PLoS ONE: Identifikation og funktionel analyse af epigenetisk Silenced MikroRNA’er i Colorectal Cancer Cells

Abstrakt

Unormal microRNA (miRNA) udtryk har været knyttet til udvikling og progression af flere humane kræftformer, og sådan dysregulering kan skyldes afvigende DNA methylering. Mens et lille antal miRNA er kendt at være reguleret af DNA-methylering, vi postuleret, at en sådan epigenetisk regulering er mere udbredt. Ved at kombinere MBD-isolerede Genome Sequencing (MiG) for at evaluere genom-dækkende DNA methylering mønstre og microarray analyse for at bestemme miRNA ekspressionsniveauerne, vi systematisk søgt efter kandidat miRNA reguleret af DNA methylering i kolorektale cancer cellelinjer. Vi fandt 64 miRNA skal håndfast methyleres i HCT116 celler; atten af ​​dem blev placeret i prægning regioner eller allerede rapporteret at være reguleret af DNA methylering. For de resterende 46 miRNA, ekspressionsniveauerne af 18 var i overensstemmelse med deres status DNA-methylering. Endelig 8 miRNA opreguleret med 5-aza-2′-deoxycytidin behandling og identificeret til at være hidtil ukendte miRNA reguleret af DNA-methylering. Desuden viste vi den funktionelle relevans af disse epigenetisk tavshed miRNA ved ektopisk udtrykker udvalgte kandidater, hvilket resulterede i hæmning af vækst og migration af kræftceller. Ud over at rapportere disse resultater, vores undersøgelse giver også en pålidelig, systematisk strategi for at identificere DNA methylering-regulerede miRNA ved at kombinere DNA methylering profiler og udtryk data

Henvisning:. Yan H, Choi Aj, Lee BH, Ting AH (2011) Identifikation og funktionel analyse af epigenetisk Silenced MikroRNA’er i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 6 (6): e20628. doi: 10,1371 /journal.pone.0020628

Redaktør: Axel Imhof, Ludwig-Maximilians-Universität München, Tyskland

Modtaget: Januar 24, 2011; Accepteret: 6 maj 2011; Udgivet 16. juni, 2011

Copyright: © 2011 Yan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodende. RNA, der regulerer genekspression og spiller afgørende roller i normale cellulære processer, herunder proliferation, differentiering og apoptose [1]. Både afvigende ekspression og nedregulering af miRNA er blevet observeret i humane cancere, hvilket antyder potentielle onkogene og tumor suppressor funktioner for disse miRNA [2], [3]. Biogenesen af ​​miRNA involverer transskription af en lang primært transkript (PRI-miRNA) med RNA-polymerase II [4], spaltning af et mellemprodukt (pre-miRNA) ved drosha [5], og endelig forarbejdning til det modne miRNA ved Dicer [ ,,,0],6]. Hvert trin i processen er stærkt reguleret, og dysregulation på alle niveauer kan resultere i uhensigtsmæssige miRNA funktioner. Af særlig interesse for vores undersøgelse er miRNA transkriptionel regulering af DNA methylering. Generelt genpromotor DNA-methylering negativt korreleret til genekspression og kan redegøre for afvigende tumorsuppressorgen inaktivering i en række forskellige humane cancere [7]. Svarende til disse POLR2A transskriberet protein-kodende gener, kan miRNA transskription også bragt til tavshed af promotor-DNA methylering.

epigenetisk tavshed miRNA er blevet opdaget i kræft baseret på forskellen udtryk mellem normale væv og tumorer eller mellem baseline og DNA demethyleret kræft celler. For eksempel Bandres

et al.

Først identificeret 23 miRNA, der er nedreguleret i primære tarmkræft sammenlignet med matchede normal kolorektal epitel og efterfølgende opdagede, at miR-129-2, miR-9-1, og miR -137 er bragt til tavshed ved hjælp af DNA methylering i kræft [8]. Toyota

et al.

Behandlet HCT116 kolorektal cancer celler med demethyleringsmiddel, 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC), og sammenlignet miRNA udtryk profiler mellem de behandlede og de ubehandlede celler til at identificere inaktivering af mIR-34b /c ved promotor-DNA hypermethylering [9]. Desuden Lujambio

et al.

