PLoS ONE: Den rolle PKR /eIF2α signalvejen i Prognose af ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

I denne undersøgelse har vi undersøgt, om PKR proteinekspression er korreleret med mRNA-niveauer og også evalueret molekylære biomarkører, der er forbundet med PKR, såsom phosphoryleret PKR (p-PKR) og phosphoryleret eIF2α (p-eIF2α).

Metode og Resultater

Vi bestemmes niveauerne af PKR proteinekspression og mRNA i 36 friske primære lunge tumorvæv ved hjælp af Western blot-analyse og tidstro revers-transkriptase PCR (RT-PCR), hhv. Vi anvendte væv microarrays til immunhistokemisk evaluering af ekspressionen af ​​p-PKR og p-eIF2α proteiner. Vi viste, at PKR mRNA-niveauer er signifikant korreleret med PKR protein niveauer (Spearman Rho = 0,55,

s

0,001), hvilket tyder på, at PKR protein niveauer i tumorprøver er reguleret af PKR mRNA. Vi observerede også, at patienter med højt p-PKR eller p-eIF2α udtryk havde en signifikant længere median overlevelse end dem med lidt eller ingen p-PKR eller p-eIF2α udtryk (

s

= 0,03 og

p

= 0,032, henholdsvis). Vi yderligere evalueret den prognostiske effekt af kombineret udtryk for p-PKR plus PKR og p-eIF2α plus PKR og fandt, at begge kombinationer var stærke uafhængige prognostiske markører for generel patient overlevelse på scenen I og alle patienter fase.

Konklusioner

Vores resultater tyder på, at PKR proteinekspression kan styres af transskription niveau. Kombinerede ekspressionsniveauer af PKR og p-PKR eller p-eIF2α kan være nye markører til at forudsige prognosen for patienter med NSCLC

Henvisning:. Han Y, Correa AM, Raso MG, Hofstetter WL, Fang B, Behrens C, et al. (2011) Den rolle PKR /eIF2α signalvejen i Prognose af ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 6 (11): e24855. doi: 10,1371 /journal.pone.0024855

Redaktør: John D. Minna, University of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: Marts 25, 2011; Accepteret: August 22, 2011; Udgivet: November 10, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering: Dette arbejde understøttes delvist af National Institutes of Health gennem MD Andersons Cancer Center Support Grant CA-016.672 – Lung Program, en Specialized. Program for Forskning Excellence (SPORE) Grant CA-070.907 (til IW), og en R01 Grant CA-124.591 (til BF). Yderligere støtte kom fra Department of Defense giver W81XWH-07-1-0306 (til IW), National Natural Science Foundation of China (30.600.611, 81.071.912) (til YH) og “1510 projektet” af Third Military Medical University of China (til YH), og fra Homer Flower Gene Therapy Fund, Charles Rogers Gene Therapy Fund, Margaret Wiess Elkins Begavet Research Fund, Flora og Stuart Mason Lung Cancer Research Fund, den Phalan Thoracic Gene Therapy Fund, og George P. Sweeney Esophageal Research Fund (SS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter. LY er ansat i Ziren Research LLC. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

proteinkinase (PKR) er en interferon-inducerbart serin /threonin-kinase, der medierer proteinsyntese, en tæt reguleret proces, som er kritisk i cellulær proliferation og differentiering [1] – [3]. Forøget PKR-ekspression er blevet vist at korrelere med bedre prognose i hoved- og halscancer og tyktarmskræft [2], [3], og akkumulere beviser viser, at PKR kan virke som en tumorsuppressor i leukæmi og andre hæmatopoietiske maligniteter [4], [ ,,,0],5]. Binding af enten dobbeltstrenget RNA (dsRNA) eller strukturerede enkelt-strengede RNA kan mægle PKR phosphorylering [6], [7]. Aktiveret PKR phosphorylerer sit veldokumenterede nedstrømsmål, alfa-subunit’en af ​​proteinsyntese initieringsfaktor eIF2 (eIF2α), hvilket fører til inhibering af proteinsyntese og fremkalde antivirale og antitumoraktiviteter [8], [9]. Ud over sin rolle i translationel kontrol, er PKR blevet impliceret i antiviral medfødte immunitet, apoptose, celleproliferation og stress signalering [10]. Desuden er PKR-ekspression og autophosphorylering steget i flere typer af cancer, herunder melanom, coloncancer og brystcancer [11], [12]. Resultaterne af flere undersøgelser har vist vigtigheden af ​​phosphoryleret eIF2α (p-eIF2α) i cancerterapi [10], [13], [14]: aktivering af PKR-eIF2a phosphorylering vej er afgørende for de antiproliferative og proapoptotiske funktioner tumorsuppressorgen [15].

