PLoS ONE: Mekanismestudier Evaluering af en roman Lille Molecule Targeting Mitokondrier i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Baggrund

Kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de dødeligste kræftformer med et 5-års overlevelse på 6 %. Terapeutiske muligheder er meget begrænset, og der er et udækket medicinsk behov for sikre og effektive behandlinger. Kræft celle metabolisme og mitokondrier giver uudforskede mål for denne sygdom. Vi har for nylig identificeret en hidtil ukendt klasse af triphenylphosphonium salte, TP forbindelser med bredspektrede anticancer egenskaber. Vi undersøgte evnen hos vores prototypiske forbindelse TP421- valgt for sin fluorescerende egenskaber -. Til at hæmme væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller og yderligere undersøgt de molekylære mekanismer, som det udøver sine anticancer effekter Salg

Metode /vigtigste resultater

TP421 udstillet sub-mikromolær IC

50 værdier i alle de bugspytkirtelkræft cellelinjer testet ved hjælp MTT og kolonidannelse analyser. TP421 lokaliseret overvejende til mitokondrier og induceret G

0 /G

1 anholdelse, ROS ophobning, og aktivering af flere stress-regulerede kinaser. Caspase og PARP-1-spaltning blev observeret indikerer en apoptotisk respons mens LC3B-II og P62 blev akkumuleret indikerer inhibering af autofagi. Endvidere TP421 inducerede de-phosphorylering af centrale signalmolekyler involveret i FAK medieret adhæsion, der korrelerede med inhibering af cellemigration.

Konklusioner /Signifikans

TP421 er en repræsentativ forbindelse af en ny lovende klasse af mitokondrie-målrettede midler anvendelige for kræft i bugspytkirtlen behandling. På grund af deres unikke virkningsmekanisme og effekt videreudvikling er berettiget

Henvisning:. Shabaik YH, Millard M, Neamati N (2013) Mekanismestudier Evaluering af en roman Lille Molecule Targeting Mitokondrier i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 8 (1): e54346. doi: 10,1371 /journal.pone.0054346

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 12, 2012; Accepteret: 12. december, 2012; Udgivet: 21 januar 2013

Copyright: © 2013 Shabaik et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af midler fra congressionally Directed Medical Research Program Breast Cancer Concept Award og Sharon og William Cockrell Begavet Cancer Research Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA med en samlet 5-års overlevelse på 6% [1]. Siden 2005 standard kemoterapeutiske behandling er administration af gemcitabin, en nukleosidanalog, kombineret med erlotinib, en kinase inhibitor [2], [3]. Gemcitabin er målrettet ribonukleotidreduktase forårsager udtømning af dNTP’er og bliver yderligere inkorporeret i DNA forårsager en stall i syntese [4]. På den anden side erlotinib, oprindeligt troede at målrette epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR), er for nylig blevet dokumenteret at være en multi-kinaseinhibitor [5]. Den vej for gemcitabin aktivitet er tilstrækkeligt kompliceret, herunder uptake transportører og intracellulære phosphorylering fører til cytotoksicitet, som bidrager til den lave sats lave respons hos patienter og den stigende udvikling af kemoresistens [6]. Det er for nylig blevet foreslået, at PDAC lagdeling i flere undertyper baseret på molekylære forskelle kan bestemme respons på kemoterapi [7]. To af de tre definerede subtyper er repræsenteret blandt de almindeligt anvendte pancreas cancercellelinier, herunder MIA PaCa-2, PANC-1 og HPAC som vi udnyttet i vores undersøgelse.