Sammenlignede miRNA udtryk profil vildtype HCT116 celler med den for dens demethyleret isogene derivat, DNA methyltransferase -1 og -3b Double Knockout (DKO) celler, og fundet 18 miRNA opreguleret i DKO-celler [10]. Efterfølgende de bekræftede, at DNA-methylering er ansvarlig for lyddæmpning af miR-124a i tyktarmskræft.

En søgning litteratur ved hjælp af MEDLINE afslørede, at 16 miRNA er kendt for at være epigenetisk bragt til tavshed af DNA methylering [8], [9 ], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. DNA-methylering refererer til den kovalente addition af en methylgruppe til 5-stillingen af ​​cytosiner, sædvanligvis i et CpG-dinukleotid kontekst i mammale differentierede celler [18]. Genomiske regioner med en høj tæthed af CpG’er betegnes CpG øer og er ofte de steder, regulatoriske DNA methylering. I betragtning af at 16% af de kommenterede menneskelige miRNA er beliggende inden for 1000 bp af en CpG ø [19], vi formode, at epigenetisk regulering af miRNA kan være mere udbredt end rapporteret hidtil. Tidligere undersøgelser har påberåbt sig differentieret udtryk for miRNA til at identificere kandidater til efterfølgende epigenetisk evaluering. Denne fremgangsmåde introducerer bias, som begrænser antallet af epigenetisk regulerede miRNA der kan opdages. For eksempel kan vævsspecifikke miRNA, som reguleres af DNA-methylering være ækvivalent methyleret i normale væv og tumorer, hvilket resulterer i en mangel på differentiel ekspression mellem normale og cancerøse prøver. Desuden miRNA med lavt ekspressionsniveau ikke pålideligt kan identificeres, fordi forskellene i udtryk mellem normal og kræft eller mellem baseline og demethylerede forhold der sandsynligvis vil falde under konventionelle cutoffs (mellem 2 og 1,5 gange). Endelig resterende methylering fortsætter i både farmakologisk og genetisk demethylerede celler [20]. En sådan methylering kan være kritisk for opretholdelsen af ​​cellelevedygtighed, eventuelt gennem vedvarende undertrykkelse af centrale miRNA. Dette vil resultere i sådanne miRNA ikke bliver identificeret gennem udtryk-baserede strategier.

For at overvinde opdagelsen skævhed indført ved ekspression-baserede identifikation strategi, vi umiddelbart udnyttet globale DNA methylering mønstre til at identificere miRNA reguleret af DNA methylering i HCT116 og DKO tyktarmskræft celler. Vi har tidligere kortlagt hele genomet DNA-methylering i disse cellelinier ved anvendelse af methyl CpG bindende domæne (MBD) -isolated Genomsekvensering (MiG’erne) [21]. Vi identificerede første miRNA med proksimale DNA methylering som kandidater. Vi derefter krydshenvisninger kandidatlisten med miRNA udtryk data som dokumentation. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, vi med succes identificeret både kendte og hidtil ukendte DNA-methylering-regulerede miRNA. Her giver vi et mere omfattende katalog af epigenetisk regulerede miRNA i tyktarmen kræftceller, viser, at epigenetisk regulering af miRNA er udbredt i disse kræftceller. Desuden funktionelle studier af udvalgte miRNA giver biologisk relevans for sådan epigenetisk regulering i forbindelse med tyktarmskræft.

Resultater

Kandidat miRNA reguleret af DNA methylering blev identificeret ved proksimal genomisk DNA methylering og støtte udtryk data

Vi har tidligere anvendt MiG’erne at konstruere genom-dækkende DNA methylering profiler for HCT116 cellelinien og dens demethyleret isogene cellelinie, DKO [21]. DKO celler er HCT116 celler slettet for DNA methyltransferase -1 og -3b og fastholde 5% genomisk DNA-methylering [20]. DNA methylerede fraktioner af genomet blev isoleret ved inkubering med rekombinante MBD proteiner, sekventeret på en Illumina GAII sequencer, og kortlagt tilbage til referencen genomet at generere individuelle methylome profiler. For at identificere DNA methylering-regulerede miRNA, vi søgte efter miRNA med tegn på DNA methylering inden 500 bp af deres kommenterede positioner i HCT116 og DKO celler. Ved hjælp af denne metode, vi identificeret 64 kandidat miRNA til efterfølgende analyse (figur 1).

