PLoS ONE: Kvantitativ Identifikation af mutantalleler Derived fra lungekræft i Plasma Cell-Free DNA via Anomaly Detection Brug Deep Sequencing Data

Abstrakt

påvisning af sjældne mutanter bruger næste generation sekventering har betydelige muligheder for diagnostiske anvendelser . Afsløring cirkulerende tumor-DNA er den største anvendelse af denne fremgangsmåde. Den største hindring for dets anvendelse er den høje læse fejlprocent af næste generation af sequencere. Snarere end at øge nøjagtigheden af ​​de endelige sekvenser, vi har registreret sjældne mutationer ved hjælp af en halvleder sequencer og et sæt anomali detektionskriterier baseret på en statistisk model af den læse fejlprocent ved hver fejl position. Statistiske modeller blev udledt fra sekvensdata fra normale prøver. Vi har registreret epidermal vækstfaktorreceptor (

EGFR

) mutationer i plasmaet DNA fra patienter med lungecancer. Single-pass dyb sekventering ( 100.000 læser) var i stand til at opdage en aktiverende mutant allel i 10.000 normale alleler. Vi bekræftede fremgangsmåde under anvendelse af 22 prospektiv og 155 retrospektive prøver, hovedsagelig bestående af DNA oprenset fra plasma. En tidsmæssig analyse foreslog anvendelsesmuligheder for sygdom ledelse og til terapeutisk beslutningstagning at vælge epidermale vækstfaktor receptor tyrosinkinasehæmmere (EGFR-TKI).

Henvisning: Kukita Y, Uchida J, Oba S, Nishino K, Kumagai T, Taniguchi K, et al. (2013) Kvantitativ Identifikation af mutantalleler Derived fra lungekræft i Plasma Cell-Free DNA via Anomaly Detection Brug Deep Sequencing data. PLoS ONE 8 (11): e81468. doi: 10,1371 /journal.pone.0081468

Redaktør: Raya Khanin, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, USA

Modtaget: Marts 16, 2013; Accepteret: 13. oktober 2013; Udgivet: November 21, 2013 |

Copyright: © 2013 Kukita et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Osaka Medical center for Kræft og hjerte-karsygdomme. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

for nogle molekylære målrettede lægemidler mod kræft, undersøgelse af genomiske ændringer i målgener er blevet en diagnostisk rutine og er uundværlig for behandling beslutninger. For eksempel, de stærke virkninger af epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinasehæmmere (EGFR-TKI’er, dvs. gefitinib og erlotinib) er på ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) korreleret med aktivering somatiske mutationer i

EGFR

[1,2]. Patienter, der administreres disse lægemidler aktuelt valgte baseret på tilstedeværelsen af ​​disse aktiverende mutationer. Identifikationen af ​​mutationerne er baseret på biopsiprøver; proceduren er invasiv og ofte vanskelig at udføre. En ikke-invasiv diagnostisk procedure er ønskelig.

Cell-frit DNA i blodet består af DNA afledt fra cancervæv og er blevet undersøgt for ikke-invasive diagnostiske procedurer [3]. Dette DNA, betegnes cirkulerende tumor DNA (ctDNA), er sjælden i blod, og dens opdagelse er en teknisk udfordring. Et antal metoder er blevet undersøgt, men de fleste af dem har begrænsninger i følsomhed og robusthed. Beaming (perler, emulsion, amplifikation og Magnetics) [4] er sandsynligvis den mest følsomme metode. I Beaming, er PCR-produkter amplificeret fra et enkelt molekyle fastgjort til en enkelt magnetisk perle hjælp emulsion PCR. Mutationen site er mærket med et fluorescerende probe eller primerforlængelse, og den muterede allel kvantitativt detekteres ved optælling af de fluorescerende mærkede perler. Straalende kvantificeres held

APC

og

KRAS

mutationer i ctDNA af kolorektal kræftpatienter [5,6] og

EGFR

mutationer i ctDNA af patienter med lungecancer [7] . På trods af sin høje følsomhed og kvantificering evne, har strålede ikke vundet i popularitet, fordi det er en omstændelig og forudsætter oligonukleotider til hver mutation position.

