PLoS ONE: MUC1c Regulerer Cell Overlevelse i kræft i bugspytkirtlen ved Forebyggelse Lysosomal Permeabilization

Abstrakt

Baggrund

MUC1 er en type I transmembrant glycoprotein afvigende overudtrykt i forskellige cancerceller, herunder kræft i bugspytkirtlen. Den cytosoliske ende af MUC1 (MUC1-c) er stærkt involveret i en række signalveje. MUC1-c er rapporteret at inhibere apoptose i en række cancerceller, men mekanismen for inhibering er uklar.

Metode

Ekspression af MUC1-c blev undersøgt i pancreas cancercellelinie MiaPaCa -2 på RNA niveau ved hjælp af qRTPCR og på proteinniveauet ved Western blotting. MUC1-c ekspression blev inhiberet enten ved siRNA eller af et specifikt peptid-inhibitor, GO-201. Effekt af MUC1-c-inhibering på levedygtighed og proliferation og lysosomal permeabilisering blev undersøgt. Sammenslutningen af ​​MUC1-c med HSP70 blev påvist ved co-immunoudfældning af MUC1-c og HSP70. Lokalisering af MUC1-c i cellulære organeller blev overvåget af immunofluorescens og med immun- blotting af MUC1-c-antistof efter subcellulær fraktionering.

Resultater

Hæmning af MUC1-c ved en inhibitor (go- 201) eller siRNA resulterede i reduceret levedygtighed og reduceret spredning af kræft i bugspytkirtlen celler. Endvidere GO-201, peptidet inhibitor af MUC1-C blev effektiv til reduktion af tumorbelastning i bugspytkirtelkræft musemodel. MUC1-c viste sig også at være forbundet med HSP70 i cytosolen, selv om en betydelig mængde MUC1 også blev set at være til stede i lysosomerne. Inhibering af MUC1 ekspression eller aktivitet viste en forøget Cathepsin B-aktivitet i cytosolen, hvilket indikerer lysosomal permeabilisering. denne undersøgelse viser derfor, at MUC1-c interagerede med HSP70 i cytosolen af ​​bugspytkirtelkræftceller og lokaliseret til lysosomerne i disse celler. Endvidere viste vores resultater, at MUC1-c beskytter bugspytkirtelkræftceller fra celledød ved at stabilisere lysosomer og forhindre frigivelse af Cathepsin B i cytosolen

Henvisning:. Banerjee S, Mujumdar N, Dudeja V, Mackenzie T, Krosch TK, Sangwan V, et al. (2012) MUC1c Regulerer Cell Overlevelse i kræft i bugspytkirtlen ved Forebyggelse Lysosomal Permeabilisering. PLoS ONE 7 (8): e43020. doi: 10,1371 /journal.pone.0043020

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: 14. april, 2012; Accepteret: 16. juli 2012; Udgivet: 13 august, 2012 |

Copyright: © Banerjee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev finansieret af National Institutes of Health R21 5R21CA131663-02, R01 5R01CA124723-05 og Catherine og Robert Goodale fundament til AKS. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft død hos både mænd og kvinder i USA. De fleste pancreascancer er duktalt adenokarcinom. Den 5-årige overlevelsesrate for patienter med lokaliseret sygdom efter kirurgisk resektion er 20%, og for dem med metastatisk sygdom, overlevelsesraten er meget lav. Skønt betydelige ressourcer er blevet engageret i at forbedre overlevelsen af ​​patienter med kræft i bugspytkirtlen i de seneste årtier er der sket nogen væsentlig forbedring i disse tal [1]. Den ringe overlevelse tilskrives den sene påvisning af pancreascancer og ekstrem modstand af tumorcellerne til enhver kemoterapeutiske strategier. Derfor belysning af resistensmekanisme af bugspytkirtelkræftceller er en førsteklasses forskning fokus, da det kan føre til udvikling af nye terapeutiske modaliteter.

Muciner transmembrane glycoproteiner, til stede på overfladen af ​​forskellige mucosale epitel og hæmatopoietiske celler, og er rapporteret at være overudtrykt i et antal adenokarcinomer [2]. MUC1 er en af ​​de muciner, der er associeret med dårlig prognose, malign transformation af tumorceller, og modstand mod genotoksiske anticancermidler [3], [4]. MUC1 er også forbundet med invasion [5] – [7], [8], der kontrollerer adskillige cellulære signalveje [9] og tumorprogression [10]. Mangel på MUC1 er blevet korreleret med nedsat proliferation, invasion, og mitose satser både

in vivo

in vitro

i bugspytkirtelkræft [11].

