PLoS ONE: Den kultur af kræftceller som Tumorspheres ikke systematisk Resultat i Cancer Stem Cell Enrichment

Abstrakt

Kræft stamceller (CSC) har rejst stor spænding i det seneste årti og er lovende mål for en effektiv behandling af tumorer uden tilbagefald og metastaser. Blandt de forskellige metoder, der gør det muligt at berige kræft cellelinjer i CSC har tumorspheres kultur været overvejende brugt. I denne rapport, vi har forsøgt at generere tumorspheres fra flere murine og humane kræftceller: B16-F10, HT-29, MCF-7 og MDA-MB-231 celler. Tumorspheres blev opnået med variable effektiviteter fra alle cellelinjer, bortset fra MDA-MB-231-celler. Derefter undersøgte vi adskillige CSC karakteristika i både tumorspheres og adhærente kulturer af B16-F10, HT-29 og MCF-7-celler. Uventet tumorspheres-dannende celler var mindre klonogene og, i tilfælde af B16-F10, mindre proliferativ end vedhæftede celler. Derudover har vi ikke observere nogen berigelse i befolkningen udtrykker CSC overflademarkører i tumorspheres fra B16-F10 (CD133, CD44 og CD24 markører) eller MCF-7 (CD44 og CD24 markører) celler. Tværtimod tumorspheres kultur af HT-29-celler syntes at berige i celler, der udtrykker colon CSC markører,

dvs.. Salg CD133 og CD44-proteiner. For B16-F10-cellelinien, når 1 000 celler blev injiceret i syngene C57BL /6-mus, tumorspheres-dannende celler viste en signifikant lavere tumorigent potentiale end adhærente celler. Endelig tumorspheres kultur af B16-F10-celler inducerede en nedregulering af vimentin, som kunne forklare, i det mindste delvist, den nedre tumorgenicitet af tumorspheres-dannende celler. Alle disse resultater, med den litteratur, viser, at tumorspheres kultur af cancercellelinier kan inducere en berigelse i CSC men i en cellelinie-afhængig måde. Afslutningsvis skal omfattende karakterisering af CSC egenskaber i tumorspheres afledt fra enhver cancercellelinie eller kræftvæv udføres for at sikre, at de genererede tumorspheres faktisk er beriget i CSC

Henvisning:. Calvet CY, André FM, Mir LM (2014) The Culture of Cancer cellelinier som Tumorspheres ikke systematisk Resultat i Cancer Stem Cell berigelse. PLoS ONE 9 (2): e89644. doi: 10,1371 /journal.pone.0089644

Redaktør: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, USA

Modtaget: April 2, 2013; Accepteret: 24 Jan 2014; Publiceret: 24 feb 2014

Copyright: © 2014 Calvet et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Research var gennemført i anvendelsesområdet for EBAM europæiske Associated Laboratory. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Agence Nationale de la Recherche (IPSIOAT) og departementet Val-de-Marne gennem TELVAC projektet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft stamceller (CSC), en subpopulation af cancerceller, har rejst en enorm interesse i det videnskabelige samfund i de sidste to årtier. De er faktisk mistænkt for at være ansvarlig for tumorvækst og metastase, modstand mod terapi og dermed tilbagefald [1].

CSC deler mange træk med normale stamceller, såsom differentiering evne, selv-fornyelse og relativ vækstdvale tyder på, at de kunne muligvis stammer fra deres normale modstykker gennem en ophobning af transformerende mutationer, enten genetisk eller epigenetisk [2] – [4]. CSC er forælder celler, som kan selv forny eller differentiere til heterogene slægter, der vil danne tumor bulk. I modsætning til den klonale evolution model af kræft formering, CSC-modellen, at alle kræftceller er ikke lige tumorigene når de injiceres

in vivo

[1], [5]. For femten år siden, Bonnet og Dick viste for første gang, at CD34

+ CD38

– CSC isoleret fra akut myeloid leukæmi var i stand til at rekapitulere heterogenitet den oprindelige tumor gennem serielle transplantationer i xenograftmodeller modsætning til CD34

-CD38

+ celler [6]. Siden blev derefter CSC model, der anvendes til at forklare ikke kun udbredelsen af ​​leukæmi, men også af faste cancere, såsom brystcancer, mave-, tyktarms-, prostata-, ovarie-, lever, bugspytkirtel, lunge, hjerne og skjoldbruskkirtlen carcinomer, melanomer, osteosarkom og Ewing sarkom [7].