Blandt de tidligste molekylære ændringer underliggende pancreascancer er en konstitutivt aktiveret K-ras-mutation, der forekommer i næsten 100% af tilfældene [8], [9]. Under transformation, K-ras signalering drev overdreven celleproliferation og fremmer overlevelse. Det er blevet foreslået, at mitokondrie energiproduktion er afgørende at støtte Ras-transformerede celler, der bliver stærkt afhængige af autophagy, en tilstand kaldet “autophagy afhængighed”, for at opretholde en sund pulje af mitochondrier og tilstrækkelig TCA cyklus mellemprodukter til at understøtte oxidativ fosforylering ( OXPHOS) [10], [11]. Især i bugspytkirtelkræft cellelinjer og patientprøver, er det basale niveau af autofagi forhøjet sammenlignet med normale celler eller celler fra andre tumorcellelinier og er korreleret med fattigere kliniske resultater [10], [12]. Denne fænotype, karakteristisk for Ras-transformerede celler, gør dem enestående modtagelige for forstyrrelse af mitokondrielle respiration og autofagi. Faktisk har farmakologisk inhibering samt nedregulering af centrale autofagi gener med succes resulteret i reduktion af mitokondriel iltforbrug og intracellulære ATP-niveauer fører til udtalt inhibering af pancreas cancervækst både in vitro og in vivo [10]. Derfor hæmning af autophagy og mitokondrie målretning kunne give en ny tilgang til behandling af PDACs, der normalt yderst refraktære over for ledige kemoterapi. Faktisk har der været en nylig stigning i interessen for at målrette kræft celle mitokondrier efter anerkendelse af deres ændrede bioenergetic status som bidragyder til kræft patogenese [13]. Derfor har målrettet mitochondrier dukket op som en ny ideel til anticancerterapi hjulpet delvist af kendskabet til opnåelse præcis afgivelse af lægemidler til organel. Anvendelsen af ​​mitochondriale målrettede midler til anticancer- behandling udgør en ekstra fordel af direkte virker på den vigtigste regulator af programmeret celledød i cellen og helt uden om opstrøms signalleringskaskader, der ofte undermineret [14]. Det er blevet veldokumenteret, at mitokondrier af maligne celler udviser en højere transmembranpotentiale sammenlignet med ikke-maligne celler med forskelle i enzymaktiviteter, elektronbærere og membran lipid struktur som potentielle underliggende årsager [15]. At udnytte denne unikke egenskab har ført til udformning af nye lipofile kationer, der fortrinsvis kan ophobes i tumor celle mitokondrier i normalt væv af de stigende transmembranpotentiale [15]. Konjugation af triphenylphosphonium (TPP) kationer til en række kemiske prober og narkotika er meget anvendt til at opnå specifik målretning til mitokondrierne [16], [17], [18], [19], [20]. En TPP-mærkede E-vitamin-analog (MitoVES) er blevet grundigt undersøgt for dets apoptotiske og anti-angiogene egenskaber, som er langt forbedrede forhold til den for den parentale un-mærkede forbindelse, understøtter mitokondrie målretning som en levedygtig tilgang til forbedring virkningsfuldhed af moderat aktiv lægemiddelkandidater [20], [21], [22]. Alternativt har drug delivery bærere såsom dendrimerer og lipososmes blevet modificeret med TPP kationer og udnyttes til at levere lasten til mitokondrier [17], [23], [24], [25]. Når disse luftfartsselskaber blev indlæst med model kemoterapeutiske lægemidler, herunder paclitaxel eller doxorubicin blev virkningen forstærket i løbet af ikke-målrettede bærere indikerer, at levering til mitokondrierne kan forbedre apoptose og cytotoksicitet.

Vi har tidligere rapporteret opdagelsen af ​​en ny klasse af TPP salte, der har bredspektret anticanceraktivitet [26]. Disse forbindelser kan ophobes i mitokondrier i kraft af deres positivt ladede TPP-dele og den negative potentiale over de mitokondrielle membraner [27]. Efterfølgende har vi vist, at disse forbindelser er i stand ophævelse mitokondrielle respiration og stigende mitokondriske superoxid niveau. Vigtigst, har vi vist, at denne klasse af forbindelser effektivt kan inhibere tumorvækst i en nøgen mus brystkræft xenograft model uden tilsyneladende toksicitet [26]. På grund af deres unikke virkningsmekanisme rettet mod mitokondrier og udsøgte afhængighed af Ras-drevne tumorer på mitokondriefunktionen, vi søgt at udvikle denne klasse af forbindelser som nye midler mod kræft i bugspytkirtlen. På grund af den betydning autofagi at opretholde en sund pulje af mitokondrier til at støtte overlevelse og spredning af Ras transformerede celler, vi hypotese, at TP421 ville inducere celledød i bugspytkirtelkræftceller på en måde, der involverer autophagy regulering af mitokondrier.