MUC1 syntetiseres som et enkelt peptid, der undergår spaltning i to underenheder, efterfølgende dannelse af et stabilt ikke-kovalent heterodimer bestående af et ekstracellulært domæne og et cytoplasmatisk hale [12], [13]. Det ekstracellulære domæne af MUC1 er sammensat af variable antal tandemgentagelser (VNTR) modificeret ved omfattende O-glycaner, og virker som en fysisk barriere mod det ekstracellulære miljø. Den cytoplasmatiske hale af MUC1 (MUC1-c) består af en 58 aminosyrer ekstracellulært domæne, et 28 aminosyre transmembrant domæne og et 72 aminosyre cytoplasmatisk domæne. Denne cytoplasmatisk domæne (betegnet MUC1-c) interagerer med β-catenin, den største effektor af den kanoniske Wnt signalvejen [14], [15], og inducerer forankringsuafhængig vækst og tumorigenicitet [16], [17]. Interaktion med β-catenin fremmer lokalisering af MUC1 til kernen, hvor MUC1-c interagerer med forskellige transkriptionsfaktorer og aktiverer en række vækst- og overlevelse pathways [18] – [24], hvorved undertrykke flere celledødsveje [25] – [ ,,,0],29].

overekspression af MUC1, som findes i humane tumorer, er forbundet med lokalisering af MUC1-c for mitokondrier [3]. Den funktionelle betydning af mitokondrie MUC1-c lokalisering understøttes af demonstrationen, at MUC1 svækker DNA beskadigelse-induceret frigivelse af mitokondrie apoptogenic faktorer og apoptotiske respons [3]. Da MUC1 ikke har den klassiske mitokondrie lokalisering signatur, er det mitokondrielle målretning af MUC1-C medieret af dens interaktion med cytosoliske chaperoner såsom HSP70 og HSP90 [30]. Som det nyligt syntetiseret og -cleaved MUC1-c er i cytosolen med en eksponeret hydrofobt transmembrandomæne [31], [30], disse chaperoner kan binde til det og levere det til mitochondrier [32]. Sammenslutningen af ​​MUC1-c med varmechokproteiner efter aktivering med heregulin og dens efterfølgende målretning til den mitokondriske ydre membran er blevet rapporteret [33]. Som en bestanddel af den mitokondriske ydre membran, MUC1-c dæmper tab af transmembranpotentialet som reaktion på genotoksisk stress [34], [3], og bibringer resistens til døden i det cellulære respons på DNA beskadigelse, reaktive oxygenarter, hypoxi, eller aktivering af død receptorsuperfamilie [34].

Selvom de nedstrøms veje for celledød som følge af MUC1 inhibering er blevet undersøgt i en række cancere, mekanismen for indledning af mitokondrie depolarisering (efter MUC1 inhibering ) fører til aktivering af apoptotiske veje er ikke klart i bugspytkirtelkræft. Mitochondriemembran depolarisering kan være resultatet af en række begivenheder. Beskadigelse af nukleare DNA eller endoplasmatisk reticulum både inducere apoptotisk celledød, der er afhængig af mitokondriel depolarisering og caspaseaktivering [35]. Lignende depolarisering og initiering af celledød veje kan også udløses fra lysosomerne. Lysosomal skade som respons på genotoksiske midler er rapporteret at initiere celledød ved frigivelse af de hydrolytiske enzymer fra denne organel i cytoplasmaet [36], [37]. Lysosomer indeholder mange forskellige typer af hydrolytiske enzymer, herunder proteaser, lipaser, nukleaser, glycosidaser, phospholipaser, phosphataser og sulfataser, der normalt udøver deres maksimale enzymatiske aktivitet ved lav pH. Lysosomale proteaser, har været impliceret i celledød er de Cathepsiner, der forbliver aktive ved en neutral pH-værdi, såsom Cathepsin B, Cathepsin D og Cathepsin L. Disse proteaser aktiverer apoptotiske effektorer, såsom mitochondrier og /eller caspaser, der udløser apoptose [38] ., [39]

Et af proteintyper fremmer overlevelsen af ​​de pancreasceller er familien af ​​varmechokproteiner, især HSP70 [37], [40] – [42]. Det er blevet rapporteret, at nedregulering af HSP70 resulterer i bugspytkirtelkræft celledød ved at inducere lysosomal permeabilisering, [37], men den nøjagtige mekanisme af beskyttelse er ikke undersøgt.