Af de 64 kandidatlande miRNA, 13 er blevet rapporteret til at blive reguleret af DNA methylering (tabel S1). Anden 5 tilhører en stor miRNA klynge placeret i det humane DLK1-GTL2 præget domæne ved 14q32 og bringes til tavshed på faderlige kromosom ved DNA methylering [22]. Derfor har vi fokuseret på de resterende 46 miRNA, der ikke er rapporteret til at blive reguleret af DNA methylering for detaljeret validering. Først valgte vi tilfældigt 6 miRNA for bisulfit sekventering analyse for at verificere methylering af DNA status detekteret ved MiG’er (Figur 2 og Figur S1). De bisulfit sekventeringsdata bekræftede de MiG’erne data overhovedet 6 loci.

bisulfit sekventering blev udført i (A) MIR-941, (B) MIR-1237, og (C) MIR-1247 i parentale HCT116 celler , HCT116 celler behandlet med 5 pM 5-aza-dC for 48 timer, og DKO celler. Den UCSC genom browser screen capture viser DNA methylering signal i hver prøve. De rektangler markerer regionerne valideret af bisulfit sekventering. Hver cirkel repræsenterer et CpG-dinukleotid. Sorte cirkler repræsenterer denatureret cytosiner mens hvide cirkler repræsenterer umethylerede cytosiner.

Næste, vi ræsonnerede, at tab af DNA methylering i DKO celler sammenlignet med HCT116 celler bør resultere i øget ekspression af kandidatlandene miRNA mens fastholdelse af DNA methylering bør korrelere til vedvarende lyddæmpning ansøgerlandenes miRNA. Derfor undersøgte vi udtrykket microarray data for de 46 kandidater i HCT116 og DKO celler (tabel S2). Brug 1,5 gange forandring som vores tærskel, vi identificeret 18 miRNA som havende konsistente udtryk data med deres status DNA-methylering i HCT116 og DKO celler (tabel S1). Vi udførte miRNA-specifikke kvantitativ real-time RT-PCR (miR-QRT-PCR) analyse for 6 udvalgte miRNA til at kontrollere ekspressionsdataene bestemt af microarray (figur S2). MIR-QRT-PCR-resultater bekræftede microarray data for de 6 miRNA, som omfattede både kendte og kandidat DNA methylering-regulerede miRNA. Derfor er baseret på empiriske genomisk DNA methylering og støtte microarray udtryk data, vi identificeret 18 nye ansøgerlande miRNA, der kan være transskriptionelt reguleret af DNA methylering.

Kandidat miRNA re-express efter 5-aza-2′-deoxycytidin behandling

for at validere, at kandidatlandene miRNA faktisk blev reguleret af DNA methylering, vi behandlede HCT116, RKO, og DLD1 tyktarmskræft celler med demethyleringsmiddel 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) til fastslå, om disse miRNA er re-udtrykkes efter 5-aza-dC behandling. Som DNA-methylering regulerer genekspression på transkriptionsniveauet, vi analyseret for ekspressionen af ​​de primære miRNA (Pri-miRNA) ved real time RT-PCR [23]. inkluderet Pri-miR-193a, -9-3, og -375, som blev kendt for at være transkriptionelt reguleret af DNA methylering i HCT116 celler [8], som positive kontroller og Pri-miR-1224, som blev demethyleret men forblev tavs i DKO celler i denne undersøgelse, som en negativ kontrol. Vi testede 17 ud af de 18 nye kandidater, fordi ingen af ​​primere designet til MIR-1234 gav succesfulde PCR-produkter. I HCT116 celler, fandt vi 11 ud af 17 miRNA at være betydeligt opreguleret efter 5-aza-dC behandling (figur 3A). Vi længere uafhængigt bekræftet alle 11 kandidater i RKO-celler (figur 3B) og 10 ud af de 11 kandidater i DLD1 celler (figur 3C). At kontrollere, at opregulering af disse miRNA var deraf til DNA demethylering efter 5-aza-dC behandling, vurderede vi ændringer i DNA-methylering status i de proksimale regioner af miR-941-1 /3, miR-1237 og miR-1247 ved bisulfit genomisk sekventering (figur 2). Demethylering blev observeret ved disse loci i HCT116 celler behandlet med 5-aza-dC, støtte, at re-udtryk observeret skyldtes DNA demethylering.