Materialer og metoder

cellelinjer og Kultur Reagenser

MIA PaCa-2, PANC-1, BxPC-3 og HPAC bugspytkirtlen kræft cellelinjer blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). MEF atg3 + /+ og atg3 – /- murine cellelinjer var en gave fra Masaaki Komatsu (Juntendo University School of Medicine, Bunkyo-ku, Tokyo) [28]. HFF-1 normal fibroblast cellelinje blev leveret af Dr. Carla Grandori (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA). Alle cellelinier anvendt til eksperimenter blev opretholdt i kultur under 35 passager og testes regelmæssigt for forurening med mycoplasma hjælp PlasmoTest ™ (InvivoGen, San Diego, CA). MIA PaCa-2 og PANC-1-celler blev holdt i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gemini-Bioproducts, West Sacramento, CA). BxPC-3, MEF atg3 + /+ og atg3 – /- celler blev holdt i RPMI suppleret med 10% FBS. HPAC celler blev holdt i 01:01 blanding af DMEM og Hams F12 medium suppleret med 5% FBS. Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2. For alle eksperimenterne blev cellerne i eksponentiel vækstfase skyllet med DPBS uden calcium og magnesium, kortvarigt trypsineret i et lille volumen af ​​0,25% trypsin-EDTA-opløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), resuspenderes i komplet dyrkningsmedium , manuelt talt og podet på sterile plader og fik lov at adhærere natten over, før behandling.

forbindelser

Alle forbindelser blev opbevaret i form af koncentreret DMSO-stamopløsning frosset ved -20 ° C. Fortyndinger blev fremstillet i DPBS, uden calcium og magnesium, og genbruges i højst 3 fryse-tø cykler. Forbindelser blev købt fra LKT Laboratories Inc. (St. Paul, MN), Sigma-Aldrich Corp. (Saint Louis, MO) og Asinex Ltd (Moskva, Rusland).

cytotoksicitetsanalyse

Cytotoksicitet blev målt ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) kolorimetrisk assay som tidligere beskrevet [26].

Colony Formation assay

celler blev podet i plader med 6 brønde (500-1000 celler pr afhængigt af cellelinjen) og fik lov natten over til at klæbe. Den næste dag, lægemidler blev tilsat til brøndene i 24 timer, hvorefter medium blev udskiftet med lægemiddel frie medier. Celler blev yderligere inkuberet i 7-14 dage for at tillade kolonier til at danne. Kolonier blev farvet med en krystalviolet-opløsning (0,05% krystalviolet, 0,74% formaldehyd og 36% methanol), skyllet og derefter afbildes.

trypanblåteksklusion Assay

Behandlede celler blev opsamlet via kort trypsinisering og farvet under anvendelse trypanblåt 0,4% opløsning (Lonza Group Ltd) ifølge fabrikantens anbefalinger. Celler blev talt under anvendelse af et hæmacytometer.

Alamar Blå cellelevedygtighed Assay

celler blev håndteret identisk med MTT-assayet beskrevet ovenfor. Ved afslutningen af ​​behandlingen, Alamar blå (ABD Serotec

©) blev sat til brønde i henhold til producentens anbefalinger. Fluorescens blev detekteret ved 560/590 ex /em bølgelængder.

Cell Cycle Bestemmelse

lægemiddelbehandlede celler blev opsamlet via kort trypsinisering og fikseret i 70% ethanol ved -20 ° C i mindst 4 timer. Til bestemmelse DNA-indholdet blev prøver centrifugeret ned og resuspenderet i DPBS indeholdende propidiumiodid (50 ug /ml slutkoncentration) og RNase A (100 ug /ml slutkoncentration) og analyseret ved flowcytometri.