I den aktuelle undersøgelse viser vi, at HSP70 forbinder med den C-terminale ende af MUC1 protein (MUC1-c) og transporterer den til lysosymet, for derved at forhindre lysosomal permeabilisering og fremme celleoverlevelse i disse tumorceller. Vi viser desuden, at inhibitoren peptidet af MUC1 (GO-201) inhiberer aktiviteten af ​​MUC1-c og resulterer i reduceret celleproliferation og levedygtighed af tumorceller både

in vivo

in vitro.

Resultater

bugspytkirtelkræftceller Vis Øget ekspression af MUC1 forhold til den normale pancreas

Angivelse af MUC1 er undersøgt i flere bugspytkirtelkræft cellelinjer på både RNA og protein niveau . Ekspressionen af ​​MUC1 mRNA viste sig at være signifikant højere i alle pancreascancer cellelinier end i de ikke-tumorgene humane pankreatiske duktale celler (HPDEC) (fig. 1A). Tilsvarende forhøjede ekspression af MUC1-c protein blev set i alle tumorcellelinier i sammenligning med de ikke-tumorigene HPDECs. En korrelation blev fundet at eksistere mellem aggressivitet cellelinje og ekspression af MUC1 i pancreascancer (fig. 1B). Højere udtryk for MUC1 blev observeret i mere invasive og metastatiske cellelinier S2-013 og S2-VP10 eller AsPC1 (afledt af ascites) end i cellelinjer skabt på primære tumorer (MiaPaCa-2, BXPC3 og Hs776T).

mRNA ekspressionsniveauer af MUC1 i adskillige pancreatiske cancercellelinier forhold til ikke-tumorigen HPDEC (A). Data er udtrykt som middelværdi +/- SEM for 3 uafhængige eksperimenter. *

P

0,05 (

t

test) sammenlignet med kontroller. Protein ekspressionsniveauer af MUC1-c i forskellige bugspytkirtelkræft cellelinje og ikke-tumorigen HPDEC (B).

Hæmning af MUC1 medfører reduceret spredning og celledød

For at studere, hvis MUC1 var et essentielt protein kontrollerende celleoverlevelse i pancreascancer, blev dets ekspression inhiberes ved hjælp siRNA mod MUC1 i MiaPaCa-2 (fig. 2A-C) og AsPC1 (fig. 2G-i) celler. Sideløbende har vi også brugt GO-201, et peptid fragment, der hæmmer aktiviteten af ​​MUC1-c, hvilket fører til deregulering af downstream signalering aktivitet og udløser celledød i bugspytkirtelkræft cellelinjer MiaPaCa-2 (fig. 2D-F) og AsPC1 ( fig. 2J-L). Både inhibering af MUC1 ekspression af siRNA (Fig. 2 A, G) samt inhibering af MUC1-c-aktivitet ved GO-201 førte til reduceret proliferation og forøget celledød i bugspytkirtelkræftceller. MiaPaCa-2-celler blev set at reagere mere til inhibering af MUC1 enten ved siRNA eller af GO-201 (fig. 2A-F) sammenlignet med AsPC1 celler (Fig. 2G-L). Som forventet, GO-201, peptidet hæmmer til MUC1-C, ændrede ikke ekspressionsniveauet af proteinet (fig. 2D, J). Celledød blev set at være caspase-medieret (fig S1).

MUC1 ekspression blev inhiberet af siRNA i MiaPaCa-2 (A) bane 1-3 show kontrol MiaPaCa-2, MiaPaCa-2 transficeret med ikke- specifikke siRNA og MUC1 siRNA hhv. Både proliferation (B) og levedygtighed (C) blev reduceret med reduceret ekspression af MUC1 i MiaPaCa-2-celler. Ved behandling med MUC1-C-aktivitet inhibitor GO-201, der inhiberer signalering aktivitet af dette protein, blev ingen ændring ses i ekspressionsniveauer af MUC1 i MiaPaCa-2-celler (D). Bane 1 var ubehandlede MiaPaCa-2 celler og bane 2 var MiaPaCa-2 behandles med GO-201. Proliferation (E) og levedygtighed (F) blev set være nedsat. Tilsvarende i en anden cellelinje, AsPC-1, transfektion med siRNA viste nedsat protein niveauer (G), hvor Bane 1 er styre AsPC-1, bane 2: ikke-specifikke siRNA transficeret AsPC-1 og Bane 3 er MUC1 siRNA-transficerede AsPC1 . Både proliferation (H) og levedygtighed (I) blev reduceret. Ved behandling med inhibitoren GO-201, var der ingen ændring i proteinniveauer (J): Bane 1 blev ubehandlede AsPC-1-celler og bane 2 var AsPC-1 behandlet med GO-201. Proliferation (K) og levedygtighed (L) sås at blive reduceret. Data er udtrykt som middelværdi +/- SEM for 3 uafhængige eksperimenter. *