Real-time RT-PCR-analyse blev udført for at vurdere kandidat primær miRNA (Pri-miRNA) niveauer i (A) HCT116, (B) RKO, og (C) DLD1 celler før og efter behandling med 5 pM 5-aza-dC for 48 timer. MIR-1224 var inkluderet som en negativ kontrol. miR-193a, miR-375, og miR-9-3 blev inkluderet som positive kontroller. * Angiver signifikant stigning i Pri-miRNA ekspression efter 5-aza-dC behandling (p 0,05). Udtryk for miRNA blev internt normaliseret til ekspressionsniveauerne af

GAPDH

og normaliseret udtryk for hver miRNA før 5-aza-dC behandlinger blev sat til 1.

Endelig introniske miRNA kan co-transkriberet fra værten genpromotorer og derfor ikke uafhængigt reguleret på transkriptionsniveauet [24], [25]. Derfor fuldt ud at forstå betydningen af ​​DNA methylering vi observeret for vores 10 kandidatlande miRNA, vi undersøgte de genomiske sammenhænge de 10 kandidater tættere (tabel 1). miR-1247, miR-1826, og miR-219-2 er placeret i intergeniske regioner, og derfor er usandsynligt, at være co-reguleret af en vært gen promotor. De resterende 7 kandidater er placeret i introns af RefSeq eller EST udskrifter og blev undersøgt yderligere. Baseret på genom-dækkende DNA methylering profiler, ingen af ​​de formodede værtsgener, bortset fra den ikke-kodende RNA

ANKRD30BL

, har signifikant DNA-methylering ved deres promotorer (tabel 1 og figur S3), hvilket antyder, at disse formodede værtsgener er ikke reguleret af promotor-DNA methylering.

ikke desto mindre vi postulerede, at hvis den formodede vært gen transskription dikterer ekspressionen af ​​de indlejrede kandidat miRNA, bør vi registrerer øget vært genekspression efter 5- aza-dC behandling i HCT116, RKO, og DLD1 celler. Sådanne stigninger i værten genekspression ville svare til de observerede for de indlejrede miRNA i disse samme celler stiger efter 5-aza-dC behandling. Omvendt, hvis de formodede værtsgener ikke reagerer på 5-aza-dC behandling på samme måde som de indlejrede miRNA, de miRNA er sandsynligvis transkriberes uafhængigt fra de formodede værtsgener. I denne sidstnævnte situation DNA methylering vi opdagede nær miRNA ville være mest meningsfulde i deres transkriptionel regulering. Baseret på QRT-PCR-resultater, vi bestemt, at miR-1237, miR-602, miR-941-1, miR-941-3, og miR-663b er transkriptionelt uafhængige af deres respektive formodede vært gener (Figur 4). Udtrykket af

ANKRD30BL

, den formodede vært genet for miR-663b, var ikke påvises før eller efter 5-aza-dC eksperimenter, og derfor ikke plottet i figur 4. For miR-24-1 og miR- 27b, den er mindre afgørende, og vi kunne ikke udelukke, at disse to mi-RNA kan co-syntetiseret med værten genet,

C9orf3

[26]. Alt i alt, vi identificeret og bekræftet mindst 8 nye miRNA, der er transkriptionelt reguleret af DNA methylering.

Real-time RT-PCR-analyse blev udført for at vurdere formodede vært genekspression i respons på 5-aza-dC behandlinger i HCT116 (blå), RKO (mørk pink), og DLD1 (gul). Ændringerne i embedded miRNA udtryk blev også afbildet for side-by-side sammenligninger. Alle udtryk blev internt normaliseret til ekspressionsniveauerne af

GAPDH

og normaliseret udtryk for hver vært gen og miRNA før 5-aza-dC behandlinger blev sat til 1.

miR- 941 og miR-1247 vækst og migration undertrykke celle i kolon kræftceller

Vi fortsatte med at teste de biologiske funktioner af disse epigenetisk regulerede miRNA at få indblik i relevansen af ​​deres DNA methylering i tyktarmen kræftceller. For at bestemme om ekspression af disse epigenetisk tavshed miRNA ville påvirke cancercellevækst og migration, transficerede vi HCT116 celler med miRNA efterligninger af MIR-941 (den modne form af MIR-941-1 og -3), MIR-1237 MIR-1247 og en ikke-kodende negativ kontrol (AllStars neg.).