Cell lysater og Western blotting-analyse

Behandlet cellswere skyllet med DPBS og lyseret på is ved tilsætning af et lille volumen SDS-holdig celle lysisbuffer i 15 min. Lysater blev opsamlet i Eppendorf-rør, sonikeret på is for forskydning DNA, og kvantificeret ved anvendelse af RC DC protein assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Tredive mikrogram cellelysat blev påsat i hver bane og underkastet SDS-PAGE og efterfølgende overført til Immun-Blot polyvinylidenfluorid membraner (PVDF; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kort beskrevet blev membranerne blokeret i 5% mælk i TBST, efterfulgt af inkubation i primært antistof fortyndet i passende blokerende buffer ved 4 ° C overnight.After blev membranerne vasket, blev passende sekundært antistof tilsat i 1 time ved stuetemperatur og til sidst vasket off før billeddannelse. Alle antistoffer blev købt hos enten Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA) eller Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Protein detektion blev udført under anvendelse af Super Signal West Dura kemiluminescerende substrat (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) og afbildes på ChemiDoc ™ XRS + systemet (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). For alle Western blot data, billeder er repræsentative blots valgt fra mindst to uafhængige forsøg.

Måling af hydrogenperoxid Niveauer

generation af hydrogenperoxid blev målt ved hjælp af en Amplex Red enzym assay. Celler podet i 96-brønds klare nederste sorte plader blev behandlet i 4 timer med den ønskede koncentration af lægemiddel i phenolrødt-frit DMEM-medium suppleret med 10% FBS. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev cellerne vasket og lyseret i DPBS indeholdende 50 uM Amplex Red (Molecular Probes) og 0,1 enheder /ml peberrodsperoxidase (HRP; Sigma, St. Louis, MO) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C , beskyttet mod lys. Efter inkubation blev fluorescensintensitet af hver brønd detekteret ved 540/590 ex /em bølgelængder.

Måling af superoxidanion Niveauer

Drug behandlet MIA Paca-2 og BxPC-3 celler blev kortvarigt farvet med MitoSOX Red mitochondrial Superoxide Indicator (Invitrogen, Carlsbad, CA) efter fabrikantens recommendations.Fluorescence intensitet blev målt ved anvendelse af flowcytometri som beskrevet tidligere [26].

Fluorescent Microscopy af TP421 subcellulære lokalisering

MIA Paca-2 og PANC-1 cellelinier blev podet i dobbelt kamre dækglas (Nalge Nunc International, Rochester, NY) ved en densitet på 50.000 celler /kammer og får lov natten over til at klæbe. Den følgende dag blev cellerne behandlet med 2 pM TP421 i tidsrum op til 72 timer. Før billeddannelse blev celler farvet i 15 minutter ved 37 ° C under anvendelse af enten 200 nM Mitotracker Red CMXRos eller 50 nM LYSOTRACKER Red DND 99 levende celle organel pletter (Life Technologies, Grand Island, NY) ved at følge producentens anbefalinger. Levende celler blev visualiseret ved hjælp af et Nikon DAIPHOT 300 inverteret mikroskop (Nikon Instruments, Melville, NY) udstyret med DAPI og Cy3 filter blokerer, 10x øje stykke og 100x /1.3 Nikon fordybelse olie linse og super højt tryk kviksølv lampe. For at forhindre fotoblegning blev prøve udsættelse for lys minimeres under erhvervelse billede ved at engagere neutral tæthed (ND2 og ND4) filtre til at begrænse intensiteten af ​​lys, der når prøven. Billeder blev taget med et Photometrics CoolSNAP 9 CCD-kamera (Roper Scientific, Ottobrun, Tyskland) og behandles ved hjælp af Q-capture Pro v 5.1.1.14 imaging software (Q billedbehandling selskab, Surrey, BC, Canada).