for nylig har vi fundet, at lav ekspression af dsRNA-afhængig PKR var signifikant associeret med kortere overlevelse i NSCLC-patienter, hvilket antyder, at biologiske funktioner af PKR eller dens downstream molekyler kunne være værdifulde prognostiske faktorer i NSCLC [1]. I denne nye undersøgelse, vores mål var at undersøge, om PKR proteinekspression er forbundet med dets mRNA-niveauer, og om dens downstream mål, såsom phosphoryleret PKR (p-PKR) og p-eIF2a, er også prognostiske faktorer i NSCLC. Vi først bestemmes niveauer og protein PKR mRNA-ekspression i frisk-frosset NSCLC væv og fandt en positiv korrelation mellem PKR proteinekspression og mRNA-niveauer. Dernæst hjælp immunhistokemisk farvning, undersøgte vi ekspressionen af ​​p-PKR og dens velkarakteriseret nedstrøms molekyle p-eIF2α i arkiverede væv microarray prøver. Vores resultater viser, at p-PKR og p-eIF2α er prædiktive biomarkører for NSCLC resultater, og at når ekspression af PKR blev kombineret med ekspression af p-PKR eller p-eIF2α blev virkningen på forudsige patientoverlevelse forbedret.

Resultater

PKR proteinekspression korrelerer med mRNA niveauer

for at undersøge om PKR proteinekspression er associeret med mRNA-niveauer, vi bestemt PKR og p-PKR protein udtryk og PKR mRNA-niveauer i 36 friske primære lunge tumorvæv ved hjælp af Western blot analyse og real time RT-PCR, hhv. Protein ekspression af β-actin og dets mRNA niveauer blev også bestemt og anvendt som kontroller. Resultaterne af de Western blotting-analyser viste, at tumorprøver udtrykte forskellige niveauer af PKR ved både protein og mRNA-niveauer (figur 1A og 1B). Statistisk analyse viste en signifikant korrelation mellem PKR proteinekspression og dets mRNA-niveauer. (Spearman Rho = 0,55,

s

0,001; Figur 1C). Disse resultater tyder på, at PKR genekspression kan medføre for de forskellige niveauer af PKR protein-ekspression i tumorer.

A. Western blot analyse af PKR og p-PKR-proteinet i tumorprøver. En densitometrisk analyse af forholdet mellem PKR eller PKR til p-actin er repræsenterer normaliserede proteinniveauer. Hver bane repræsenterer en tumor prøve fra en individuel patient. B. mRNA niveauer af tilsvarende prøver blev bestemt under anvendelse af kvantitativ realtids-PCR. Niveauer af β-actin-protein og dets mRNA af den samme prøve blev anvendt som kontroller. C. Scatter plot af PKR proteinekspression korreleret med mRNA-ekspression (Spearman Rho = 0,55,

s

0,001).

Sammenhæng mellem p-PKR og p-eIF2α proteinekspression i NSCLC-tumorer med clinicopathologic features

Fordi den biologiske funktion af PKR er tæt forbundet med dens phosphorylering, og eIF2α phosphorylering er kendetegnende for PKR-aktivering, vi næste evaluerede ekspressionen af ​​p-PKR og p-eIF2α proteiner i TMA prøver vha immunhistokemisk farvning. Tabel 1 opsummerer forholdet mellem p-PKR eller p-eIF2α udtryk og andre clinicopathologic funktioner. Høj p-PKR-ekspression var forbundet med adenokarcinomer undertype (

s

0,001). Ingen korrelation blev observeret mellem p-PKR udtryk og køn sex, TNM stadie, eller rygning status. Vi fandt heller ikke nogen korrelation mellem p-eIF2α ekspression og clinicopathologic features. Repræsentative billeder af immunohistokemisk farvning resultater for p-PKR og p-eIF2α er vist i figur 2. p-PKR og p-eIF2α proteiner blev udtrykt i cytoplasmaet af tumorceller.