Da straalende og næste generation sequencere, dvs. massivt parallelle sequencere, bruge den samme eller en meget lignende skabelon forberedelse teknik, er det muligt at anvende næste generations sequencere til samme formål. Der har været flere undersøgelser af den dybe sekventering af cellefri DNA [8,9]. Disse undersøgelser antydet muligheden for tilgangen, men manglede kritisk evaluering af de detektionssystemer. Især de ikke løse problemet med flere test, som er uløseligt forbundet med diagnostiske anvendelser.

I denne rapport, vi etableret en metode til påvisning af

EGFR

mutationer i ctDNA i det perifere blod af patienter med lungecancer ved hjælp af single-pass dybe sekventering af forstærkede

EGFR

fragmenter . Den seneste udvikling i en halvleder sequencer (Ion Torrent PGM) [10] har rettet manglerne i andre aktuelt tilgængelige sequencere (dvs. en lang driftstid for en enkelt assay og høje driftsomkostninger) og gælder for diagnostiske formål. Vi anvendte anomali afsløring [11,12], og bestemt et sæt kriterier detektion baseret på en statistisk model af den læse fejlprocent ved hver fejl position. Metoden kvantitativt opdaget

EGFR

mutationer i celle-fri DNA på et niveau svarende til straalende, lovende ikke-invasiv diagnostik, der supplerer biopsi.

Resultater

Princippet om afsløring

Deep sekventering af et PCR-amplificeret fragment, der indeholder en mutation site kan udføres for at detektere og kvantificere muterede alleler blandt de enorme mængder af normale alleler afledt fra værtsvæv. Det største problem i forbindelse med denne tilgang er frekvensen af ​​fejl introduceret under sekventering og PCR-amplifikation. Det centrale spørgsmål her er indstillingen og præcis vurdering af detektionsgrænser. Når frekvensen af ​​en ændring base ved en mål-locus er højere end en forudbestemt læse fejlrate (RER), kan vi vurdere ændringen at skyldes tilstedeværelsen af ​​en mutant sekvens. Det vil sige, anomalier, der falder væsentligt uden for RER fordeling betragtes som mutationer. RER er defineret som fejlprocenten beregnes fra endelige sekvens data, herunder fejl i både sekventering og PCR-trin. I anomalisøgning [11,12], som i hypoteseafprøvning, falske positive styres baseret på en statistisk model. I vores tilfælde, kan den statistiske model af RER konstrueres ud fra sekvensdata fra målet regioner af et tilstrækkeligt antal normale individer, der bærer ingen mutationer.

Hvis der opstår læsefejl under en sandsynlighedsfordeling, kan estimeres antallet af læser kræves for at opnå en vis detektionsgrænse. Figur 1a viser forholdet mellem detektionsgrænsen mutationen, læse dybde, og RER på et signifikansniveau på p = 2×10

-5 for hver enkelt detektion uden multiplicitet korrektion, forudsat at læsefejl opstår efter en Poisson-fordeling. Dataene illustreret i figur 1a leveres i tabel S1. Med et stigende read dybde og faldende RER, falder detektionsgrænsen. I en tidligere undersøgelse foretaget af vores gruppe [7], detektionsgrænsen for sjældne mutant alleler ved brug af strålende [4] var 1 ud af 10.000 (0,01%). Fordi en analyseprøve plasma DNA indeholder ca. 5.000 molekyler, dette detektionsgrænsen er rimelig. Dette mål kan opnås med 100.000 læser når RER er under 0,01%.

a, Forholdet mellem den læste fejlprocent, læse dybde, og detektionsgrænsen for mutationer, når signifikansniveauet er p = 2×10