Immunfluorescerende farvning af LC3B Salg

MIA PaCa-2-celler blev podet på dækglas med en tæthed på 50.000 celler og lodes natten over til at klæbe. Den følgende dag blev celler behandlet med 2 pM TP421 i nærvær eller fravær af 5 uM rapamycin eller 10 uM chloroquin i 18 timer. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket med 500 pi DPBS før fiksering med 3,7% formaldehyd i 15 m ved stuetemperatur. Fikserede celler blev vasket med 500 pi DPBS før og efter permeablization med iskold acetone i 5 minutter ved -20 ° C. Dækglas blev blokeret i 30 min med 1% bovint serumalbumin (BSA) i DPBS før inkubering natten over ved 4 ° C med LC3B antistof i 1% BSA. Antistof blev fjernet, og dækglas blev vasket i DPBS med forsigtig omrøring. Cy5 og Cy3-konjugerede antistoffer (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, PA) fortyndet i 1% BSA blev inkuberet med dækglas i 2 timer. Dækglas blev igen vasket i DPBS med forsigtig omrøring, lufttørret og monteret på forud renset glas slidesusing Prolong Gold anti-fade montering medier (Life Technologies, Grand Island, NY). Billeder blev opnået ved anvendelse af en Lieca SP2 konfokalt mikroskop (Leica Microsystems, Heidelberg, Tyskland) udstyret med 488 nm argon og 633 nM kryptonlasere lasere (lasereffekt blev holdt på et minimum 50% af total) og Leica konfokal software v 2,61 ( Leica Microsystems, Heidelberg, Tyskland).

In vitro migration Assay

Cell migration blev analyseret under anvendelse plade med 24 brønde cellekultur skær forsynet med transparent PET membraner med 8 um størrelse porer (BD Biosciences, San Jose, CA). 7.5 × 10

4 serum sultet MIA PaCa-2-celler blev udpladet i det øverste kammer i serumfrit medium og fik lov til let adhærere natten. På den næste dag blev migration stimuleret med 10% FBS-medium tilsat til det nederste kammer. Negative kontrolbrønde modtog 1% serum medium i stedet. TP421-behandlede prøver, modtog 10% FBS-medium i det nedre kammer og forbindelse i serumfrit medium i den øverste kammer. Efter 24 timer blev cellerne adhærente til oversiden af ​​membranen let skrottet væk med en vatpind. Cellerne på undersiden af ​​membranen blev farvet under anvendelse af Giemsa nuklear farvning i 30 minutter ved stuetemperatur og vasket med deioniseret vand. Billeder af de farvede membraner blev fanget af repræsentative felter ved brug Nikon inverteret mikroskop under anvendelse af et 10X objektiv.

Sårheling Assay

vævskulturbehandlet plader med 96 brønde blev overtrukket med kollagen I opløst i 0,2 N eddikesyre (sterilfiltreret) til en slutkoncentration på 45 ug /ml, natten over ved 4 ° C natten over. Den følgende dag overskydende collagen blev fjernet, brøndene blev vasket to gange med DPBS og blokeret med 2 mg /ml BSA i DPBS i 1 time ved stuetemperatur. Efter blokering blev brøndene igen vasket DPBS. PANC-1-celler blev derefter podet med en tæthed på 35.000 celler /brønd i fuld serum medier og fik lov at adhærere natten over. Medier blev ændret til serumfrit medium, og celler blev yderligere inkuberet natten over. Den følgende dag blev ridser lavet ved hjælp af kanten af ​​en 200 pi spids og brøndene blev vasket med DPBS. Behandlede og un-behandlede kontrolbrønde modtog 10% FBS indeholdende medium og lægemiddel blev tilsat. Negative kontrolbrønde modtog serumfrie medier. Sårene blev tilladt 24 timer til at lukke ved afslutningen af ​​hvilken brøndene blev skyllet med DPBS blev cellerne fikseret i 100% methanol i 10 min og farvet med Giemsa nuklear farvning i 30 min. Endelig blev brøndene vasket med deioniseret vand og væltede at tørre. Sår blev afbildet med en hjælp af en 4X mål.

Statistisk analyse

Hvor angivet, p-værdier blev beregnet ved hjælp af tosidede uparrede t-test med ulige varianser. P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

TP421 Viser Hurtig og Potent cytotoksicitet i et panel af bugspytkirtelkræft cellelinier

I vores første rapport om anticancer aktivitet af denne klasse af forbindelser beskrevet vi deres potente cytotoksicitet over cancercellelinier af varierende afstamninger [26]. Her i, testede vi evnen hos en af ​​de ledende forbindelser identificeret formular vores indledende skærm, TP421, at inducere cytotoksicitet og inhibere celleproliferation i et panel af pancreascancer cellelinier. Brug af MTT-assayet, evaluerede vi effekten af ​​72 timers kontinuerlig udsættelse for eskalerende doser af TP421, TP187, og TP197 på væksten af ​​MIA PaCa-2, BxPC-3, PANC-1 og HPAC cellelinier. Resultaterne (tabel 1) viste potent cytotoksicitet, med TP421 IC