P

. 0,05 (

t

test) sammenlignet med kontroller

MUC1 Associates med HSP70 i cytosolen og lokaliserer i Lysosomer

Heat shock protein 70 (HSP70) er stærkt overudtrykt i bugspytkirtelkræft og dets nedregulering af hæmmere og siRNA er set at fremkalde kræft i bugspytkirtlen celledød [37]. Men den nøjagtige rolle, som HSP70 spiller i overlevelsen af ​​bugspytkirtelkræftceller er ukendt. Samtidig er MUC1 kendt for at være overudtrykt i bugspytkirtelkræft og spille en rolle i celle overlevelse i en række cancer-cellelinjer, men den nøjagtige mekanisme har været undvigende [11], [43], [44]. Da HSP70 er en chaperone, det har evnen til at binde til og sekvestrering cytosol MUC1-c derved målrette den til forskellige cellulære organeller, hvor MUC1-c kunne regulere de forskellige anti-apoptotiske veje til at beskytte bugspytkirtelkræftceller fra apoptotisk celledød. Det er tidligere blevet vist, at MUC1 binder til HSP70 og HSP90 og er målrettet til den mitokondriske ydre membran [33]. For at se, om MUC1-c er forbundet med HSP70 i bugspytkirtelkræftceller, vi testet for co-udfældning af MUC1 og HSP70 i bugspytkirtelkræftceller. MUC1-c og HSP70 viste sig at co-immunpræcipitere, onfirming at HSP70 og MUC1 faktisk interagerer i bugspytkirtelkræftceller (fig. 3A).

Immunopræcipitation med MUC1 og HSP70 viste de to proteiner at være forbundet (A) . Bane 1, 2 og 3 viser total protein niveauer, HSP70 og MUC1 i gennemstrømning og de to proteiner immunpræcipiteret af HSP70-antistof hhv. Bane 4 og 5 viser gennemstrømning og immunopræcipitater af MUC1 antistof. MUC1-c viste sig at være lokaliseret til lysosomerne i MiaPaCa-2 celler, men næsten lige store mængder af MUC1-c var også cytosoliske (B). Lamp2, bosiddende lysosomalt protein, og actin, en overvejende cytosolisk protein, blev anvendt som fraktioneringstrin markører. Bane 1 er den cytosoliske fraktion. Bane 2 er en rå lysosomal fraktion, som yderligere beriges i bane 3. HSP70, selvom forbundet med MUC1, blev set at være til stede, overvejende cytosolen. Immunofluorescens bekræftet co-lokalisering af MUC1-c og Lamp2 i lysosomer (C).

MUC1 er udstrakt til stede på celleoverfladen af ​​pancreasceller. Men den 72 aminosyre C-terminale ende af proteinet undergår auto-spaltning og lokaliseres til forskellige cellulære organeller som reaktion på en differentiel signalering mekanisme. For at se, om MUC1-c faktisk blev transporteret af HSP70 til forskellige cellulære rum, vi udførte immunofluorescens med organel specifikke markører sammen med subcellulær fraktionering efterfulgt af immunblotting med anti-MUC1 antistof for at lede efter sin lokalisering. Integriteten af ​​de forskellige fraktioner, og renheden af ​​de organellar præparater blev bekræftet ved anvendelse af forskellige markører (Lamp2 for lysosomer og Actin for cytosol). Skønt HSP70 blev set at co-udfælde med MUC1-c (fig. 3A), blev det set, at være lokaliseret i cytosolen og ikke i lysosomerne, hvorimod blev fundet MUC1-c til at være lokaliseret i både cytosol og lysosomer (fig. 3B). Lokalisering af MUC1 i lysosomer blev yderligere bekræftet ved co-farvning bugspytkirtelkræftceller med den lysosomale markør Lamp2 (fig. 3C). Immunofluorescens viste, at MUC1 og Lamp2 co-lokalisere med en Pearsons Korrelation af 0,75 (fig. 3C). Dette viste, at MUC1-c er forbundet med HSP70 i cytosolen og lokaliseret i lysosomerne. Nogle MUC1-c blev også set at lokalisere i mitokondrierne, hvilket bekræfter tidligere undersøgelse af Ren et al, at MUC1-c er målrettet til mitokondrier af HSP70 [3] (Fig S2).