High-udtrykkende tilfælde (A og C). Lav-udtrykkende tilfælde (B og D). Ekspression af p-PKR og p-eIF2α blev påvist i cytoplasmaet.

Sammenhæng mellem p-PKR og p-eIF2α proteinekspression i NSCLC tumorer med sygdom resultater

for yderligere at vurdere, om p-PKR eller p-eIF2α proteinekspression korrelerer med kliniske resultater hos patienter med NSCLC, afslørede Kaplan-Meier analyse, der for trin i og alle faser, patienter med relativt forhøjede p-PKR havde signifikant længere overlevelse end dem med lidt eller ingen p-PKR-ekspression (figur 3A og 3C). For alle patienter fase, den mediane overlevelse var 105 måneder for patienter med højt p-PKR udtryk og 51 måneder for dem med lidt eller ingen p-PKR udtryk. En signifikant association blev også observeret mellem høj p-eIF2α proteinekspression og længere overlevelse på trin I og alle stadier (figur 3D og 3F). Der er ingen signifikant sammenhæng blev observeret mellem høj p-PKR eller høj p-eIF2α proteinekspression og længere overlevelse på trin II-IV (figur 3B og 3E).

A-F. Kaplan-Meier-overlevelseskurver ifølge forskellene i (A, B, C) p-PKR og (D, E, F) p-eIF2-α ekspression i patienter med stadium I (A, D), stadium II-IV ( B, E) og alle trin (C, F) NSCLC. De overlevelsesrater var betydeligt værre i patienter med lavt p-PKR eller p-eIF2α udtryk end i dem med høj p-PKR eller p-eIF2α udtryk (Fase I:

s

= 0,01 og

s

= 0,02; Alle faser:.

p

= 0,03 og

p

= 0,03, henholdsvis)

i en univariat analyse, en Cox proportionel risiko model viste, at p-PKR og p-eIF2α havde prognostisk signifikans (tabel 2). I en multivariat analyse, fandt vi, at p-PKR og p-eIF2α udtryk var statistisk signifikante forbundet med overlevelse (Tabel 2). Disse resultater indikerer, at p-PKR og p-eIF2α udtryk er selvstændige biomarkører for patienternes overlevelse.

Vi undersøgte også foreningerne mellem ekspressionsniveauerne af PKR, p-PKR, og p-eIF2α. Vores resultater viste, at p-PKR udtryk signifikant korreleret med p-eIF2a udtryk (Spearman Rho = 0,48,

s

0,001). PKR udtryk også signifikant korreleret med udtryk for p-PKR (Spearman Rho = 0,31,

s

= 0,004) og p-eIF2α (Spearman Rho = 0,45,

s

0,001). Vi yderligere evalueret den prognostiske effekt af kombineret udtryk for p-PKR plus PKR og p-eIF2α plus PKR og fandt, at begge kombinationer var stærke uafhængige prognostiske markører for generel patient overlevelse på scenen I (figur 4A og 4B), og alle patienter fase (figur 4C og 4D). For alle patienter stage, patienter med forhøjet PKR og høj p-PKR-ekspression havde en median overlevelsestid på 132 måneder, hvilket var signifikant længere end for patienter med høj PKR og lav p-PKR-ekspression (median overlevelse, 80 måneder; Figur 4C ). Patienter med ringe eller ingen PKR og p-PKR-ekspression havde en signifikant kortere median overlevelse (43 måneder, figur 4C). Der er en forskel i resultatet for PKR (H) /p-PKR (H) vs PKR (L) /p-PKR (H) patienter i figur 4A. Vores IHC score sortiment er 0-300 for PKR og p-PKR. I aktuelle undersøgelse, bruger vi median cut-off (150 for PKR og 70 for p-PKR). På figur 4A, 106 stadie I-patienter inddelt i fire grupper, 43 patienter med høj PKR og høj p-PKR, 21 patienter med forhøjet PKR og lav p-PKR udtryk, 32 Patienter med lav PKR og p-PKR udtryk og 10 patienter med lav PKR og høj p-PKR-ekspression. Disse 10 patienter har p-PKR score 80-120, er meget tæt på median cut-off score (70), og kan også tilhøre lav PKR lav p-PKR gruppe. For alle patienter stadie, patienter med forhøjet PKR og høj p-eIF2α udtryk havde en median overlevelsestid på 132 måneder, hvilket var betydeligt længere end for patienter med høj PKR plus lav p-eIF2α udtryk (median overlevelse, 80 måneder), og dem med lav PKR plus høj p-eIF2α ekspression (median overlevelse, 47 måneder; Figur 4D). Endelig patienter med ringe eller ingen ekspression af både PKR og p-eIF2α havde en signifikant kort median overlevelse (median overlevelse, 35 måneder, figur 4D).