-5. Vandret akse, læse dybde; lodret akse, detektionsgrænse (%). Fra top til bund, hver linje angiver en læst fejlrate (RER) på 1%, 0,2%, 0,05% eller 0,01%. B, Tre-dimensionel repræsentation af substitution RER. x-aksen, base-positioner af EGFR exoner 19-21. Fra venstre mod højre, de pilespidser angiver holdninger T790M, L858R, og L861Q. y-aksen, 48 DNA-prøver fra normale individer. Fra front til bag, konverteringer til A (grøn), er C (gul), G (magenta) eller T (blå) justeret for hver prøve. z-aksen, RER (%). C, tredimensionel fremstilling af indsættelses /deletion fejl. x-aksen, base-positioner af EGFR exoner 19-21. Baren angiver positionen af ​​exon 19 deletion. y-aksen, 48 DNA-prøver fra normale individer. Blå, plasma-DNA; lyseblå, WBC DNA (stor mængde); mørkeblå, WBC DNA (lille mængde). z-aksen, RER (%). d, Fordeling af RER. Hvid søjle, substitution fejl; grå kolonne, indsættelse /sletning fejl. Vandret akse, række RER (%); lodret akse, hyppigheden (%).

Læs fejl på

EGFR

target omegn

For EGFR-TKI behandling, en aktiverende

EGFR

mutation er tegn på behandlingseffekt [ ,,,0],1,2]. Patienter, der skal indgives disse lægemidler er i øjeblikket vælges baseret på tilstedeværelsen af ​​disse aktiverende mutationer. Ud over at aktivere

EGFR

mutationer, en resistent

EGFR

mutation kendt som T790M vises i ca. halvdelen af ​​patienterne underkastes EGFR-TKI behandling [13,14]. , Tre aktiverende mutationer, dvs. en sletning i

EGFR

Således exon 19 og L858R og L861Q i

EGFR

exon 21, samt T790M resistente mutation i

EGFR

exon 20 blev udvalgt som mål loci.

Vi bestemmes rers i en 169 basis region omkring målet loci består ved at udføre dybe sekventering af DNA-prøver fra normale individer. Vi brugte en Ion Torrent PGM [10] sequencer for dette arbejde. Single-pass sekventering blev udført, og antallet af læser varierede fra 44.400 til 373.000, i gennemsnit 162.000. Vi ansat tre typer af DNA-prøver: 19 plasma DNA-prøver med mængder kan sammenlignes med patienternes prøver, 16 leukocyt (hvide blodlegemer, WBC) DNA-prøver med beløb, der var 10 eller 50 gange størrelsen af ​​en patients prøve og 13 WBC DNA prøver med beløb, der var en tiendedel af størrelsen af ​​en patients prøve. Vi delte substitutionsreaktioner fejl i fire mønstre, svarende til omdannelse til A, C, G eller T. Der var således 507 mulige typer af substitutioner (169 basepositioner x 3 mønstre) i målområdet. En substitution RER er grafisk vist i figur 1B, bortset fra konvertering fra G til A ved stilling 2.361 grundet en hyppig SNP. Substitutionen rers ikke er ensartet, er heller ikke uafhængige af hinanden, og høje rers er forbundet med specifikke basepositioner. Desuden ene substitutionsmønster er dominerende på hver base position. En RER insertion /deletion er vist grafisk i figur 1c. Vi har ikke skelne mellem sletning og indsættelse fejl, da indsættelser ofte er anerkendt som sletninger og vice versa ved sekvens alignment software. RER Indsættelsen /sletning er generelt højere end RER substitution. observeres en tendens ligner substitution, idet høj indsættelse /sletning rers er forbundet med specifikke base-positioner. Figur 1d viser fordelingen af ​​rers. Der var væsentlige forskelle mellem substitution og indsættelse /sletning rers. I 410 ud af de mulige 506 typer af substitution (81,0%), var RER lavere end 0,01%. I modsætning hertil ud af de 169 typer insertioner /deletion, var RER lavere end 0,01% på kun 79 (46,7%). Disse resultater er aftalt med tidligere rapporterede observationer fra PGM-platformen [15]. Dataene illustreret i figur 1b og 1c leveres i tabel S2 og S3, hhv.