50 værdier i sub-mikromolære område i alle de testede cellelinjer uanset deres forskelle i differentiering tilstand eller genetisk mutations baggrund. Strukturer af de testede forbindelser er vist i det understøttende figur (fig S1). TPP-delen i denne forbindelse er afgørende for aktivitet som 7-diethylamino-4-methylcoumarin, et strukturelt identiske analog af TP421 mangler TPP-delen, ikke producerede cytotoksicitet i de testede cellelinier. Vi undersøgte yderligere effekten af ​​24 timers eksponering for TP421 på kolonidannende evne MIA PaCa-2-celler i sammenligning med gemcitabin og erlotinib (figur 1). Resultaterne bekræftede evne TP421 at hæmme celledeling

in vitro

til niveauer sammenlignelige med gemcitabin og langt mere potent end erlotinib. For yderligere at karakterisere de cytotoksiske aktiviteter af TP421, inkuberede vi celler i nærvær eller fravær af en række koncentrationer af TP421 i 0,25, 0,5, 1 eller 5 timer, efterfulgt af inkubation i stoffri medier i 24, 48 og 72 timer. Parallelt behandlede vi cellerne med en vedvarende udsættelse for TP421 i 24, 48 og 72 timer. I slutningen af ​​inkubationer vurderede vi cellernes levedygtighed via MTT. Som forventet, IC

50 af TP421 havde en omvendt korrelation med behandlingstiden samt den samlede varighed af inkubationstid, som vist i tabel 2. Uventet vi imidlertid observeret, at med meget korte eksponeringstider, så kort som 15 min, TP421 var i stand til at opnå 50% cytotoksicitet omend ved højere koncentrationer (20 uM) indikerer en meget hurtig indledende stof effekt. Interessant fandt vi, at for PANC-1-celler er behandlet på denne måde, kortere lægemiddeleksponering gange stærkt reduceret cytotoksicitet TP421. Overlevelseskurverne sammenligner kontinuerlige og 0,25 h eksponeringstider i de tre cellelinier er vist i figur 2.

Virkning på 24 t drug eksponering på kolonidannende evne (A) MIA PaCa-2 og (B) BxPC -3. Billeder er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Dosis respons overlevelseskurverne for cellelinier behandlet med TP421 sammenligne kontinuerlig eksponering (lukkede firkanter) til 0,25 h lægemiddeleksponering efterfulgt af et medie udvaskning (åbne firkanter) og yderligere inkubering. Samlede inkubationstid er angivet i parentes. Dataene er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. TP421 koncentrationer plottes på et Log basis 10 skala. Vejviser

TP421 Cytotoksicitet er Selektiv Mod Cancer Cells

Efter den antagelse, at TP421 selektivt ville akkumulere i kræftceller drevet af højere transmembranpotentialet sammenlignede vi effekten af ​​TP421 på vækstegenskaber normal fibroblastcellelinie HFF-1 mod tre af de pancreatiske cancercellelinjer. Behandling MIA PaCa-2 og HFF-1-celler med en række doser af TP421 i 72 timer viste tydeligt højere følsomhed af pankreatisk cancercellelinie mod lægemidlet (figur 3A). Dette blev yderligere bekræftet ved at måle procentdelen af ​​døde celler akkumulerede TP421 behandling, som var signifikant højere i de bugspytkirtelkræftceller sammenlignet med HFF-1 (figur 3B). Yderligere, benytter det Alamar Blue-indikatorfarvestoffet, observerede vi en 4-fold forskel i inhiberingen af ​​MIA PaCa-2-celleproliferation i sammenligning med HFF-1-celler efter 72 timer inkubationsperiode med TP421 i de angivne doser. (Figur 3C).

