΔCC) [25]. Vi brugte også forældrenes HEK 293T-celler (293T) som kontroller. De stabile transfektanter udskilles de aktive og inaktive Sulfs på sammenlignelige niveauer (data ikke vist). Vi inkuberede pancreas adenocarcinomceller i 16 timer med CM fra disse celler eller med kontrolmedium og sammenlignet Wnt signalering. Udsættelse for den inaktive sulf-2-protein (S2ΔCC) inhiberede Wnt signalering i de samme 3 cellelinier, der var reagerer på transfektion med S2ΔCC cDNA (figur 3B), hvorimod CFPAC celler ikke viste en virkning. Tilføjelsen af ​​medium, konditioneret med aktiv sulf-2-protein, ikke fremmer Wnt signalering over basale niveau.

Dernæst vi oprettet en co-kultur system til at undersøge virkningerne af rekombinant sulf protein på cellevækst af de samme cellelinier. De bugspytkirtelkræftceller blev podet ved lav densitet på transwell filtre over feeder lag, som bestod af forældrenes HEK 293T-celler eller HEK 293T udtrykker aktiv eller inaktiv sulf-2. Celletællinger blev overvåget i de næste adskillige dage. Resultaterne parallelt den undertrykkende virkning vi observeret på Wnt signalering. Således, som sammenlignet med kontrol medium, S2ΔCC CM hæmmede væksten af ​​BxPC-3, HS766T og L3.6sl celler (figur 3C), men havde ingen virkning på CFPAC-1-celler. I modsætning hertil aktiv sulf-2 ikke fremme eller hæmme cellevækst af nogen af ​​linierne.

Lentiviral shRNA inaktivering af sulf-2 i pancreas adenocarcinom celler reducerer Wnt signalering, celleproliferation, og celleoverlevelse

for yderligere at undersøge den rolle sulf-2 i Wnt signalering og cellevækst, brugte vi shRNA metode til at lukke munden på ekspressionen af ​​sulf-2 i disse celler. Vi ansat tre shRNA konstruerer: to uafhængige konstruktioner rettet sulf-2 (1413 og 1143) og en kontrol (ctrl). Disse konstruktioner blev anvendt i forskellige vektor baggrunde hvor tilstedeværelsen eller fraværet af GFP tilladt os at overvåge ekspression af shRNAs (se Materialer og fremgangsmåder). Transducerede celler blev sorteret til GFP-ekspression og efterfølgende analyseret for sulf-2-ekspression. De 1143 og 1413-konstruktioner (PLV-1143, PLV-1413) producerede 80% og 90% reduktioner af sulf-2-protein i henholdsvis L3.6sl celler, i forhold til kontrolgruppen shRNA (PLV-ctrl) (figur 4A). Der var ingen reduktion af proteinet i PLV-ctrl behandlede celler i forhold til ubehandlede celler (data ikke vist). PLV-1413 konstruktion produceret en tilsvarende reduktion i BxPC3 celler i to forskellige vektor baggrunde (PLV og pSico).

Inaktivering af Wnt signalering resulterer i nedsat niveau af aktiverede β-catenin (N-terminalt ikke-phosphoryleret) i kernen [3]. Vi isolerede derfor den nukleare fraktion af sulf-2 tavshed og kontrolceller (BxPC-3 og L3.6sl) og analyseret niveauer af aktiveret β-catenin. Der var et fald ≈80% af β-catenin i sulf-2 tavshed BxPC-3-celler, og en reduktion ≈30% i L3.6sl celler (figur 4B). Vi kvantificeres også Wnt aktivitet ved anvendelse af TCF-luciferase reporter system. Overensstemmelse med β-catenin resultat, dette assay bekræftede, at Wnt signalering væsentligt inhiberet i sulf-2 lyddæmpede celler i forhold til kontrol-behandlede celler for både BxPC-3 og L3.6sl celler (figur 4C). Igen viste BxPC-3 celler stærkere hæmning (52% med PLV-1413) end L3.6sl celler (35% hæmning med PLV-1413 eller PLV-1143)

A:. Cellerne blev transduceret med betinget (pSico) eller nonconditional lentivirus (pLVTHM) kodning enten sulf-2 specifikke (1413, 1143) eller kontrol (ctrl) shRNAs. Cellerne blev lyseret og lige store mængder proteiner blev underkastet SDS-PAGE. I tilfælde af pSico blev celler lyseret 10 dage efter cre transfektion. Sulf-2 proteinniveauer blev bestemt ved at udføre immunblots og de samme lysater probet med anti-actin antistof som en loading kontrol. B: 100 pg totalt protein ifølge den nukleare fraktion fra cellerne blev påført på SDS-PAGE og mængder af aktiv beta-catenin blev detekteret under anvendelse af et antistof mod ikke-phosphoryleret beta-catenin. Som lastning kontrol blev de samme lysater analyseredes med et anti histon-antistof. C: Parental, PLV-ctrl, PLV-1413 og PLV-1143 transducerede celler blev transficeret med FOP /TOPflash reporter-system og luciferaseaktivitet blev påvist 48 timer senere. De viste værdier er gennemsnit ± SD er 3 uafhængige bestemmelser og forskelle mellem ctrl og sulf-2 lyddæmpede celler var statistisk signifikante (BxPC-3, p = 0,002 og (L3.6sl, p = 0,013 og 0,017 for de to dæmpende vektorer) .