CSC display en modstand mod kemoterapi og strålebehandling. Deres evne til at undslippe cytotoksiciteten af ​​konventionelle cancerterapi og at regenerere tumoren ved afslutningen af ​​behandlingerne skyldes flere mekanismer: hviletilstand, ekspression af anti-apoptotiske proteiner, drug efflukspumper, højt stofskifte kapacitet og et lavt niveau af reaktive oxygen arter [1], [8], [9].

som for normale stamceller, CSC niche er blevet vist at spille en aktiv rolle i opretholdelsen af ​​stemness egenskaber samt i dedifferentieringen af ikke-CSC gennem en epitelial-til-mesenchymal overgang (EMT) [10]. Dette fænomen, der er kendt for at være involveret i metastatisk proces, kan også forklare oprindelsen af ​​CSC som disse celler deler de fleste af deres ejendomme med post-EMT celler, herunder høj invasion og migration evne, og forøget ekspression af mesenkymale markører (

f.eks

vimentin). Desuden kræftceller tvunget til at undergå EMT besidde en øget tumorigene potentiale og udtrykker højere niveauer af CSC markører [8], [10] – [12]

Kun få metoder er i øjeblikket tilgængelige til at isolere CSC.. Dyrkning af celler i en forankringsuafhængig måde, ind i et serum-frit medium beriget med vækstfaktorer, blev første gang anvendt til at opformere humane mammae epitelceller i en udifferentieret tilstand [13]. Ponti og medarbejdere viste, at denne metode var også effektiv i at opretholde bryst CSC i kultur [14]. Under sådanne betingelser, celler voksede som multicellulære tredimensionale kloner kaldet “tumorspheres”. Denne teknik bevist sin effektivitet i at berige og vedligeholde CSC fra flere cellelinjer [15].

I dette papir, vi søgte at evaluere evne tumorspheres kultur teknik til at berige flere cancer cellelinjer i CSC. Faktisk er det af stor praktisk interesse for lægemiddelforskning og til evaluering af effektiviteten af ​​behandlinger til at arbejde med cancercellelinjer beriget med CSC da de betragtes som den, der skal målrettes til behandling af tumorer på langt sigt uden tilbagefald.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med de etiske retningslinjer, der udstedes af den Europæiske Komité (direktiv 86/609 /CCE). Université Paris-Sud Animal Ethics Committee # 26, der er registreret af den franske Institut for forskning, specielt godkendt denne protokol (protokol registreringsnummer # 2012_007).

Tilhænger Cell Culture

B16-F10 murine melanom, HT-29 human colon adenocarcinoma, MCF-7 og MDA-MB-231 humane bryst- adenocarcinom cellelinier blev dyrket i DMEM, McCoys 5A, MEM eller RPMI 1640-medium, henholdsvis. Alle medier blev suppleret med 1% glutamax, 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PS), alle indkøbt fra Life Technologies (Cergy Pontoise, Frankrig). Insulinopløsning (Sigma, St Quentin Fallavier, Frankrig) ved et 10 ug /ml slutkoncentration blev specifikt anvendes til MCF-7 cellekultur. Celler blev opformeret ved 37 ° C i en 95% fugtighed atmosfære indeholdende 5% CO

2 og passeret ved konfluens (ved en 1:10, 1:08, 1:06 eller 1:04 fortynding henholdsvis) med en TrypLE opløsning (Life Technologies). Celler var mycoplasma-fri og rutinemæssigt kontrolleres med Venor GEM-One Step Mycoplasma afsløring kit købt fra Biovalley (Marne-la-Vallée, Frankrig).