Inhibering af MUC1- C eller HSP70 Resultater i Lysosomal permeabilisering fører til celledød

Lysosomal permeabilisering menes ofte at gå forud for celledød som respons på en stimulus ved at frigive en række hydrolytiske enzymer i cytosolen, og derved reducere pH i cytosolen og forårsager acidose [45]. Frigivelse af lysosomale enzymer såsom Cathepsin B og Cathepsin D til gengæld fremkalde mitokondrie depolarisering resulterer i frigivelse af cytochrom C og aktivering af apoptotiske veje [45]. Da en betydelig del af MUC1 blev lokaliseret i lysosomer, vi kiggede for en virkning på lysosomale permeabilisering ved at måle tab af Cathepsin B-Lamp2 co-lokalisering i lysosomerne efter hæmning af MUC1. Vi bekræftede yderligere dette fænomen ved at måle den cytosoliske aktivitet af Cathepsin B i celler efter inhibering af MUC1 af siRNA. Vores immunofluorescens undersøgelser viste en distinkt tab i co-lokalisering af CathepsinB og Lamp2 co-farvning i MUC1-lyddæmpede celler (fig. 4A). Vores biokemiske undersøgelser viste, at inhibering af ekspression af MUC1 viste en stigning i cytosolisk Cathepsin B-aktivitet indikerer, at lysosomale membran integritet den blev kompromitteret (fig. 4B). blev der observeret en næsten lige størrelse af cytosolisk Cathepsin B-aktivitet, når HSP70 blev inhiberet under anvendelse af siRNA (Fig S3). Dette svarede til en tidligere undersøgelse [37] i vores laboratorium rapporterer, at nedregulering af HSP70 i bugspytkirtelkræft resulterede i celledød ved lysosomal permeabilisering. Dette indikerede, at inhibering af enten HSP70 eller MUC1 resulterede i lysosomal permeabilisering. For at bestemme om denne permeabilisering var direkte relateret til celledød, anvendte vi en celle-permeabelt Cathepsin B-hæmmer (CA-074-Me) og målt levedygtigheden af ​​cellerne i nærvær af en MUC1 inhibitor (fig. 5C). Mens cellernes levedygtighed blev reduceret til næsten 40% af ubehandlede celler i nærvær af GO-201, celler behandlet med CA-074Me sammen med GO-201 blev set at komme sig og viste en levedygtighed på næsten 98% af ubehandlede celler ( fig. 4C). Det blev observeret, at celler behandlet med kun GO-201 viste reduceret vækst og proliferation efter 3 dages behandling, mens dem, som blev behandlet med Cathepsin B-hæmmer viste proliferation og vækst ligner dem af kontrollen. Lignende genoprettelse af rentabiliteten af ​​MiaPaCa-2-celler blev også observeret, når MUC1 ekspression blev inhiberet af siRNA (figur S4). Dette viste, at effekten af ​​GO-201 på Cathepsin B frigivelse kunne vendes ved anvendelse af en Cathepsin B hæmmer (fig. 4D). Dette blev også bekræftet biokemisk, hvor MUC1 siRNA og GO201 begge viste forøget cytosolisk Cathepsin B aktivitet, men behandling med CA-074Me viste en tilbageførsel af denne aktivitet. Dette indikerede, at MUC1 inhibering faktisk ført til lysosomal permeabilisering, hvilket igen udløste indtræden af ​​celledødsveje i disse celler.