(A) Vækst af normale HFF-1-celler er upåvirket, mens den pancreascancer MIA PaCa-2-celler viser omfattende død efter 72 h udsættelse for eskalerende doser af TP421. (B) TP421 inducerer større celledød i tre pancreas cancer cellelinjer sammenlignet med HFF-1-celler som målt ved trypan-blå-udelukkelse. (C) Proliferation af MIA PaCa-2, men ikke HFF-1 er stærkt inhiberet af TP421 i Alamar Blue-assay. blev udført tre uafhængige forsøg, repræsentative billeder vises i (A), middelværdi ± SD er afbildet i (B) og (C). *, **, *** Og **** angiver p-værdi 0,05, p 0,01, p 0,001 og p. 0,00005 hhv

TP421 Anholdelser bugspytkirtelkræft cellelinier i G

0 /G

1 fase af cellecyklus i en Time og dosisafhængig måde

for at belyse den mekanisme, hvormed TP421 hæmmer celledeling, vi evalueret dens virkning på cellecyklus kinetik. MIA PaCa-2 (figur 4), PANC-1, BxPC-3, og HPAC (tabel 3) celler blev behandlet med to koncentrationer af TP421 til forøgelse varigheder af tid og DNA-indholdet blev analyseret ved anvendelse af flowcytometri. Omfattende G

0 /G

1 anholdelse blev observeret i alle cellelinier trods mindre forskelle i deres følsomhed til TP421. Interessant nok cellecyklusfordeling for MIA PaCa-2-celler behandlet med de to andre analoger, TP187 og TP197, også lignede TP421 med betydelig og tidlig standsning i G

0 /G

1 (tabel 3). Dette resultat adskiller sig fra G

2 /M og S-fasen induceres af disse forbindelser i ikke-pancreatiske cancercellelinier [26], hvilket indikerer et potentiale tumor-typespecifik virkning.

Virkningen af TP421 behandling på cellecyklusfordeling af MIA Paca-2-celler blev undersøgt i en dosis og tidsafhængig måde. Celler blev ubehandlet eller behandlet med 0,1 og 1 uM TP421 i 24, 48 og 72 timer. Histogrammer afbildet er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

TP421 lokaliserer til Mitochondriale Structures med Vedvarende Retention Over Time

TP421 tilhører en klasse af forbindelser, der indeholder en TPP kation kendt ophobes i mitokondrier [27]. For at bekræfte mitokondrisk lokalisering blev PANC-1-celler behandlet med 2 pM TP421 for forskellige tidsrum. Umiddelbart før billeddannelse, celler blev co-farvet med 200 nM MitoTracker Red farvestof til at mærke mitokondrierne. Vi observerede signifikant co-lokalisering vedvarer i op til 72 timer (figur 5A), hvilket indikerer, at TP421 faktisk akkumuleret i mitokondrierne og blev tilbageholdt i en længere tidsperiode. Som sekundær verifikation af mitokondriel lokalisering vi forsøgt at bestemme den rolle, som det mitokondrielle transmembranpotentiale i akkumulering af TP421 i celler. Brug af ionoforen carbonyl cyanid-4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP), der almindeligvis anvendes til at sprede den mitokondrielle transmembranpotentiale undersøgte vi mønster af TP421 fluorescens. Vi forbehandlet PANC-1-celler i 30 minutter med 10 uM FCCP efterfulgt af en 15 minutters inkubation med TP421. Kontrolceller modtog ingen FCCP og blev udsat for 15 min kun TP421. I nærvær af FCCP, observerede vi en udpræget diffus TP421 fluorescens (figur 5B), som ikke ligne mitokondriel lokalisering bekræfter, at under normale forhold TP421 akkumuleret inden mitokondrier drevet af transmembranpotentialet. Da vi havde observeret, at 7-diethylamino-4-methylcoumarin ikke var cytotoksisk for celler, vi nærmere forholdet mellem mitokondrie lokalisering og TP421 cytotoksicitet. Vi forbehandlet MIA PaCa-2-celler i 30 minutter med 10 uM FCCP derefter tilsat TP421 i yderligere 30 min. Ved afslutningen af ​​behandlingsperioden, vaskede vi cellerne og erstattet mediet til fjernelse af overskydende lægemiddel og inkuberes cellerne i 24, 48 og 72 timer og målte cellelevedygtighed. Ved tilstedeværelse af FCCP cellerne var signifikant beskyttet mod TP421 cytotoksicitet (figur 5C), hvilket indikerer, at lokalisering til mitochondrier var direkte ansvarlig for virkningen af ​​vores stof.