Tumorspheres Kultur

10 000 levedygtige celler var overført i en T75 ultralav adhærens kolbe (Corning, Avon, Frankrig) i 10 ml CSC medium bestående i DMEM /F12-medium plus glutamax (Life Technologies), 4 ug /ml heparin (Sigma), 2% B27 supplement (Life teknologier), 20 ng /mL epidermal vækstfaktor (EGF, Peprotech, Neuilly-sur-Seine, Frankrig), 20 ng /mL basisk fibroblastvækstfaktor (FGF-b, Peprotech) og 1% PS. Frisk EGF, FGF-b og heparin blev tilsat til medium hver 3. dag. Tumorspheres lodes vokse i 4 dage (B16-F10) eller 7 dage (HT-29 og MCF-7). For dissociation blev tumorspheres først centrifugeret i 5 minutter ved 200 g, blev pelleten derefter forsigtigt resuspenderet i 500 pi Accutase (Life Technologies), inden de blev inkuberet i 5 minutter ved 37 ° C. Efter tilsætning af 2 ml DMEM /F12 blev tumorspheres dissocieret ved forsigtig pipettering og direkte overføres tilbage til tumorspheres dyrkningsbetingelser som beskrevet tidligere. Salg

Tumorsphere-dannende Efficiency assay Salg

ARIAIII cellesorteringsapparat (BD Biosciences , USA) blev anvendt til præcist at overføre 1 enkelt levedygtige celler (

dvs.

propidiumiodid-negative celle) i hver brønd i en plade med ultralav adhærens 96 brønde (Corning) indeholdende 100 pi CSC medium. Frisk EGF, blev FGF-b og heparin tilsættes hver 3. dag. Dette eksperiment blev udført for at vurdere den tumorsphere dannelse cellernes evne oprindelse fra adhærente kulturer eller fra tidligere dannede primære eller sekundære tumorspheres. Efter 10 dages dyrkning, antallet af brønde indeholdende en tumorsphere større end 50 um, blev bestemt ved anvendelse af et fasekontrastmikroskop.

klongenicitetsassayet

ARIAIII cellesorteringsapparat blev anvendt til præcist at overføre 200 levedygtige celler (

dvs.

propidiumiodid-negative celler), adskilles fra en uger gamle tumorspheres eller vedhængende monolag kultur, i hver brønd i en normal vedhæftning 6-brønds plade indeholdende DMEM suppleret med 10% FBS og 1% PS. Efter 5 dages dyrkning for B16-F10 og 10 dage for HT-29 og MCF-7 blev mediet kasseret, cellerne blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) og fikseret og farvet under anvendelse af en vandig opløsning indeholdende 20% ethanol, 3,7% formaldehyd og 0,2% krystalviolet. Clonogenicity blev beregnet som antallet af kolonier dannet i forhold til antallet af kolonier dannet ud fra adhærerende celler.

proliferationsassav

ARIAIII cellesorteringsapparat blev anvendt til at overføre 1 000 B16-F10 levedygtige celler (

dvs.

propidiumiodid-negative celler), adskilles fra en uger gamle tumorspheres eller fra vedhæftende monolag, i hver brønd i en normal vedhæftning 96-brønds plade indeholdende DMEM suppleret med 10% FBS og 1% PS. Pladen blev anbragt i en IncuCyte ™ FLR imaging system (Essen Biosciences, Welwyn Garden City, UK) i en regelmæssig cellekultur inkubator (37 ° C, 95% fugtighed, 5% CO

2). Fire forskellige områder per brønd blev overvåget (10 × forstørrelse, fasekontrast) med IncuCyte ™ hver 4 timer i løbet af en uge. Proliferation blev målt med IncuCyte ™ software og fordoblingstid blev bestemt ved hjælp af en lineær regressionsmodel.

Immunfarvning Assay

50 000 levedygtige B16-F10-celler (trypan udelukkelse test blå) adskilles fra den ene -Uge gamle tumorspheres eller fra trypsinerede vedhæftende monolag blev inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C i mørke med 0,5 ug af rotte-anti-muse-monoklonalt CD133-APC, CD44-FITC eller CD24-PE antistoffer (eBiosciences, Paris, Frankrig) i 100 pi af en pufferopløsning bestående i PBS indeholdende 3% bovint serumalbumin (Sigma). Immunfarvning blev også udført for HT-29, MCF-7 og MDA-MB-231 cellelinjer under anvendelse af muse-anti-humant monoklonalt CD133-APC, CD44-PE, CD44-APC eller CD24-FITC-antistoffer (Miltenyi Biotec, Paris, Frankrig) ifølge producentens instruktioner. Celler blev derefter vasket og analyseret med en Accuri C6 flowcytometer (BD Biosciences, USA).