Inhibering af MUC1 af siRNA resulterede i lysosomal permeabilisering som manifesteret ved Cathepsin B-frigivelse i cytosolen ( EN). blev observeret Tab af co-lokalisering af Cathepsin B og Lamp2 i MUC1-lyddæmpet celler sammenlignet med ikke-lyddæmpende kontrol. Biokemisk assay for cathepsin B-aktivitet i cytosol viste øget aktivitet i både MUC1 lyddæmpede celler og celler behandlet med GO-201 (B). Den celledød proces induceret af GO-201 blev anholdt på at bruge en Cathepsin B hæmmer CA-O74Me (C). Data er udtrykt som middelværdi +/- SEM for 3 uafhængige eksperimenter. *

P

. 0,05 (

t

test) sammenlignet med kontroller

ortotopisk musemodel for kræft i bugspytkirtlen med AsPC-1 celler viste enorm pancreas tumor i ubehandlede mus (A), mens GO-201 havde meget lidt ingen tumor i deres bugspytkirtel. Reduktion af tumorvægt (C) og volumen (D) blev observeret efter behandling med GO-201. * Repræsenterer p 0,05 sammenlignet med kontroller. Repræsentative vævssnit fra mus med pancreas tumor (ortotopisk model med AsPC1 celler) i kontrolgruppen farvet med Ki-67 viste omfattende farvning indikerer aktivt prolifererende tumorceller (E), i forhold til mindre farvning i GO-201 dias viser tab i proliferation (F). Det totale antal celler farvet med Ki-67 blev talt i mindst 10 felter i begge prøver og det gennemsnitlige antal prolifererende celler i begge sæt blev plottet (G) *

P

.05 (

t

test) sammenlignet med kontroller.

Hæmning af MUC1 ekspression i en

in vivo

musemodel af kræft i bugspytkirtlen Reducerer Tumor Progression

GO -201, et peptid-inhibitor rapporteret at inhibere aktiviteten af ​​MUC1-c, er blevet testet for tumorregression i en række kræftmodeller såsom prostatacancer, brystcancer og CML [46] – [48]. Imidlertid har sin effektivitet ikke er blevet testet i bugspytkirtelkræft modeller. Vi anvendte en orthotopisk pancreascancer musemodel med den aggressive cellelinie AsPC1 at teste effektiviteten af ​​GO-201. Tyve athymiske nu /nu mus blev givet inden for pancreas injektioner på 2 × 10

5-celler. Behandling med intraperitoneal GO-201 (30 mg /kg legemsvægt) blev startet på 10 randomiserede mus, begyndende på dag 4 efter tumorceller injektion. De resterende 10 mus blev injiceret med saltvand. Eksperimentet blev afsluttet på dag 30 efter injektion af cellerne. Musene blev aflivet, og tumoren byrde i begge grupperne blev evalueret. På dag 30, alle saltholdige dyr havde tumorer (n = 10) (fig. 5A) henviser i den behandlede gruppe af n = 10 mus, kun 3 af 10 havde tumorer (fig. 5B). Tumorvægten i den ubehandlede gruppe lå fra 0.6-1.6 g hvorimod de behandlede grupper havde tumorer med en vægt 0,1 g-0,3 g (fig. 5C). Den gennemsnitlige tumorvolumen af ​​musene i saltvand gruppe var 0,9 cm

3 hvorimod de behandlet med GO-201 havde en gennemsnitlig tumorvolumen på 0,1 cm

3 (fig. 5D). Saltvandsgruppen udviste også omfattende metastatisk spredning af tumorer til en række organer (tabel 1). Vævene fra tumorerne blev farvet med Ki-67 at sammenligne proliferationshastigheder i de to grupper. Den ubehandlede gruppe farves grundigt med Ki-67, der viser aktive prolifererende celler (Fig. 5E). Til sammenligning GO-201 behandlede celler farvet meget svagt med Ki-67 (fig. 5F). Dette antydede, at funktionel hæmning af MUC1-c af GO-201 resulterede i signifikant reduktion af tumor byrde i mus.

Diskussion

Heat-chok (HSP) 70 proteiner fungerer som ATP -afhængige chaperoner, der regulerer foldningen af ​​nyan- syntetiserede proteiner, samling af multi-proteinkomplekser og transport af proteiner på tværs af cellemembraner [49]. HSP70 ofte overudtrykkes i maligne tumorer, og denne overekspression er associeret med en dårlig terapeutisk resultat i et antal humane cancere, herunder bryst- og pancreascancer [50], [37], [40], [41]. HSP70 virker stærkt cytobeskyttende virkning og hæmmer apoptotisk signalering ved at inhibere mitokondrisk permeabilisering, ved at reducere caspaseaktivering eller ved at neutralisere apoptoseinducerende faktorer [51]. HSP70 lokaliserer også lysosomal membraner [52], [53] og kan beskytte lysosomale membraner mod LMP induceret af forskellige stimuli, såsom etoposid, TNF-α og oxidativ stress [54]. Vi har tidligere vist, at HSP70 overudtrykkes i bugspytkirtelkræftceller og at dets nedregulering af enten siRNA

in vitro

eller ved anvendelse af en inhibitor

in vivo

inducerer caspaseaktivering og celledød ved apoptose [ ,,,0],37], [42], [55]. Dette antyder, at HSP70 er vigtig for overlevelsen af ​​pankreatiske cancerceller. Der er foreslået mange sandsynlige mekanismer for pro-overlevelse funktion af HSP70.