A og C. Survival var signifikant lavere hos patienter med lav PKR eller lav p-PKR udtryk end i dem med høj PKR eller høj p-PKR udtryk på scenen i (A) og alle stadier (C) (

s

= 0,001 og

s

= 0,001, henholdsvis). B og D. Survival sats var også signifikant lavere hos patienter med lavt PKR eller lav p-eIF2α udtryk end i dem med høj PKR eller høj p-eIF2α udtryk på scenen I (B) og alle stadier (D) (

s

= 0,001 og

s

= 0,001, henholdsvis).

diskussion

resultaterne af denne undersøgelse viser, at PKR mRNA-niveauer er forbundet med PKR protein udtryk i primære NSCLC tumorer. Vores resultater antyder, at PKR-protein ekspression kan styre transskriptionsniveauer. Endvidere vore data antyder, at real time RT-PCR, en følsom fremgangsmåde til kvantitativ analyse mRNA-niveauer, kan anvendes til at bestemme mRNA-niveauer i biopsiprøver og kunne derfor være nyttig til at forudsige patientoverlevelse. Vi fandt også, at patienter med høj p-PKR-ekspression havde betydeligt længere overlevelse end dem med lidt eller ingen p-PKR proteinekspression. Resultater af forskellige undersøgelser af humane maligniteter har antydet, at høj PKR-ekspression indikerer gunstig prognose for patienter med pladecellecarcinom i hoved eller lever [2], [16], hvilket antyder, at PKR kan spille en vigtig rolle i at undertrykke tumor progression og påvirker apoptose [17]. Vi har også studeret PKR veje og har fundet dem til at være klart nødvendigt for at inducere apoptose i nogle kræftceller, herunder lungekræft, efter visse behandlinger såsom melanom differentiering-associeret gen 7 (

mda7

), E2F-1 og TNFa [18], [19]. For nylig, vi og andre viste, at nogle små forbindelser kan fremkalde PKR-afhængig apoptose i både kræftceller og murine embryonale fibroblaster [20], [21], hvilket indikerer, at modulere PKR aktivitet kunne være en interessant tilgang til kræftbehandling. Vores fund, at NSCLC-tumorceller, der udtrykker et højt niveau af p-PKR korrelerer med god prognose er konsistent med tidligere iagttagelser, at PKR-aktivering er forbundet med apoptose induktion.

Vores resultater viste også, at patienter med høj ekspression af både PKR og p-PKR havde signifikant længere overlevelse end gjorde dem med andre kombinationer af ekspressionsniveauer, herunder positive for PKR og negative for p-PKR og dem negative for både PKR og p-PKR. Vores observation, at 53% af NSCLC tumorprøver højt udtrykt PKR og at 61% af dem stærkt udtrykte p-PKR [data ikke vist] Disse resultater førte os til at spekulere, at PKR-ekspression (dvs. PKR) og PKR-aktivering (dvs. p -PKR) rammes af forskellig ekspression af PKR aktivator eller PKR-inhibitor. Andre forskere har rapporteret, at funktionen af ​​PKR kan reguleres ved cellulære proteiner enten positivt (f.eks MDA-7 /interleukin-24 og PKR-aktiverende protein [PACT]) eller negativt (f.eks p58IPK, nucleophosmin og varmechokproteiner 90 og 70) [18], [19]. I fremtidige studier, vil vi forsøge at afgøre, hvilke PKR aktivatorer og inhibitorer påvirker PKR signalvejen i NSCLC tumorprøver.