Side Befolkning Assay

En enkelt celle suspension af 1,10

6 B16-F10 celler /mL i et serumfrit DMEM /F12-medium blev fremstillet ved anvendelse af dissocierede en uger gamle tumorspheres eller adhærente monolag. Denne cellesuspension blev inkuberet med 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma) i 90 minutter ved 37 ° C i mørke. En negativ kontrol cellesuspension udsat for Hoescht 33342 og 50 uM verapamil (Sigma) blev inkuberet parallelt. Celler blev derefter vasket med PBS og resuspenderet i et serumfrit DMEM /F12 indeholdende 5 ug /ml propidiumiodid (Sigma) for at udelukke døde celler. Analyse blev udført under anvendelse af en LSR II flowcytometer (BD Biosciences).

Kvantitativ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

TRIzol® reagens (Life Technologies) blev anvendt til at ekstrahere total RNA fra B16-F10 adhærente celler eller tumorspheres overensstemmelse med producentens anvisninger. 1 ug RNA blev revers-transkriberet ved hjælp af M-MLV revers transkriptase (Life Technologies). Amplifikation og påvisning ved SYBR Green blev realiseret ved hjælp af Step One Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems, Frankrig) ifølge producentens anvisninger. 18S housekeeping-genet blev anvendt som en intern standard. Følgende primere blev anvendt ved 10 uM hver:

E-cadherin:

frem 5′-GAGCCTGAGTCCTGCAGTCC-3 ‘, omvendt: 5′-TGTATTGCTGCTTGGCCTCA-3’

vimentin:

frem 5′-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3 ‘, omvendt: 5′-GATTCCACTTTCCGTTCAAGGT-3’

Snai1:

frem 5′-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3 ‘, omvendt : 5’-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3 ‘

18S:

frem 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′, omvendt: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3 ‘

Tumorigenicitet Assay

100 pi DMEM /F12 indeholdende 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 eller 100 000 levedygtige celler (trypan udelukkelse test blå) fra dissocierede B16-F10 tumorspheres blev injiceret i begge flanker af 6-til -8 uger gamle C57BL /6-mus (Harlan, Gannat, Frankrig) to forskellige steder. Den 1 000 celler-injicerede mus gruppe bestod 6 mus og de andre grupper bestod 3 mus hver. Kontrolgrupperne blev injiceret med de samme antal af celler, der stammer fra B16-F10 adhærente kulturer og resuspenderet i 100 pi DMEM. Mus blev kontrolleret to til tre gange om ugen i 50 dage. Musene blev aflivet, så snart tumorerne nåede 2 000 mm

3 eller blev nekrotiske for at minimere dyrenes lidelser.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som gennemsnit og standardafvigelser.

data blev analyseret ved hjælp af ikke parametriske Mann-Whitney-Wilcoxon test, Kruskall-Wallis test med Dunns rettelse eller χ2 test og p. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

B16-F10, HT-29 og MCF-7 celler er i stand til at danne Tumorspheres

B16-F10, HT-29, MCF-7 og MDA-MB-231-cellelinjer blev dyrket i en forankringsuafhængig måde , hvilket betyder på en ikke-klæbende substrat i et serum-frit medium indeholdende vækstfaktorer til formål at opretholde pluripotens (

dvs.

FGF-b og EGF). Efter 4 dage i kultur i B16-F10-celler og 7 dage for HT-29 og MCF-7-celler, blev tumorspheres på ca. 100 um i diameter observeret (figur 1) og dissocieres til subkultur. Tværtimod har MDA-MB-231-celler ikke formår at danne tumorspheres, selv efter mere end 10 dage.

(A) B16-F10, (B) HT-29 og (C) MCF-7 tumorspheres. Tumorspheres blev dannet efter 4 til 7 dages dyrkning i serumfrit medium indeholdende FGF-b og EGF på ultralav adhærens substrat. Scale søjler repræsenterer 100 um.