Vi bestemmes virkningerne af sulf-2 lyddæmpning på celleproliferation ved at måle inkorporeringen af ​​5-bromdeoxyuridin (BrdU) i cellerne. Der var en reduktion 25-30% af celler undergår S- fase i L3.6sl, BxPC3, og HS766T celler, og kun en reduktion i CFPAC-1-celler (figur 5A) 5%. Derudover udførte vi apoptoseassays ved måling annexin V-farvning. De sulf-2 tavshed BxPC-3-celler viste en stigning i apoptose på 33%, mens L3.6sl celler viste stigninger på 65% og 79% med to uafhængige shRNAs (figur 5B)

A:. de angivne celler blev transduceret med kontrol (PLV-ctrl ) eller sulf-2 shRNA (PLV-1413 PLV-1143). cellerne blev derefter inkuberet med BrdU i en time og BrdU-inkorporering blev påvist ved flowcytometri analyse. De viste værdier er middelværdien +/- SD s for 2 uafhængige eksperimenter. Forskellene i BrdU optagelse mellem ctrl og sulf-2 tavshed celler var statistisk signifikant for BxPC-3 (p 0,005), L3.6sl (p 0,007) og HS766T (p 0,001). B: BxPC-3 og L3.6sl pancreasceller blev transduceret med kontrol (PLV-ctrl) eller sulf-2 shRNA (PLV-1413 PLV-1143) blev høstet og inkuberet med PE-konjugeret annexin V. Efterfølgende celler blev udsat for flowcytometrianalyse. Forskellene mellem mellem ctrl og sulf-2 tavshed celler var statistisk signifikante med p-værdier på 0,0001 for BxPC-3 og p 0.004 for L3.6sl. C og D: L3.6sl celler blev transduceret med enten PLV-1413, PLV-1143 eller PLV-Ctrl og blandede populationer af siRNA og ikke-siRNA udtrykkende celler blev co-dyrket. Forhold på transducerede til ikke-transducerede celler blev målt over tid ved GFP-ekspression. BxPC-3-celler blev transduceret med enten pSico-ctrl eller pSico-1413 og transient transficeret med cre-rekombinase at aktivere ekspression af shRNA. De resulterende blandede populationer af celler med aktiveret (GFP-) og inaktiveret (GFP +) shRNA ekspression blev co-dyrket. Forhold på GFP + til GFP- celler, under anvendelse af flowcytometri blev analyseret som en funktion af tiden. Ekspression af GFP ikke har nogen virkning på cellevækst i kontrolgruppen befolkning.

For at undersøge cellevækst over tid i sulf-2 lyddæmpede celler, vi sammenlignet vækst af celler, hvor sulf-2 blev stille med ikke-transducerede parentale celler i en blandet kultur. I parallelle co-kulturer, sammenlignede vi væksten af ​​kontrol shRNA-transducerede celler med parentale ikke-transducerede celler. For begge de sulf-2 specifikke shRNAs, de ikke-lyddæmpet forældrenes L3.6sl celler gradvist overhalede de tavse celler med tiden i kultur. Lignende resultater blev set med BxPC-3-celler (Figur 5D). I modsætning hertil var der ingen ændring i forholdet mellem kontrol-transducerede celler til forældrenes celler over tid (figur 5C).

Silencing af sulf-2 hæmmer tumorvækst in vivo

For at bestemme virkningerne af sulf-2 lyddæmpning på tumorgenicitet af L3.6sl og BxPC-3 celler

in vivo

sammenlignede vi væksten af ​​tumorer, der dannes i immunsvækkede mus med eller uden tavshed af sulf-2. Nøgne mus (CD-1) blev injiceret subkutant med enten PLV-ctrl eller PLV-1413 transducerede celler 1 uge efter transduktion. Tumorstørrelse blev fulgt med tiden ved ekstern palpering. Ved slutningen af ​​eksperimentet blev dyrene aflivet, og tumorvægte blev målt. Som vist i figur 6, tumorer afledt af sulf-2 lyddæmpede celler (L3.6sl eller BxPC-3) voksede markant langsommere end dem, der stammer fra kontrolcellerne (figur 6b). De høstede tumorer fra lyddæmpede celler blev reduceret tilsvarende i vægt og uden overlap af de to grupper for enten cellelinje (figur 6C).