Vi observerede, at tumorer med høj p-eIF2α udtryk havde en signifikant længere median overlevelse. I yderligere, viste vi, at patienter med høje udtryk for både PKR og p-eIF2α havde også signifikant længere overlevelse end gjorde dem med andre kombinationer af ekspressionsniveauerne. Vores konklusion om, at 47% af tumor prøver havde lav PKR udtryk og 27% havde høj p-eIF2α udtryk [data ikke vist]. Disse resultater antyder, at eIF2α phosphorylering i nogle NSCLC-tumorer forekommer uafhængigt af PKR-vejen. Udover PKR, har tre forskellige eIF2α kinaser, der kan phosphorylerer eIF2α som reaktion på forskellige stress betingelser blevet identificeret: hæm-reguleret hæmmer, homolog af

Saccharomyces cerevisiae

proteinkinase generel kontrol ikke-derepressible-2, og RNA- afhængige-protein-kinase-lignende endoplasmatiske reticulum (ER) kinase (PERK; også kendt som pancreas eIF2α kinase) [13]

som konklusion vore data tyder på, at PKR /phosphoryleret PKR /phosphorylerede eIF2α signalvejen. spiller en vigtig rolle i prognosen for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). PKR pathway aktiviteter kan være nyttige til at forudsige NSCLC udfald, og modulerende PKR pathway aktiviteter kunne være en potentiel NSCLC behandlingsmulighed.

Metoder

Patienter og væv

NSCLC patienter, der var undergår radikal resektion af deres primære kræft på The University of Texas MD Anderson cancer center mellem 2007 og 2008 blev anvendt til denne undersøgelse baseret på tilgængelighed. Patienter blev udelukket fra undersøgelsen, hvis de tidligere havde gennemgået strålebehandling eller kemoterapi for kræft. Patienter alle forudsat skriftligt informeret samtykke til brug af deres væv, og undersøgelsen blev godkendt af vores Institutional Review Board (University of Texas, MD Anderson Cancer Center). Efter at være blevet kirurgisk resektion blev hver frisk tumor straks delt i to portioner; on blev øjeblikkeligt frosset og opbevaret i flydende nitrogen i protein og RNA-ekstraktion, og den anden blev fikseret med formalin og indlejret i paraffin til rutinemæssig histopatologisk evaluering og diagnosticering. Væv med et beregnet indhold på 70% eller derover tumorcelle blev anvendt til molekylære analyser. Ud over vores patienters væv, opnåede vi 193 NSCLC Tissue microarray (TMA) prøver (114 adenocarcinomer, og 74 planocellulært karcinom) mellem 1997 og 2001 fra lungekræft Specialized Program for Forskning Excellence Tissue Bank på MD Anderson Cancer Center (Houston , TX). Alle prøver blev histologisk undersøgt og klassificeret ved hjælp af 2004 World Health Organization klassifikationssystem [22]. I de fleste tilfælde, detaljeret klinisk og patologisk information, herunder patienternes demografiske data, rygevaner og samlet overlevelse plus sygdommen TNM mellemstationer og tid til tilbagefald, var til rådighed (tabel 1).

Western blot analyse

Frosne tumorvæv blev indledningsvis preparared ved at blive vasket to gange i kold PBS. Ca. 20 mg væv fra hver frisk prøve blev homogeniseret i 0,5 ml iskold lysepuffer (1% NP40, 50 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, 100 mM NaF, 1 mM EGTA, 1 mM Na

3VO

4, 10% glycerol og 10 mM Na-pyrophosphat [Roche Applied Science]), der indeholder frisk tilsat protease og phosphat inhibitor. Lysaterne blev centrifugeret ved 14.000 g i en mikrocentrifuge ved 4 ° C i 10 minutter, og de resulterende supernatanter blev anvendt som vævsekstrakter. Ekstrakterne, svarende til 60 ug af det totale protein, blev adskilt ved anvendelse af en 10% SDS-polyacrylamidgel og derefter overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev blokeret med TBS indeholdende 5% fedtfri tørmælk og derefter probet i PBS indeholdende 5% bovint serum. Følgende antistoffer blev anvendt: kanin anti-PKR (K-17; Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-p-PKR (pT446) (Epitomics), kanin-anti-p-eIF2a (Epitomics), og muse-anti-β-actin (Sigma). Immunoreaktive bånd blev påvist og kvantificeret ved hjælp af en Li-Cor Odyssey infrarød billeddannelse system.