først udførte vi vækstkurve analysen (figur 5A) og MTT-assayet (figur 5B) for at vurdere cellevækst og metabolisk fitness. Vi fandt, at ektopisk ekspression af MIR-1247 resulterede i et signifikant fald i HCT116 cellevækst og metabolisk aktivitet som målt ved de to assays henholdsvis. BrdU-inkorporering assay uafhængigt bekræftet, at den reducerede vækst og metabolisme er sandsynligvis en konsekvens af nedsat proliferation i disse celler (figur 5C). Vi observerede en lignende fald i celleproliferation og metaboliske funktion i DLD1 colon cancerceller transficeret med MIR-1247 mimic (figur S4A og B). Omvendt i DKO celler, hvor miR-1247 allerede demethylerede og re-udtrykte, transfektion med ekstra miR-1247 efterligner havde ikke nogen virkning på cellevækst og metabolisme (figur S5A og B). Disse observationer antydede, at MIR-1247 kan være tumor-undertrykkende i coloncancer og dens epigenetisk inaktivering er derfor til gavn for vækst cancer.

(A) vækstkurver og (B) MTT assays af mock-transficerede HCT116-celler og HCT116 celler transficeret med ikke-kodende negativ kontrol miRNA (AllStars neg.), mIR-941, mIR-1237, eller mIR-1247 efterligner. (C) BrdU-inkorporering assay for mock-transficerede HCT116-celler og HCT116-celler transficeret med ikke-kodende negativ kontrol miRNA (AllStars neg.), MIR-941, eller MIR-1247. Et repræsentativt felt for hver eksperimentel betingelse er vist. Søjlediagrammet viser den gennemsnitlige procentdel (%) af BrdU-positive celler. (D) sårheling assay for mock transficeret HCT116 celler og celler transficeret med negativ kontrol (AllStars neg.), MIR-941, MIR-1237, eller MIR-1247 efterligner. Fotografier blev taget umiddelbart efter sårede og 16 timer senere. Resultaterne blev kvantificeret og normaliseret til de mock transficerede celler. (E) Transwell migration assays for mock transficeret HCT116 celler og celler transficeret med negativ kontrol (AllStars neg.), MIR-941 eller MIR-1247 efterligner. Repræsentative områder af invasive celler på membranen er vist. Søjlediagrammet repræsenterer det gennemsnitlige antal af celler på undersiden af ​​membranerne i hver behandling normaliseret til mock-transficerede celler.

Desuden beregningsmæssigt forudsagte mål for MIR-941 og MIR-1247 omfattede flere gener involveret i cellemigrering og invasion. For eksempel, ADAM-metallopeptidase domæne 15 (

ADAM15

) er en forudsagt mål for miR-1247 og koder et transmembrant glycoprotein vigtig for celleadhæsion [27]. Vi postuleret, at nedregulering af disse forudsagte mål ved ektopisk ekspression af miR-941 og miR-1247 vil have en negativ indvirkning celle migration. Derfor testede vi virkningerne af ektopisk udtryk for miR-941, miR-1237, og miR-1247 på celle mobilitet i HCT116 celler. I sårhelende assays blev HCT116 celler transficeret med MIR-941 og MIR-1247 efterligner væsentligt forringet i deres evne til at genbefolke sårede områder sammenlignet med mock, negativ kontrol, eller MIR-1237 transficerede celler (figur 5D). Disse observationer blev yderligere bekræftet under anvendelse Transwell migration assay (figur 5E). Endelig blev lignende undertrykkende effekt på celle migration uafhængigt observeret i DLD1 celler (Figur S4C) og DKO celler (Figur S5C) transficeret med miR-941 og miR-1247 efterligner. Tilsammen disse observationer tyder på, at epigenetisk inaktivering af miR-941 og miR-1247 kan lette tyktarmskræft celle migration og invasion.