På grund af høj indsættelse /sletning læsefejl, vi ansat en metode til at påvise de exon 19 deletionsmutationer. Vi forberedte otte skabelon exon 19 sekvenser med repræsentative sletninger og screenet de sletning sekvenser ved at matche dem med de skabelon-sekvenser. Denne metode var ganske effektiv til screening ud læsefejl; ingen sekvenser med sletning læsefejl blev fundet blandt de 48 testede prøver.

Statistiske modeller af læse- fejlprocenter og kriterier for anomalisøgning

Vi derefter undersøgte statistiske modeller af læsefejl. I en Poisson fordeling model, er gennemsnittet og variansen af ​​antallet af tilfælde forventes at være den samme, og bestemmes af parameteren intensitet

lambda

. Her, i stedet for at bruge RER blev læse fejl forekomst præsenteret som forekomsten i 100.000 læser, og dens gennemsnitlige og varians ved hver baseposition blev beregnet. Forholdet mellem den gennemsnitlige og varians er vist i figur 2a og Figur S1 i File S1 for substitution og indsættelse /sletning læsefejl hhv. I begge tilfælde bliver variansen er større end gennemsnittet i en betydelig del af de sager. I disse tilfælde, vil anvendelse af Poisson-fordelingen føre til øget antal falske positiver. Dette fænomen, kaldet “overdispersion”, er almindelig i biologiske undersøgelser, og i sådanne tilfælde er en negativ binomialfordeling anvendt [16]. Overdispersion skyldes udsving i intensitet parameter, og det er rationelt at antage, at intensiteten parameter følger en gamma fordeling. Under dette scenario, forekomsten nummer følger teorien en negativ binomialfordeling. I figur 2b, er stigningen i tærsklen for substitution fra en Poisson til en negativ binomialfordeling afbildet mod variansen /gennemsnitlige forhold mellem den læste fejl for substitutionen typer, hvis varians /gennemsnitlige forhold varierede fra 1 til 2. Når forholdet overskredet ca. 1,2-1,4, var der betydelige stigninger i tærskel. Således konstruerede vi vores statistiske model af hver alternativer efter følgende kriterier.

a, Forholdet mellem gennemsnittet og variansen af ​​substitution fejl præsenteret som antallet pr 100.000 læser. Vandret akse, gennemsnit; lodret akse, varians. Den røde linje angiver, hvor gennemsnittet og variansen er ens. b, Forskel mellem tærskler opgjort efter en negativ binomialfordeling og en Poisson-fordeling. Tærsklen er det mindste antal af baseændringer i 100.000 læser møde den grad af statistisk signifikans (p-0,01). Vandret akse, varians /gennemsnitlige forhold for substitution læsefejl; lodret akse, forskel mellem tærsklerne. De typer af substitutioner, hvis varians /gennemsnitlige forhold varierede fra 1 til 2 afbildes. c, nøjagtighed kvantificering. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet af tre assays. Vandret akse, del af mutante alleler i kunstige produkter; lodrette akse, brøkdel af mutant alleler anslået fra dyb sekventering. d, Reproducerbarhed af kvantificering. Vandret akse, baseændring sats i første forsøg; lodret akse, baseændring sats i det andet forsøg.

1. Når den gennemsnitlige læsefejl i 100.000 læser var mindre end 1, en Poisson-fordeling med λ sæt til 1 blev påført (169 typer af substitutioner).

2. Hvor gennemsnittet var større end 1, og variansen /gennemsnitlige forhold mellem læse fejl var mindre end 1,2, blev en Poisson-fordeling anvendt (15 typer af substitutioner).

3. Hvor gennemsnittet var større end 1, og variansen /gennemsnitlige forhold mellem læse fejl var større end 1,2, blev en negativ binomialfordeling anvendt (323 typer af substitutioner).

exon 19 sletning og L858R tilhørte den første kategori, mens L861Q og T790M mutation sites tilhørte den anden og tredje kategori, hhv. Detektionsgrænserne for exon 19 deletion og L858R, L861Q og T790M substitutionsmutationer på et signifikansniveau på p = 2×10

-5 var mindre end 0,01% og mindre end 0,01%, 0,01% og 0,05% henholdsvis . I den følgende analyse, vi brugte p = 2×10

-5 som tærskel betydning for hver enkelt påvisning, uden at overveje en mangfoldighed korrektion, forventer en falsk positiv i 50.000 prøver.