L3.6sl og BxPC-3-celler blev transduceret med enten PLV-1413 eller PLV -ctrl og subkutant injiceret i nøgne mus ved 5 × 10

6 per site. A: L3.6sl afledte tumorer høstet fra mus efter 17 dages vækst B: Tumor størrelse blev overvåget over tid og værdier repræsenterer middelværdien (+/- SEM) af 4 mus for L3.6sl celler og 6 (PLV-ctrl) eller 5 (PLV-1413) mus for BxPC-3-celler. C: Dyr blev aflivet, og tumorvægt blev undersøgt. Forskellen i tumor vægte mellem de to grupper var signifikant for L3.6sl celler med en p-værdi på 0,01 og for BxPC-3 celler med en p-værdi på 0,029 (Student t-test).

diskussion

den fremherskende opfattelse i litteraturen har været, at Sulfs er negative regulatorer af tumorcellevækst. En række rapporter vist, at overekspression af sulf-1 [28] – [34] eller sulf-2 [32] i tumorcellelinier hæmmet vækst faktor signalering som respons på flere faktorer, herunder FGF-2, HB-EGF, og HGF. Desuden blev tumorgenicitet af sulf-overudtrykkende celler i immunokompromitterede mus formindsket [31], [32], [34]. De negative virkninger af Sulfs på FGF-2 signalering er i overensstemmelse med den kendte krav til 6S på HSPGs i FGF-2 signalering kompleks [37]. Disse resultater cellelinie har ført til det forslag, at nedregulering af Sulfs kunne give tumorceller med en vækstfordel i visse indstillinger. Denne model kan have gyldighed for den betydelige delmængde (to tredjedele) af æggestokkene kræfttilfælde [28], og den mindre delmængde (29%) af hepatocellulært carcinom sager [30], hvori

SULF1

udtryk nedreguleres i forhold til at i normalt væv. Men modellen er problematisk for de betydelige delmængder af flere kræftformer, der viser stigninger i

sulf

udtryk. Således kan for eksempel,

SULF1

opreguleres i signifikante undergrupper af brystcancer [38], pancreascancer [31], [39] (tabel 1) lungeadenokarcinom [40] og hepatocellulært carcinom [30], mens

SULF2

opreguleres i myelomatose [32], brystkræft og CNS-kræft [41].

for at forstå betydningen af ​​opreguleret

sulf

udtryk i en cancer, vi valgte at fokusere på bugspytkirtlen adenocarcinomer grund af klare beviser forbinder denne kræft med kanoniske Wnt signalering, en signalvej kendt for at være positivt reguleret af Sulfs under udvikling (se ovenfor). I overensstemmelse med udskrift udtryk data (tabel 1), fandt vi, at begge Sulfs var stærkt udtrykt på proteinniveauet ved maligne epitelceller i bugspytkirtlen adenocarcinom. For at lette undersøgelse af disse enzymer i bugspytkirtelkræft, vi undersøgte

sulf

udtryk i et stort panel af pancreas adenocarcinom cellelinjer og fundet udbredt udtryk, især for

SULF2

. Vi valgte 4 linjer for studier, som alle udtrykte sulf-2 protein og hvoraf den ene udtrykte begge Sulfs. Tidligere undersøgelser har vist, at proliferation og overlevelse af 3 af disse (BxPC-3, HS766T og L3.6sl) afhænger aktiveret Wnt signalering [M. Pasca di Magliano og M. Hebrok, upublicerede observationer]. Vi viste, at Wnt signalering blev markant inhiberet af overekspression af rekombinant SFRP-2 i disse cellelinier. Desuden overekspression af katalytisk inaktiv sulf-2 i de samme linjer resulterede i en markant inhibering af Wnt aktivitet, og eksponering af cellerne til inaktive sulf-2-protein under dyrkning inhiberede både Wnt signalering og vækst. Disse resultater er konsistente med Wnt-ligand afhængig vækst af disse celler ( “autokrin Wnt signalering”), der moduleres af den ekstracellulære Sulfs. Det er sandsynligt, at CFPAC-1-cellelinien, som var resistente over for alle disse behandlinger, bærer en aktiverende mutation i nedstrøms elementer af Wnt signalering pathway, som ville omgå behovet for ekstracellulære Wnt-ligander og Sulfs. Det skal bemærkes, at de Sulfs udgør en yderligere eksempel på en ekstracellulær faktor, som modulerer Wnt signalering.