(A) Panc-1 celler behandlet med TP421 og farves med MitoTracker Rød (MTR) afslører omfattende samarbejde lokalisering af TP421 og mitokondrie markør farvestof. (B) Panc-1 celler forbehandlet med FCCP viser manglende mitokondrie TP421 lokalisering. (C) Reduceret cytotoksicitet af TP421 i MIA PaCa-2-celler forbehandlet med FCCP ses ved 24, 48 og 72 timer. Dataene er gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * Angiver p. 0,01

TP421 Behandling inducerer mitokondrie og Cytosoliske Ophobning af Reactive Oxygen Species

TP421 falder mitokondrie respiratoriske kapacitet og øger superoxid (O

2

– ) akkumulering [26]. Men sammenlignet med O

2

-, hydrogenperoxid (H

2O

2) er en relativt mere stabile og membran-gennemtrængelige ROS der kan forårsage lipid, protein og DNA-beskadigelse og deltager i signaltransduktion [29]. Derfor undersøgte vi niveauet for H

2O efter

2 i bugspytkirtelkræftceller TP421 behandling. MIA PaCa-2 og BxPC-3-celler blev behandlet med stigende doser af TP421 i 4 timer efterfulgt af en kort inkubation med 50 pM Amplex Red i nærværelse af 0,1 enheder /ml HRP. I nærværelse af HRP, Amplex Red-reagens reagerer med H

2O

2 i en 01:01 støkiometri til at producere meget fluorescerende resorufin. Den resulterende Fluorescensintensiteten blev målt ved excitations- og emissions- bølgelængder på 540 nm og 590 nm. Som forventet, behandling resulterede i en 2,5 gange stigning i H

2O

2 niveauer i BxPC-3 ved den højeste koncentration af TP421 med en god sammenhæng mellem H

2O

2 niveauer og dosis af TP421 bruges (figur 6A). På den anden side kunne ikke påvises en tilsvarende stigning i fluorescens i MIA PaCa-2-celler (data ikke vist). For at bestemme om den manglende H

2O

2 akkumulering i disse celler skyldtes et fravær af O

2

– generation, anvendte vi en MitoSOX rød assay [26] for at måle niveauet af mitokondrie O

2

– i MIA PaCa-2 og sammenlignet det med BxPC-3. Begge cellelinier behandlet med stigende doser af TP421 i 4 timer udviste 3-5 gange stigning i O

2

– plan (figur 6B) og disse niveauer forblev høj med 24 timer (data ikke vist). Dette tyder på, at manglen på H

2O

2 akkumulering observeret i MIA PaCa-2 celler ikke skyldes mangelfulde O

2

-produktion i disse celler.

Effekten af TP421 behandling på niveauerne af (A) H

2O

2 og (B) mitokondrie O

2

– i BxPC-3 og MIA PaCa-2 celler blev målt ved hjælp af de fluorescerende prober Amplex Rød og MitoSOX rød hhv. (C) Effekt af antioxidant forbehandling på cytotoksicitet TP421 i PANC-1 celler. *, ** Og *** angiver p 0,05, p 0,005 og p. 0,001 henholdsvis

Som overdreven ROS er kendt for at føre til celledød, vi yderligere undersøgt den potentielle beskyttende rolle en antioxidant. PANC-1-celler blev forbehandlet med 15 mM

N

acetyl-L- cystein (NAC) i 2 timer før tilsætning af TP421. Efter en 24 timers inkubation omfanget af cytotoksicitet blev bestemt ved MTT. Antioxidant forbehandling kunne beskytte celler fra TP421 inducerede cytotoksicitet med op til 35% (figur 6C), og lignende resultater blev observeret i MIA Paca-2 og BxPC-3-celler (data ikke vist).

TP421 Behandling Aktiverer Stress induceret Pathways

i betragtning af den stærke ophobning af ROS efter TP421 behandling, vi hypotese, at, cellulære stress veje JNK, p-38 og ERK, aktiveres [30], [31], [32].