B16-F10 tumorspheres kunne dyrkes som tumorspheres for længere passager (mere end 20 passager). Omkring 20% ​​af B16-F10 celler var i stand til at danne en tumorsphere og denne sats været forholdsvis konstant over mindst den tre første passager (figur 2). Lignende satser blev opnået for MCF-7 tumorspheres dannelse effektivitet. Hvad angår HT-29 cellelinien, 80% af de adhærente celler var i stand til at danne primære tumorspheres mens vi observeret et fald ned til omkring 50% af cellerne for sekundære eller tertiære tumorspheres formation. Men disse forskelle var, ikke statistisk signifikant.

Tumorspheres dannelse effektivitet var meget cellelinie-afhængige. T1: primær, T2: sekundær, T3:. Tertiær

evnen til at danne Adhærerende Kolonier er faldet efter en uge Kultur som Tumorspheres

Et uger gamle tumorspheres afledt B16-F10, HT-29 eller MCF-7-celler blev dissocieret, ført tilbage til adhærente betingelser og deres kolonidannelse effektiviteter sammenlignet med den af ​​adhærente celler. Clonogenicity af tumorspheres-dannende celler afledt fra de tre cellelinier blev signifikant reduceret, nemlig en 20-til-30% fald i forhold til adhærente celler (Figur 3, panel A). Desuden 30% til 80% af adhærente kolonier afledt af B16-F10 tumorspheres-dannende celler var synligt mindre tæt end dem, der følger af adhærente celler (figur 3, panel B og C). Dette antyder, at tumorspheres-dannende celler undergik en tilpasning eller en markering til kulturen i suspension, hvilket resulterer i en svagere evne til at vedhæfte til substratet. Der blev ikke observeret en sådan ændring i kolonier morfologi i tilfældet med HT-29 og MCF-7-cellelinjer.

(A) Tumorspheres-dannende celler dannet ca. 20 til 30% mindre kolonier end adhærente celler, afhængigt af cellelinien betragtet (*** p 0,001 for B16-F10 og HT-29-celler, ** p 0,01 for MCF-7-celler). (B) Adhærerende B16-F10-celler altid dannet rund og pakket kolonier henviser (C) B16-F10 tumorspheres-dannende celler også dannet et variabelt antal dårligt tætte kolonier, der spænder fra 30% op til 80% af det samlede antal kolonier. Scale søjler repræsenterer 200 um.

B16-F10 Tumorspheres-dannende celler vokser langsommere i Adhærente Betingelser end deres Adhærente modstykker

B16-F10 vedhængende og tumorspheres-dannende celler (både fra primære og sekundære tumorspheres) blev dyrket under adhærente betingelser i en uge og deres proliferation blev kvantificeret under anvendelse af Incucyte ™ sammenløbet algoritme. Fordoblingstid på B16-F10-celler fra sekundære tumorspheres var signifikant højere end deres adhærerende celle modstykker (figur 4) tyder igen at tumorspheres-dannende celler undergik en tilpasning til kulturen i suspension, hvilket resulterer i en svagere proliferation under adhærente betingelser.

fordoblingstid på B16-F10-celler fra sekundære tumorspheres var signifikant højere end for adhærente celler. Ns: ikke statistisk signifikant, * for p 0,05

Tumorspheres Kultur Påvirker Ekspression af CSC Markers i en celle Line-afhængig måde

Immunfarvning er også en klassisk metode til at identificere. CSC [1], [15]. Derfor celler fra tumorspheres eller adhærente monolag blev immunfarvet ved anvendelse af antistoffer, der genkender de mest almindelige CSC overflademarkører,

dvs..

CD133, CD44 og CD24-proteiner (Tabel 1). Ifølge litteraturen er CD133, CD44 og CD24 anvendes til at identificere CSC befolkning i B16-F10-cellelinien [16] hvorimod kun CD133 og CD44 er identificeret som pålidelige markører for HT-29 CSC [17]. Med hensyn brystkræft cellelinier, såsom MCF-7 og MDA-MB-231, en CD44

+ CD24

-. Profil blev beskrevet for CSC [18], [19]

i adhærente monolag, næsten alle B16-F10-celler udtrykte CD44 henviser CD133 og CD24-proteiner blev fundet i mindre end 1% af cellerne. Men disse satser forblev uændret efter dyrke celler som tumorspheres for op til 23 passager. Selvom CSC også kan identificeres som en side population kunne udstrømning Hoechst 33342 takket til membran ABC transportører [15], [20], blev der ikke side population detekteret i enten B16-F10 vedhængende eller tumorspheres-dannende celler (data ikke vist).