In vitro

undersøgelser har antydet, at HSP70 kan interferere direkte med apoptose-signalering maskiner nedstrøms for mitokondrier ved at forhindre apoptosome aktivering dannelse og caspase [56]. Nylige undersøgelser under anvendelse af celledød modeller har påpeget, at HSP70-medieret inhibering af caspase-afhængig apoptose forekommer opstrøms for mitokondrisk ydre membran permeabilisering (MOMP) og cytochrom c-frigivelse [57], [58]. Tidligere undersøgelser fra vores gruppe også foreslå, at hæmning af HSP70 udtryk af forskellige inhibitorer eller HSP70 siRNA fører til caspase aktivering og apoptose, hvilket tyder på, at HSP70 hæmmer caspase-afhængig apoptose i bugspytkirtelkræftceller ved at påvirke cytosoliske calcium reserver og forårsager lysosomal permeabilisering. Imidlertid har den molekylære mekanisme af dette fænomen været undvigende [37].

MUC1-c er blevet vist at være et oncoprotein ansvarlig for transformation og tumorigenicitet på en række cancerceller. MUC1-c spiller også en intensiv rolle i cellulær signalering efter en række phosphoryleringsbegivenheder. Flere rapporter viser også en ophobning af MUC1-c i cytosolen af ​​cancerceller. Det er tidligere blevet vist, at MUC1-c associerer med varmechokproteiner og er målrettet til den mitokondriske ydre membran [33], [59]. Således eksisterer en tæt sammenslutning af HSP70 og MUC1 i tumorceller.

I et forsøg på at forstå den molekylære mekanisme for celle overlevelse og den rolle, HSP70 og MUC1 i bugspytkirtelkræftceller, vi kiggede ind i sammenslutningen af ​​HSP70 og MUC1. Eftersom den fremherskende funktion af HSP70 i enhver celle er dens chaperonaktivitet, vi hypotese, at HSP70 virker som en bærer af MUC1-c til forskellige cellulære rum, såsom lysosomer og mitokondrier, hvilket resulterer i beskyttelse af disse rum og forebyggelse af celledød. Vores nuværende undersøgelse viste, at HSP70 var forbundet med MUC1, og at det co-udfældet med MUC1-c (fig. 3A). Den viste også, selvom MUC1-C blev overvejende lokaliseret i cytoplasmaet, en betydelig mængde var også til stede i lysosomerne og mitokondrier (Fig 3 B, C,. Figur S2). Inhibering af MUC1-c ekspression ved siRNA eller en inhibering af aktivitet ved hjælp af peptidinhibitor GO-201 resulterede i nedsat proliferation og levedygtighed bugspytkirtelkræftceller (fig. 2) og induceret caspase-aktivitet i disse celler, hvilket indikerer en aktivering af apoptotiske veje (Figur S1). Denne inhibering forårsaget også lysosomal permeabilisering af bugspytkirtelkræftceller fører til Cathepsin B frigivelse og en høj cytosolisk Cathepsin B-aktivitet (fig. 4B, C). Cathepsin B-ekspression i celler transfekteret med ikke-specifik siRNA viser distinkt farvning i lysosomale rum (figur 4 A). Dette særskilte farvningsmønster ses at blive spredt, når cellerne transficeres med MUC1 siRNA. Det skyldes frigivelsen af ​​Cathepsin B protein i den cytosoliske rum som analyseret biokemisk (figur 4B). Tilsvarende lysosomale permeabilisering blev også observeret, når HSP70-ekspression blev inhiberet af siRNA (Fig S3). Effekten af ​​hæmning af MUC1 ekspression eller aktivitet blev set skal vendes, når cellerne blev co-inkuberet med Cathepsin B hæmmer CA-074Me. Dette viste, at frigivelsen af ​​Cathepsin B fra lysosomerne af bugspytkirtelkræftceller resulterede i at udløse celledød veje. Tidligere rapporter fra vores gruppe, viser, at hæmning af HSP70 af en inhibitor, enten triptolide eller quercetin, resulterede også i lignende lysosomale permeabilisering og apoptotisk celledød [37]. I samme undersøgelse blev det også ses, at en Cathepsin B hæmmer kunne vende virkningerne af HSP70 inhibition på bugspytkirtelkræftceller, hvilket indikerer, at lysosomal permeabilisering er en af ​​de tidligere trin af apoptotisk død i disse celler.