Diskussion

MikroRNA’er er vigtige regulatoriske molekyler, der modulerer genekspression i både udviklings- og sygdomsprocesser. Deres regulering er derfor en kritisk komponent i forståelsen hver biologisk sammenhæng. Genomisk DNA-methylering er blevet vist at regulere transkriptionen af ​​en håndfuld miRNA i cancer. Disse tidligere undersøgelser til formål at identificere DNA methylering-regulerede miRNA påberåbt screening for differentielt udtrykte miRNA fra kræft og normale sammenligninger eller re-ekspressionen af ​​miRNA i DNA demethyleres betingelser. Et udtryk tilgang introducerer en opdagelse fordomme mod tilsvarende methylerede derfor tilsvarende tavshed, miRNA i sammenligning grupper. Denne type af epigenetisk regulerede miRNA kan stadig være vigtig for udviklingen af ​​kræft. For eksempel kan tilsvarende lyddæmpede miRNA i normal og cancer have betydning for cancer i en vævsspecifik måde. Endvidere kunne resterende DNA methylering i inducerede demethylering betingelser opretholde lyddæmpning af kritiske miRNA, hvilket resulterer i mangel på påviselig differential udtryk og manglende identifikation af sådanne epigenetisk regulerede miRNA. Endelig vil miRNA med marginal forskellen udtryk under typiske tærskelværdier også blive savnet, når screeningen er udelukkende baseret på forskellen udtryk.

For at overvinde de ovennævnte fordomme og mere omfattende identificere DNA methylering-regulerede miRNA i tyktarmskræft, vi screenede til kandidat miRNA baseret på empiriske beviser af genomisk DNA methylering i HCT116 og DKO tyktarmskræft celler. Vi systematisk søgte DNA maps methylome genereret af MiG i disse celler for miRNA beliggende inden 500bp af DNA methylering signaler. Vi fandt 64 kandidater, heraf 5 kendte præget miRNA, 13 kendte DNA methylering-regulerede miRNA, og 46 nye kandidater. Efterfølgende har vi bekræftet, at 8 nye kandidater faktisk blev reguleret af DNA methylering i HCT116, DKO, RKO, og DLD1 tyktarmskræft celler. Sammen med påvisning af kendte DNA-methylering regulerede miRNA, vores undersøgelse identificeret i alt 26 epigenetisk regulerede miRNA, viser, at vores tilgang er effektiv og effektiv.

Det er vigtigt at bemærke, at vi stadig kan mangle DNA methylering-regulerede miRNA afledt af lange primære udskrifter. Tidligere undersøgelser fokuserede på miRNA med deres stilk-loop-sekvenser indlejret i eller i nærheden CpG-øer, og vores aktuelle undersøgelse fokuserede på miRNA med DNA methylering proksimalt for hårnåle-sekvenser. Mens disse tilsvarende strategier muliggør systematisk screening, de sandsynligvis undervurderer det samlede antal miRNA reguleret af DNA-methylering fordi transkriptionsinitiering for de primære miRNA kan være langt opstrøms fra hårnåle-sekvens. For eksempel vil den primære transkript af MIR-21 er 3433 nukleotid-lang tid det modne MIR-21 er kodet af resterne +2445 til 2516 i HeLa-celler [28]. . For nylig, Chim

et al

rapporterede, at miR-34a blev reguleret af promotor CpG ø DNA methylering placeret 30 kb opstrøms fra den modne miR-34a [29]. Derfor kan flere miRNA reguleres ved promotor DNA methylering, men vil ikke blive let identificeres ved hjælp af en systematisk tilgang, der bygger på den aktuelle genom annotation.

Vi undersøgte yderligere den biologiske relevans af epigenetisk inaktivering af den nyligt identificerede DNA methylering-regulerede miRNA. Vi fokuserede på to vigtige aspekter af kræft udvikling, vækst og migration, og udvalgte miR-941, miR-1237, og miR-1247 for funktionelle studier. Ektopisk ekspression af MIR-1247 signifikant reduceret cancercelleproliferation og migration i HCT116 og DLD1 celler, hvilket antyder, at MIR-1247 kan fungere som en tumorsuppressor. Disse observationer er i overensstemmelse med funktioner af flere forudsagte mål for miR-1247 (https://www.microrna.org). For eksempel, Citron (CIT), en serin /threonin-kinase, er til stede ved spaltning fure og midterskrog under cytokinese og er afgørende for cellulær abscission [30], [31]. CIT regulerer også G2 /M overgang i rottehepatocytter [32], og vælte CIT hæmmede udbredelsen af ​​hepatocellulært carcinom celler [33]. Et andet potentielt mål for MIR-1247 er FosB, der dimeriserer med juni protein til at aktivere transkription af proteaser involveret i tumor migration og invasion [34]. Endelig kan det transmembrane glycoprotein, ADAM15, også blive ramt af MIR-1247, for at lette prostatacancer metastaser [35]. Disse beregningsmæssigt forudsagte mål vil være nødvendigt at empirisk valideret i fremtiden.