Omridset af metoden er 1) amplifikation af

EGFR

fragmenter med exon-specifikke primere fra plasma DNA; 2) dyb sekventering af

EGFR

fragmenter med PGM ( 100.000 læser /fragment), der kombinerer PCR-produkterne; 3) matcher output sekvenser med

EGFR

skabelon sekvenser; 4) påvisning af sletninger og erstatninger, og konvertering af antal hændelser i det i 100.000 læser; og 5) vurdering af baseændringer med kriterierne for anomali afsløring. I anomalisøgning er de baseændringer bedømmes som mutationer når antallet af hændelser i 100.000 læser er lig med eller overstiger tærskelværdien (exon 19 deletion, 7; L858R, 7; L861Q, 12; T790M, 60). En skematisk fremstilling er vist i figur S2 i File S1.

Quantitativity og reproducerbarhed

Først undersøgte vi metodens kvantificering evne. Vi forberedte testprøver herunder forskellige fraktioner af PCR-produkter fra muterede

EGFR

fragmenter. Der var en meget god linearitet (

r

= 0,998) mellem de podede mængder af PCR-produkterne og de observerede mutant-til-normal allel nøgletal udledes af dyb sekventering (Figur 2c). Vi undersøgte derpå metodens reproducerbarhed ved anvendelse plasmaprøver fra patienter med lungecancer hvis primære læsioner blev bekræftet at bære aktiverende mutationer. Fraktionerne af de mutante alleler målt i to forsøg er afbildet i figur 2d. En høj konkordans (

r

= 0,989) blev observeret, undtagen i prøver, der indeholdt små mængder af de mutante alleler, svarende til en ca. 0,3% fraktion af allelerne tilstedeværende eller derunder. I disse tilfælde den indledende fase af PCR-amplifikation var sandsynligvis vellykket på grund af det lave antal af mutante skabeloner, der anslås til 15 kopier eller mindre. Således kvantifikationsgrænsen var ca. 0,3%.

Validering med prøver fra lungekræftpatienter

Vi vurderede vores metode yderligere hjælp lungekræft biopsi prøver, prøveudtagning plasma-DNA og den primære læsion samtidig som en del af en prospektiv undersøgelse. Resultaterne for prøverne fra 22 patienter viste 86% konkordans (95% konfidensinterval 66 – 95), 78% (44 – 93) følsomhed, og 92% (66 – 98) specificitet, indstilling af vævsbiopsi som standard. Disse resultater er lovende med hensyn til udviklingen af ​​et diagnostisk værktøj til at supplere lungekræft biopsi.

Vi analyserede derefter i alt 155 prøver: 144 prøver fra plasma, otte fra cerebrospinalvæske, og en hver fra urin, pleural effusion, og bronkial alveolær lavage. Som for plasmaprøver blev to eller flere prøver opnået fra 32 patienter på forskellige tidspunkter af sygdommen kurser. Alle de opnåede data er vist i tabel S4. Kliniske data for patienter, herunder stadium, histologi, behandling, og status af resistens over for EGFR-TKI er også opført i denne tabel. Blandt de 33 patienter, der er forbundet med en primær læsion indeholdende exon 19 deletion, blev denne mutation findes i mindst én af plasmaprøverne fra 24 patienter (72,7%). Af de 23 patienter, hvor den primære læsioner udviste de L858R eller L861Q substitutioner, blev disse mutationer findes i mindst én af plasmaprøverne fra 18 patienter (78,2%). En dobbelt mutation (samtidig påvisning af exon 19 deletion og L858R) blev observeret i 12 plasmaprøver, selvom dobbelte mutationer ikke er hyppige i biopsiprøver. Uoverensstemmelser mellem aktivering mutationen typer identificeret i biopsi og plasma DNA-prøver blev observeret i fem plasmaprøver. T790M blev fundet i 13 ud af 57 plasmaprøver (22,8%) fra patienter med EGFR-TKI-resistens, og i 7 ud af 87 plasmaprøver (8,0%) uden EGFR-TKI resistens. Salg

permanente ændringer af

EGFR

mutation niveauer under sygdomsforløbet

Et betydeligt antal prøver blev indsamlet fra den samme patient på forskellige tidspunkter i sygdomsforløbet. Permanente ændringer af