Hvad angår HT-29 cellelinien, en stigning på 15% af CD133

+ CD44

+ -celler blev detekteret i tumorspheres (49,6% af celler) sammenlignet med adhærente celler (34,3% af celler) , antyder mod en berigelse i CSC. Men denne forskel var ikke statistisk signifikant på grund af høje standardafvigelser

MCF-7 celler indeholdt omkring 50% CD44

+ CD24

-. Celler i vedhængende befolkning. Dette faldt ned til 33,1%, når cellerne blev dyrket som tumorspheres, skønt denne forskel ikke var statistisk signifikant. I tilfældet med de MDA-MB-231-celler, som ikke var effektiv på alle i dannelse tumorspheres, mere end 99% af det klæbende cellepopulation var CD44

+ CD24

-.

Tumorspheres Kultur af B16-F10 Formindsker Ekspression af vimentin og E-cadherin

som tidligere nævnt, rapporterede flere forfattere, at CSC har post-EMT celler egenskaber, herunder nedregulering af epitelial markører (

f.eks

E-cadherin) og opregulering af mesenkymale markører (

f.eks

vimentin og Snai1) [8], [11]. En RT-qPCR-analyse blev udført for at sammenligne ekspressionen af ​​E-cadherin, vimentin og Snai1 i begge B16-F10 adhærente celler og tumorspheres. Både E-cadherin og vimentin genekspression var faldet betydeligt, når celler blev dyrket som tumorspheres. Vi har registreret 50% mindre E-cadherin-mRNA (figur 5, panel A) og 80% mindre vimentin mRNA i tumorspheres end i adhærente celler (figur 5, panel B). Snai1 mRNA blev ikke påvist i enten celledyrkningsbetingelser.

Både vimentin (A) og E-cadherin (B) blev nedreguleret i tumorspheres. *** For p. 0,001

B16-F10 Tumorspheres-dannende celler er mindre Tumorgenetisk end klæbende celler i en syngene Mouse Model

Den gyldne standard metode til at vurdere tilstedeværelsen af CSC består i at injicere en CSC beriget population i mus og observere højere tumor tage satser sammenlignet med mus injiceret med ikke-CSC beriget celler [1], [15]. C57BL /6-mus blev injiceret subkutant med enten 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 eller 100 000 B16-F10-celler, som var adhærente celler for én gruppe og tumorspheres-dannende celler til den anden gruppe. blev påvist tumorer, når mindst 1 000 celler var blevet injiceret. Når dette antal celler blev injiceret, tumorspheres-dannende celler var signifikant mindre tumorigene end deres adhærerende modstykker (figur 6, panel B). Men på nogen af ​​de højere mængder af injicerede celler, blev observeret mellem de to grupper (figur 6, panel A og B), ingen signifikant forskel.

(A) Injektion af 300, 3 000 eller 30 000 celler . (B) Injektion af 1 000, 10 000 eller 100 000 celler. Når 1 000 celler blev injiceret i mus, tumorspheres-dannende celler var signifikant mindre tumorigene end deres adhærerende modstykker. Adh: adhærente celler, Sph: tumorspheres-dannende celler. Ns:. Ikke signifikant, * for p 0,05

Diskussion

Kræft stamceller (CSC) er i øjeblikket grundigt undersøgt, da de formodes at igangsætte og opretholde tumorvækst og desuden er menes at være ansvarlig for tumor recidiv [1].

Tumorspheres kultur er blevet rapporteret til at berige flere cancer cellelinier, såsom bryst, lever, tyktarm og æggestokkene cancer cellelinjer i CSC [15]. I dette papir, testede vi CSC tilsætning ved tumorspheres kultur af B16-F10 murine melanomceller, HT-29 human colon adenocarcinoma celler og MCF-7 og MDA-MB-231 humane brystadenokarcinomceller.