Klassisk, lysosomale membran permeabilisering (LMP) er blevet anset for at være involveret i celledød mekanismer, selvom de nøjagtige sekventielle hændelser fra LMP til celledød ikke er blevet kortlagt. Afhængigt af den dødelige stimulus, omfanget af LMP, mængden og typen af ​​cathepsiner frigives til cytoplasmaet, samt den overflod af cathepsin-inhibitorer, kan LMP udløse en række dødsfald-associerede morfologier spænder fra klassisk apoptose til nekrose. Således LMP forbundet med Cathepsin translokation kan direkte aktivere calpainer og caspaser, men LMP kan også udløse den klassiske MOMP-caspase-vejen, samt MOMP- og caspase-uafhængig apoptose. Hvilke dødelige veje stimuleres af LMP afhænger af celletypen, immortaliseringen status og den genetiske baggrund af cellerne.

I den aktuelle undersøgelse, vi foreslår en model for celleoverlevelse, hvor HSP70 fungerer som en bærer af MUC1-c ved at associere med det fysisk og transporteres til lysosomer (og mitokondrier) i bugspytkirtelkræftceller. Tilstedeværelsen af ​​MUC1-c i lysosomerne forhindrer LMP og holder lysosomerne intakt. Men når HSP70 eller MUC1 inhiberes enten ved siRNA eller af et peptid-inhibitor af MUC1 (som forhindrer aktivitet af MUC1 og dermed dens association med helst andet molekyle), beskyttelse af lysosomer mistes, og der er omfattende LMP, hvilket fører til en frigivelse af Cathepsin B og udløsning af celledød. Hvorvidt induktion af LMP og frigivelse af Cathepsin B aktiverer yderligere apoptotiske veje involverer mitokondrierne skal undersøges yderligere.

Fra et klinisk perspektiv, en mere specifik tilgang i at udnytte MUC1-c-medieret celle overlevelse er at udvikle terapeutiske agenter, der interagerer direkte med MUC1-c og blokerer dens funktion. MUC1-c danner oligomerer gennem CQC aminosyre motiv i sit cytoplasmatiske domæne, og aktivitet er nødvendig for MUC1-C nuklear transport [60], [61]. Peptidet inhibitor GO-201, som indeholder CQC motiv, er blevet designet og testet i en række cancerceller til at blokere oligomerisering af MUC1 og inhiberer således sin signaleringsaktivitet og funktion [18], [46] – [48]. I den aktuelle undersøgelse anvendte vi GO-201 på en orthotopisk pancreascancer musemodel til test dens virkning på pancreatiske tumor. Den aggressive pankreatisk cancercellelinie AsPC1 blev anvendt til dannelse ortotopisk pancreatiske tumorer. GO-201 (30 mg /kg) blev injiceret intraperitonealt hver dag i 26 dage og eksperimenteret blev afsluttet på dag 30. Inhiberingen af ​​MUC1 funktion ved GO-201 blev set at forhindre tumorvækst og progression i behandlingsgruppen signifikant sammenlignet med den ubehandlede gruppe. I tidligere undersøgelser GO-201 har vist sig at være en specifik MUC1 inhibitor, der ikke har nogen virkning på nogen anden end MUC1 [47] protein. Vores tidligere undersøgelser havde vist, at ved hjælp af inhibitorer af HSP70, kunne pancreas tumorer blive svandt

in vivo

[60]. I forlængelse af disse undersøgelser, denne undersøgelse viste også, at hæmning af MUC1

in vivo

kunne formindske tumor byrde i mus, hvilket bekræfter, at MUC1-HSP70 forening er en væsentlig faktor i overlevelse bugspytkirtelkræftceller. Endvidere kunne hæmning af denne forening ved hæmning af enten HSP70 udtryk eller MUC1 aktivitet være af væsentlig terapeutisk værdi i bugspytkirtelkræft

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle procedurer.