EGFR

mutation i plasma DNA fra patienter med tre eller flere prøver er skematisk vist i figur 3. På grund af den forholdsvis korte prøvetagningsperiode prøver blev opnået fra kun en del af sygdomsforløbet i de fleste tilfælde . Vi fokuserede på to overgange: overgang på grund af EGFR-TKI-behandling initiering og at efter at erhverve EGFR-TKI modstand. Data før behandlingsstart blev opnået i seks sager. Et signifikant fald i aktiveringen af ​​mutation niveauer med behandlingen blev set i alle tilfælde (p = 1.7×10

-4). Afslutning af ctDNA ved behandlingsstart er et generelt fænomen.

Hver prik repræsenterer et tidspunkt for prøveudtagning. Diagrammet er ikke præcis gengivelse af tid skala, og kun rækkefølgen af ​​prikker er gyldige oplysninger. Tallene repræsenterer

EGFR

mutationer i 10.000 sekvens lyder: sort, exon 19 sletning; blå, L858R; rød, T790M. Kun tal ligger over de beløbsgrænser vises. “Mutation type” angiver, at i de biopsi prøver.

Data blev indhentet både før og efter at erhverve EGFR-TKI modstand i syv tilfælde. Efter erhvervelse resistens, blev aktiveringen af ​​mutation niveau steg i fem patienter (218, 226, 259, 61, 66), faldt i en patient (44), og forøget med forsinkelse i en anden patient (178). Forøgelse af aktivering af mutationer kan korrelere med sygdomsudvikling. På trods af den klare sammenhæng mellem T790M og EGFR-TKI-modstand status i ovennævnte valideringsundersøgelse dynamik T790M under sygdomsforløbet var ikke så klart som for aktivering af mutationer; T790M ofte optrådte før erhverve modstand.

Tre patienter er beskrevet mere detaljeret. Patient 226 blev behandlet med gefitinib som første linje kemoterapi. Den gefitinib behandling blev stoppet flere gange på grund af bivirkninger. En radiologisk respons (partielt respons, PR) blev observeret fra måned 1 til måned 9, og sygdomsprogression blev observeret i måned 10. Forud for gefitinib behandling, den del af den mutante allel var meget høj ( 50%), men efter kun en uge efter denne behandling, den del af den mutante allel faldt til 0,3%, før eventuelle radiologiske ændringer (figur S3A i File S1). T790M optrådte ved 10 måneder, når sygdomsprogression begyndte. Patient 243 udstillede også en skæv fald i mutant allel fraktionen ved initiering af gefitinibs behandling (Figur S3b i File S1). Denne patient blev behandlet med kirurgi og adjuvans kemoterapi (CDDP plus VNR) tidligere, og derefter udsat for gefitinib. Patient 41 præsenteret med progression af neoplastisk meningitis, og blev udsat for kombineret erlotinib-pemetrexed. Tidligere behandlinger var CDDP plus gemicitabine, gefitinib og erlotinib. En mindre radiologisk respons blev observeret fra måneder et til fire og sygdomsprogression forekom efterfølgende. Der var en skæv fald i den mutante allel fraktion ved begyndelsen af ​​terapien, og stigningen på sygdomsprogression var kun lille (fig S3C i File S1). Det skal bemærkes, at respose af ctDNA til EGFR-TKI behandlingsstart var hurtig i alle tre tilfælde (patient 229, en uge 243, to uger, 41, en måned).