Som modsætning til hvad Zhong

et al.

observeret [21], viste vores eksperiment, B16-F10 celler prolifererede let i suspension som tumorspheres i 3 måneder mindst. De tumorspheres-dannende satser af B16-F10 og MCF-7 celler forblev konstant i de tre første passager, hvilket er en accepteret kendetegnende for CSC selvfornyelse. HT-29-celler genereret også tumorspheres selvom dannelseshastigheden tendens til at falde efter den første passage. Tværtimod den tumorspheres kultur af MDA-MB-231 celler forblev resultatløse. Denne observation var i overensstemmelse med, hvad nogle forfattere rapporteret [22], [23], selv om andre viste denne cellelinie var faktisk i stand til at danne tumorspheres [24], [25]. Vi antager, at udryddelsen af ​​tumorspheres dannelse evne vores MDA-MB-231 celler kan skyldes det faktum, at disse celler var blevet passage mange gange før vores eksperimenter. Faktisk har denne konsekvens af cellen passage på tumorspheres dannelsen satser blevet tidligere vist [26]. Yderligere karakteriseringer blev derfor udført for at konkludere på stemness egenskaber B16-F10, HT-29 og MCF-7 tumorspheres.

CSC konceptet hedder, at tumorvækst er drevet af kræftceller med stemness karakteristika, som har erhvervet en proliferativ potentiale og en clonogenicity medieret af en selvfornyelse evne. Efter aftale med denne hypotese, flere rapporter nævner, at formodede CSC har forbedret clonogenicity [27] – [31] og formere hurtigere [29] – [31] end ikke-CSC. vores undersøgelse viste imidlertid, at B16-F10 tumorspheres-dannende celler var mindre proliferativ end klæbende celler i vedhængende betingelser. Desuden B16-F10, HT-29 og MCF-7-celler udviste en lavere klonogen potentiale ved dyrkning som tumorspheres. Vi antager, at tumorspheres-dannende celler tilpasset til kulturen i suspension, hvilket resulterer i en svagere evne til at knytte til (og vokse på) en regelmæssig vedhæftende substrat. Denne måde udelukker beskrivelse af en berigelse i CSC i tumorspheres.

Vi yderligere undersøgt stemness egenskaber ved hjælp af klassiske biomarkører rapporteret for CSC identifikation [1], [15]. Dou og medarbejdere viste, at B16-F10 CD133

+ CD44

+ CD24

+ celler er beriget med CSC [16]. Derfor sammenlignede vi den procentdel af CD133

+, CD44

+ og CD24

+ celler i B16-F10 tumorspheres og adhærente celler, men vi havde ikke observere nogen forskel. Selv om Hoechst 33342 efflux-kompetente celler også blevet vist i litteraturen, der skal beriges i formodet CSC [15], [20], sådan cellepopulation blev detekteret i begge tumorspheres og adhærente B16-F10-celler. Dette antyder, at den side befolkning assayet er ikke relevant for påvisning af CSC i alle celletyper.

Hvad angår HT-29 cellelinien, en tredjedel af befolkningen havde profilen af ​​colon CSC,

dvs.

. var CD133

+ CD44

+ celler [17], [32], og denne steg op til 50%, når cellerne blev dyrket som tumorspheres. Men på grund af høje standardafvigelser i denne analyse sammen med observationer af en nedsat clonogenicity og en nedsat tumorspheres formation effektivitet efter den første passage, kunne vi ikke konkludere på en CSC berigelse.

Vi kvantificeret også CD44

+ CD24

– bryst CSC population [33] i både MCF-7- og MDA-MB-231-celler. Den tidligere cellelinje viste et fald i CD44 17%

+ CD24

– cellepopulation i tumorspheres, i overensstemmelse med lavere klonogene potentiale, vi observeret, når cellerne blev dyrket som sådan. Overraskende, næsten alle MDA-MB-231 klæbende celler var CD44

+ CD24

-, selv om vi ikke opnå nogen tumorsphere fra denne cellelinie

Alle disse data tyder på, at dannelsen af ​​tumorspheres. ikke altid korrelerer med en berigning på tidligere beskrevne CSC markører, og også, at andelen af ​​celler, der udtrykker disse CSC markører ikke forudsige tumorspheres dannelse evne, i det mindste inden for rammerne af de kræft cellelinjer undersøgt i denne rapport.