Interessant nok i DKO celler, hvor miR-1247 er demethylerede og udtrykt ved højere niveauer end HCT116 celler, ekstra eksponering for miR-1247 efterligner ikke gjorde resultere i fald i cellevækst, men forårsagede nedsat migration. De uoverensstemmelser mellem fænotyper af ektopisk miR-1247 udtryk i HCT116 kan DLD1, og DKO celler afspejle de forskellige koncentrationer, hvor distinkte cellulære funktioner moduleres af miR-1247. Alternativt kan det være på grund af tilstedeværelsen af ​​forskellige mål for MIR-1247 i HCT116 og DKO-celler. Disse to muligheder vil kræve yderligere undersøgelser for at afklare.

Mens differentielt methylerede og udtrykte miRNA er vigtige for udvikling af kræft, foreslog vi, at resterende DNA methylering i demethylerede forhold, såsom i DKO celler, kan også være kritisk. Vores funktionelle studie af miR-941 underbygget denne hypotese. Vi fandt, at overekspression af MIR-941 var i stand til signifikant at hæmme celle migration i både HCT116 og DKO-celler og endvidere i DLD1 celler. Dette resultat er rimelig i betragtning flere høj prioritet forudsagt mål for miR-941 er relateret til celle migration. For eksempel matrix metallopeptidasen 24 (MMP24) er en forudsagt mål for miR-941, og det letter væv remodellering og celle migration i endometriet fra endometriose patienter [36]. Lignende type af DNA methylering-regulerede miRNA vil blive savnet af tidligere udtryk tilgang, men kunne let fanget af vores undersøgelse design. Seks ud af otte romanen epigenetisk regulerede miRNA identificeret i vores undersøgelse beholdt proksimale DNA methylering i DKO celler, hvor. 5% genomisk DNA methylering er tilbage i forhold til sine forældre HCT116 celler

Sammenfattende vores tilgang til Oplev DNA methylering-regulerede miRNA gav en række hidtil uopdagede kandidater. Vi har vist gennem ektopisk ekspression og funktionelle assays, at mindst to af disse miRNA kan være særligt vigtigt i tumorudvikling. Vores metode er et nyttigt supplement til den traditionelle tilgang for at bruge et udtryk-baserede ordning at identificere nye miRNA tavshed ved DNA methylering.

Materialer og metoder

Cell kultur og narkotikabehandling

kolorektal cancer cellelinjer HCT116, DLD1, RKO og DKO-celler [25] blev dyrket i McCoys 5A medium (Invitrogen, San Diego, CA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Gibco, Grand Island, NY) ved 37 ° C i 5% CO

2 atmosfære. Celler blev høstet ved skrabning, og cellepellets blev skyllet to gange med PBS (Gibco, Grand Island, NY). Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol (Invitrogen, San Diego, CA) ekstraktion ifølge producentens anvisninger. Totalt RNA blev også behandlet med DNase I (Roche, Indianapolis, IN) for at fjerne spormængder af resterende genomisk DNA. Genomisk DNA blev ekstraheret fra cellepellets ved inkubering pellets i opløsninger indeholdende 0,5 mg /ml proteinase K, 2% SDS og 20 mM Tris-HCl natten over ved 55

oC under omrystning efterfulgt af phenol-chloroform-ekstraktion og ethanolfældning. For 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-dC) behandlinger blev celler podet ved 5 x 10

5 celler pr 100-mm-skål 24 timer før tilsætningen af ​​5-aza-dC (Sigma, St Louis, MO). Cellerne blev behandlet med 5 pM 5-aza-dC i 48 timer før høst.