Reverse Transcription og Real-time Absolute Quantitative Reverse-Transskription-Polymerase Chain Reaction (Real-Time AqRT-PCR)

det totale RNA (1 ug) fra hver frossen klinisk prøve blev ekstraheret ved anvendelse af et Trizol ekstraktion kit (Invitrogen) og revers transkriberet i et 20 pi reaktionsvolumen ved anvendelse af Taqman reverse transskriptionsprodukter reagenser (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. CDNA’erne blev fortyndet og kvantificeret for ekspression PKR ved hjælp af real-time RT-PCR (SYBR Green I) (udført af Ziren Research LLC, Irvine, CA). En enkelt standard blev inkorporeret for at bestemme den absolutte forhold af ekspression af hvert mål og reference-genet, som tidligere beskrevet [23]. De primer sekvenser for PKR var som følger: fremad, 5′-TCTTCATGTATGTGACACTGC-3 ‘, og omvendt, 5′-CACACAGTCAAGGTCCTT AG-3’

immunhistokemisk farvning og evaluering

Antistofferne bruges. for Western blot-analyse blev også anvendt til immunhistokemisk farvning. Formalin-fikserede og paraffin-embedded tissue histologiske sektioner (5-um tyk) blev afparaffiniseret, hydreret og opvarmet i en damper i 10 minutter med 10 mmol /l natriumcitrat (pH 6,0) for antigen hentning. Peroxidase blev blokeret med 3% H

2O

2 i methanol ved stuetemperatur i 15 minutter, efterfulgt af inkubation i 10% bovint serumalbumin i TBS-t i 30 minutter. Objektglassene blev næste inkuberet med primært antistof ved 1:100 fortyndinger i 65 minutter ved stuetemperatur. Efter at være blevet vasket med PBS blev objektglassene inkuberet med biotin-mærket sekundært antistof i 30 min. Endelig blev prøverne inkuberet med streptavidin-peroxidase ved en 1:40 fortynding i 30 minutter. Prøverne blev derefter farvet med 0,05% 3 ‘, 3-diaminobenzidintetrahydrochlorid fremstillet i 0,05 mol /l Tris-buffer (pH 7,6) indeholdende 0,02% H

2O

2 og efterfølgende modfarvet med hematoxylin. Som en positiv kontrol blev formalinfikserede og paraffinindlejrede lungevæv med normale bronchiale epitel anvendes. Som en negativ kontrol blev vævsprøver der ikke er inkuberet med det primære antistof anvendes. Immunohistokemisk farvning blev kvantificeret af to uafhængige patologer (Drs. Raso og Pataer) med en fire-værdi intensitet score tidligere beskrevet [1].

Statistisk analyse

Den mediane blev brugt som cutoff point for p-PKR og p-eIF2a. De biomarkører blev dikotomiseret i lav- og grupper på højt niveau som følger: p-PKR: lav (score≤70), høj (score 70); og p-eIF2a: lav (score≤150), høj (score 150). I univariat analyse, uafhængig prøve

t

og

X

2

tests blev anvendt til at analysere kontinuerte og kategoriske variabler, henholdsvis. Overlevelsessandsynligheden som funktion af tid blev beregnet ved anvendelse af Kaplan-Meier estimator. Af log-rank testen blev anvendt til mellem-gruppe sammenligninger af patientens overlevelsestid. Den Cox proportionel risiko model blev brugt til at beregne indflydelsen af ​​p-PKR og p-eIF2a udtryk på overlevelse tid, med justeringer for kliniske og histopatologiske parametre (alder, køn, rygning status og tumor histologisk undergruppe. De to-sidet test var bruges til at teste lige forhold mellem grupperne i to-vejs kontingenstabeller Den generaliserede estimering ligning fremgangsmåde blev anvendt til at estimere forskelle i midler til de data, Statistisk signifikans blev sat til P … 0.05

Tak

Vi takker Markeda Wade til redaktionel gennemgang. Vi takker Denise M. Woods og Lakshimi Kakarala for deres tekniske assistance.