Mutation detektion i hele target omegn

Vi udforskede muligheden for at identificere substitutionsmutationer i hele mål

EGFR

region svarende til 503 typer af erstatninger, bortset L858R, L861Q og T790M. Fordi signifikansniveau blev sat til p = 2×10

-5 for hver afsløring blev falske positiver forventes at forekomme én gang i 100 prøver. I virkeligheden blev der fundet en median på tre substitutioner per prøve. Fordelingen af ​​antallet af substitutioner per prøve er vist i figur 4a. På baggrund af erfaringerne fra de biopsiprøver, de fleste af disse udskiftninger var sandsynligvis falske positiver. En betydelig del af de forskellige typer af substitutioner fremlagt nogen falske positive (56,2%, figur 4B), og de statistiske modeller var af praktisk anvendelse med disse typer af substitutioner. For andre parameterestimering fra data fra 48 normale individer ikke er tilstrækkeligt konservativ for udelukkelse af falske positiver.

a, Fordeling af antallet af forskellige typer af substitutioner anses som mutationer per prøve. Vandret akse, antal af de typer af substitutioner; lodret akse, antal prøver. B, Fordeling af antallet af prøver med en substitution typen bedømt som en mutation. Vandret akse, antallet af prøver med en substitution typen bedømt som en mutation; lodret akse, antal af de typer af substitutioner.

Diskussion

Sjælden mutation påvisning af target loci gennem den dybe sekventering af plasma-celle-fri DNA har en sammenlignelig følsomhed over for straalende. Specificiteten er også acceptabelt, fordi

EGFR

mutation typer i biopsi og plasmaprøver udstillet en høj post. Således har sjælden mutation detektion med dyb sekventering nu nået et tilstrækkeligt niveau til at fortsætte til bekræftelse gennem en prospektiv undersøgelse. Fremgangsmåden kan anvendes på et begrænset antal mål-loci på ethvert baseposition; hjælp parret udgang metode eller sekventering fra den modsatte retning ville øge nøjagtigheden af ​​høj fejlprocent positioner, øget følsomhed og specificitet til acceptable niveauer.

Det er imidlertid vanskeligt at udvide mutationsdetektion til et større område. Forekomsten af ​​falske positiver er ikke acceptabelt for diagnostiske anvendelser. Parameterestimering med øgede antal normale prøver og /eller mere konservative estimering metoder, såsom Bayesiansk inferens, kan nedsætte falske positiver. Vi anvendte mutation-fri DNA fra normale individer til undersøgelsen af ​​læsefejl, men mutationsdetektion blev udført med plasma-DNA fra patienter med lungecancer. En mulig årsag til de utilstrækkelige tærskler kan være forskellen i DNA kvalitet. Den nylige opdagelse af artefakt mutationer indført under eksperimentelle processer [17] antyder muligheden af ​​endnu uopdagede årsager til artefakter ved hjælp plasmaprøver.

Vores procedure er optimeret til vores mål og sociale miljø, men der er plads til tekniske forbedringer. Ud over den parrede ende metode [9], fremgangsmåder producere fejlfri sekvenser gennem gentagen sekventering af skabeloner fra et enkelt molekyle [18,19] at anvendes på forbedre nøjagtigheden. Vi ansat små mængder plasma DNA til PCR-amplifikation på grund af de etiske standarder for vores hospital og relevante regionale sygehuse. Men i en anden sociale miljø, ved anvendelse af en forøget mængde af plasma-DNA kan forbedre reproducerbarheden af ​​påvisning af lav-niveau mutationer.

Ud over at blive anvendt til ikke-invasiv diagnose af

EGFR

mutationer, som vist i de ovennævnte tidsmæssige analyser, er denne fremgangsmåde også informativt til at belyse dynamikken i mutante alleler i løbet af sygdommen. Især bør det bemærkes, at en skæv fald i den mutante allel fraktion forud radiologiske ændringer, som sandsynligvis vil være nyttige til forudsigelse af lægemiddel effektivitet.

biopsier af avancerede tilfælde og gentagne biopsier er teknisk krævende, og erstatte den med en ikke-invasiv metode ville være gavnligt. I denne sammenhæng vil overvåge T790M med vores metode har væsentlige fordele for patientbehandlingen. For eksempel ville detektere T790M mutation i blodprøver være anvendelige til patient selektion for behandling med nye EGFR-TKI’er for lungekræft, som er resistente over for gefitinib og erlotinib [20].