MBD-isolerede Genome Sequencing dataanalyse

Genom-dækkende DNA methylering data for HCT116 og DKO celler blev tidligere opnåede ved at udføre MBD-isolerede Genome Sequencing (MiG) [21]. Den rå sekventering læser kan downloades fra NCBI Short Læs Arkiv (SRA # SRP001414). Det mindste antal sekventering læser indikerer signifikant DNA-methylering signaler blev bestemt som tidligere beskrevet. Kommenterede miRNA (Hg18, NCBI Build 36,1) ligger inden for 500 bp af signifikant DNA methylering blev identificeret som kandidater til efterfølgende analyser.

miRNA microarray analyse

Microarray-baserede miRNA udtryk profilering blev udført ved hjælp af Illumina human MicroRNA ekspressionsprofil V2 panel ifølge producentens anvisninger. Den menneskelige v2 miRNA panel indeholder 1.146 assays til påvisning af ~97% af miRNA, der er beskrevet i miRBase databasen (Sanger miRBase, v9.1 februar 2007 Meddelelse). Databehandling blev udført i GenomeStudio v2009.1 (Illumina, San Diego, CA). Tredobbelte forsøg blev udført for hver cellelinie. Data fra hvert eksperiment blev normaliseret ved anvendelse af fremgangsmåden tidligere [37] beskrevne. For HCT116 versus DKO sammenligning blev Welch s

t

test udført med en

s

-værdi cutoff på 0,05 og korrektion multiple test af falsk opdagelse sats (FDR). De microRNA array-data (GEO # GSE26819) kan tilgås fra Gene Expression Omnibus hjemmeside.

Bisulfite sekventering

1 ug genomisk DNA fra hver prøve blev hydrogensulfit omregnet ved hjælp af EpiTect (Qiagen , GmbH, Hilden) efter fabrikantens protokol. PCR-betingelser og primersekvenser er angivet i tabel S3. PCR ampliconer blev gel-oprenset og subklonet ind pCRII-TOPO-vektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mindst otte kloner blev tilfældigt udvalgt og sekventeret på en ABI3730xl DNA analysator at fastslå de methylering mønstre af hvert locus.

Påvisning af modne og primære miRNA udtryk ved kvantitativ RT-PCR

Angivelse af moden miRNA blev bestemt ved anvendelse QuantiTect SYBR Green RT-PCR (Qiagen, GmbH, Hilden) og blev normaliseret til endogen U6 snoRNA udtryk ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode [38]. Kort fortalt blev 100 ng DNase-behandlet RNA fra hver prøve sat til 10 pi af 2 × SYBR green PCR Master Mix, 0,2 pi RT-mix, 200 nM af hver primer, og RNase-frit vand til i alt 20 pi. For primære miRNA udtryk, blev GAPDH anvendt som normalisering kontrol. Ekspressionen af ​​hver primær miRNA forhold til GAPDH blev også bestemt ved anvendelse af 2

-ΔΔCt metode. Primersekvenserne til detektering modne og primære miRNA blev designet som beskrevet tidligere [23], [39] og anført i tabel S3. Gennemsnittet af tredobbeltforsøg blev afbildet med standardafvigelser repræsenteret fejlsøjler.

Påvisning af formodet vært genekspression ved kvantitativ RT-PCR

Angivelse af formodede vært gener blev bestemt ved anvendelse QuantiTect SYBR Green RT -PCR (Qiagen, GmbH, Hilden) og blev normaliseret til GAPDH internt. Den relative ekspression efter 5-aza-dC behandling beregnedes under anvendelse af 2

-ΔΔCt metode. RNA’et blev ekstraheret på samme måde som anført ovenfor. Primersekvenserne er anført i tabel S3. Gennemsnittet af tredobbeltforsøg blev afbildet med standardafvigelser repræsenteret fejlsøjler.

Ektopisk udtryk for miRNA

Over-ekspressionen af ​​miR-941, miR-1237, og miR-1247 i HCT116, DKO, og DLD1 celler blev opnået ved transfektion af cellerne med 20 nM miRNA duplexer, der efterlignede det modne mIR-941 (MSY0004984, Qiagen), mIR-1237 (MSY0005592, Qiagen), og mIR-1247 (MSY0005899, Qiagen). Den AllStars Negativ kontrol siRNA (1027281, Qiagen) blev inkluderet som en negativ kontrol.