Mere påfaldende, den tumorigent potentiale af B16-F10 tumorspheres-dannende celler var lavere end de B16-F10 adhærente celler, der bekræfter alle de

in vitro

data, vi opnåede. Meget nylig, Collura og medarbejdere publicerede lignende fund [34]. da tumorspheres også viste sig at være mere effektive i at indlede tumorer end vedhængende monolag i tilfælde af flere andre cancer cellelinjer [35] Dog – [38], dette tyder på, at effekten af ​​tumorspheres kultur på tumorgenicitet afhænger meget af den undersøgte celle . linje

Et stigende antal forfattere rapporterer, at CSC nuværende post-EMT celler egenskaber [8], [10] – [12]. Ekspressionen af ​​tre EMT-relaterede gener (kodende for E-cadherin, Snai1 og vimentin) blev evalueret i B16-F10 tumorspheres anvendelse af RT-qPCR analyse. E-cadherin er involveret i interaktioner mellem epitel-lignende celler og er nedreguleret af Snai1. Vimentin er en mellemliggende filament udtrykt i mesenchymale celler. De to store kendetegnende for EMT er en nedregulering af E-cadherin-ekspression og en opregulering af vimentin udtryk [39] – [42]. I tumorigenisitetsforsøg analyser, dette fører til en øget tumor tage. I vores undersøgelse af B16-F10-celler, blev vimentin mRNA-niveau faldt dramatisk i tumorspheres, understøtter det faktum, at de gav et lavere tumorgenicitet forhold til adhærente celler. Men E-cadherin mRNA-niveau var også lavere i tumorspheres og overraskende, vi ikke registrere Snai1 mRNA, som udløser nedregulering af E-cadherin under EMT [8]. Dette viser, at en anden pathway kan være involveret i tumorspheres-dannende celler for at forhindre ekspressionen af ​​E-cadherin. Kombinationen af ​​den reducerede ekspression af E-cadherin og dermed fremme EMT, sammen med reduceret ekspression af vimentin, fremme en mesenchymal-til-epitel overgang (MET), kan forklare den lille forskel på tumorigenicitet mellem tumorspheres og adhærente celler. Vores resultater viser, at tumorspheres kultur af B16-F10 celler faktisk påvirker ekspressionen af ​​EMT-relaterede gener, men det er endnu ikke klarlagt, hvis cellerne i tumorspheres præsentere karakteristika EMT eller behandling.

Først, vi konkludere, at stærk udtryk for CSC overflademarkører ikke prædiktiv for tumorspheres dannelse, som vist for MDA-MB-231 celler.

for det andet, vores resultater fører os til at konkludere, at tumorspheres kulturen ikke er en effektiv metode til at berige B16-F10 murint melanom og MCF-7 humane brystadenocarcinom cellelinier i CSC. Hvad angår HT-29 cellelinien, var resultaterne mindre klar og ingen konklusion kunne drages. I betragtning af vores undersøgelse og de andre rapportering en styrkelse af CSC træk i tumorspheres kulturer, konkluderer vi, at denne metode synes at berige i CSC i en cellelinje-afhængig måde, uanset arten eller kræft typer overvejes. Selvom vores konklusioner kun drages af cancercellelinjer, tumorspheres genereret fra primære humane tumorer (gliomer) er også blevet rapporteret at være vanskeligt at videredyrke med øget differentiering og apoptose sammenlignet med vedhængende CSC kultur på lamininovertrukne kolber [43].

for at opsummere, er dannelsen af ​​tumorspheres ikke altid forudsige en berigelse i CSC og kan derfor ikke betragtes som en universel metode til CSC berigelse i kræftceller. En omfattende karakterisering for CSC signatur i tumorspheres-dannende celler er først og fremmest obligatorisk inden afslutningen på opfyldelsen af ​​CSC berigelse.

Uden for rammen af ​​CSC berigelse, generering af tumorspheres stadig en interessant og nyttig teknik. For eksempel er det blevet vist for flere år siden, at DNA transfektionseffektiviteten i tumor er lav [44], [45] på grund af en meget kompleks struktur, og at kun celler placeret på den ydre overflade af tumoren er let tilgængelige og dermed effektivt transficeres [46].