Nylige to undersøgelser tyder andre muligheder for ctDNA analyse. Dawson et al. fulgt dynamikken i ctDNA i metastatiske brystkræftpatienter hjælp mutationer i

TP53

og /eller

PIK3CA

, og fundet sin fortjeneste til overvågning sygdomsprogression [21]. Anvendelse af fælles mutationer kan muliggøre dens anvendelse på en lang række tumorer. Tværtimod vores forskning fokuseres mere specifik, dvs. mutationsdetektion til terapeutisk beslutningstagning, selvom der også kan anvendes vores fremgangsmåde til deres formål. Murtaza et al. udført exome sekventering ved hjælp plasma DNA fra kræftpatienter [22], kan Analyse af kræft genomer på noget tidspunkt i sygdomsforløbet afdække genetiske ændringer, der fører til sygdomsprogression eller resistens. Analyse af ctDNA vil få en enorm værdi i videnskabelige og diagnostiske aspekter af kræftforskning.

Materialer og metoder

Patient karakteristika

Patienter med aktiverende EGFR mutationer i tumorvæv blev rekrutteret på Osaka Medical center for Kræft og hjerte-karsygdomme. Pleural væske, cerebrospinalvæske og /eller urinprøver blev opsamlet fra nogle patienter. I alle patienterne, aktivering

EGFR

mutationer blev fundet i biopsiprøver under anvendelse af PNA-LNA PCR clamp-metoden [23]. Den respons på behandlingen og sygdomsprogression var hovedsageligt vurderet fra radiologiske data baseret på RECIST kriterier [24].

DNA ekstraktion fra flydende prøver

Plasma blev fremstillet via centrifugering af 4-5 ml EDTA-behandlet blod ved 800

g

i 10 minutter ved stuetemperatur. Plasmaet blev overført til et frisk rør og re-centrifugeret ved 15.100

g

i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter centrifugering blev den øvre plasma overføres til et frisk rør. Pleural væske og urinprøver blev centrifugeret ved 800

g

i 10 minutter ved stuetemperatur, og supernatanterne blev overført til friske rør. Centrifugerede flydende prøver blev nedfrosset ved -80 ° C indtil DNA-ekstraktion. Cerebrospinalvæske blev nedfrosset uden centrifugering. DNA blev ekstraheret fra 1,5-2,0 ml af en flydende prøve (eller 5 ml urin) under anvendelse af QIAamp cirkulerende nukleinsyre (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. DNA-koncentrationen blev bestemt ved måling kopiantallet af LINE-1 [25] eller under anvendelse qubit’en ssDNA Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

Amplikon bibliotek konstruktion og dyb sekventering

Sequencing bibliotek konstruktion.

For at forstærke målregioner i

EGFR

gen, PCR primerpar blev designet med Primer3 (https://frodo.wi.mit.edu/). Primerpar har 5-nt indekser (for at diskriminere personer) og adapter sekvenser for halvleder-sekventering. Positioner af PCR-målregioner og primersekvenser er vist i tabel S5. PCR-amplifikation blev udført i et 50 pi reaktionsblanding indeholdende plasma DNA opnået fra 300 pi plasma (10 ng eller mere), 20 pmol af hver primer og 1 enhed af KOD -Plus- DNA-polymerase (Toyobo, Osaka, Japan). For at analysere læse fejl, anvendte vi genomisk DNA fra plasma eller leukocytter fra raske individer som en PCR template. Cykel profil var som følger: 2 minutter ved 94 ° C i indledende denaturering, efterfulgt af 40 cykler af 15 sekunder ved 94 ° C til denaturering, 30 sekunder ved 55 ° C til annealing, og 50 sekunder ved 68 ° C i forlængelse. Produkterne blev oprenset ved anvendelse af QIAquick 96 PCR Purification Kit (Qiagen) eller MinElute PCR Purification Kit (Qiagen), og DNA-koncentrationen blev bestemt ved anvendelse af Quant-iT ™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit (Life Technologies) eller et ND-1000 Figur S2. Figur S3.