PLoS ONE: miR-17-5p Nedregulering Bidrager til Paclitaxel Resistance of Lung Cancer Cells gennem at ændre Beclin1 Expression

Abstrakt

Ikke små celle lungekræft (NSCLC) er en af ​​de mest førende årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Paclitaxel baserede kombinationsterapier har længe været anvendt som en standard behandling i aggressive NSCLCs. Men paclitaxel modstand har vist sig som et stort klinisk problem i bekæmpelsen ikke-småcellet lungekræft og autofagi er en af ​​de vigtige mekanismer involveret i dette fænomen. I denne undersøgelse anvendte vi microRNA (miRNA) arrays til at screene differentielt udtrykte miRNA mellem paclitaxel sensitive lungecancerceller A549 og dets paclitaxel-resistente celle variant (A549-T24). Vi identificerede miR-17-5p var en af ​​mest markant nedreguleret miRNA i paclitaxel-resistente lunge kræftceller sammenlignet med paclitaxel sensitive forældrenes celler. Vi fandt, at overekspression af MIR-17-5p sensibiliseret paclitaxel resistente lungecancerceller til paclitaxel inducerede apoptotisk celledød. Desuden er der i denne rapport, vi demonstreret, at MIR-17-5p direkte binder til 3′-UTR af beclin 1-genet, et af de vigtigste autofagi modulator. Overekspression af miR-17-5p i paclitaxel resistente lunge kræftceller reduceret beclin1 udtryk og en samstemmende død i cellulær autofagi. Vi observerede også lignende resultater i en anden paclitaxel resistent lung adenosquamøst carcinomceller (H596-TXR). Vores resultater viste, at paclitaxel modstand for lungekræft er associeret med nedregulering af miR-17-5p udtryk, som kan forårsage opregulering af BECN1 udtryk

Henvisning:. Chatterjee A, Chattopadhyay D, Chakrabarti G (2014) miR-17 -5p Nedregulering Bidrager til Paclitaxel Resistance of Lung Cancer Cells gennem at ændre Beclin1 Expression. PLoS ONE 9 (4): e95716. doi: 10,1371 /journal.pone.0095716

Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Frankrig

Modtaget: December 2, 2013; Accepteret: 29 2014 Udgivet: 22 April, 2014

Copyright: © 2014 Chatterjee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af en bevilling fra Institut for Bioteknologi, Govt. Indien (nr BT /PR12889 /AGR /36/624/2009) til GC. AC blev støttet af et stipendium fra samme tilskud, og efterfølgende et stipendium fra DST- PURSE program, University of Calcutta. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige maligne lidelser og en af ​​de førende årsager til kræft dødsfald i denne verden. Næsten 85% af lungekræft tilfælde tilhører ikke-små-cellet lungekræft (NSCLC) [1]. Paclitaxel baserede kombination kemoterapier nu været betragtet som standardbehandling for næsten alle patienter diagnosticeret med NSCLC [2]. Paclitaxel binder til β- underenhed af α- β tubulin heterodimer, stabiliserer mikrotubulus, reducerer dets dynamik i henseende i mitosespindelen, forårsager G

2 /M cellecyklusstandsning og driver cancercellerne til apoptotisk død, aktivering spindle- mitotisk kontrol punkt [3]. Desværre er den kliniske affektivitet af paclitaxel begrænset, fordi nogle tumorer viser resistens eller bliver resistente over for det efter gentagne cykler af paclitaxel kemoterapi som i sidste ende fører til tilbagefald og dårlig prognose. De mest indberettede mekanismer paclitaxel modstand involverer opregulering af P-glycoprotein og relaterede stof effluxpumper [4], [5], utilstrækkelig interaktion med spindel mikrotubuli skyldes posttranslationel modifikation eller ændret udtryk af tubulin isotyper og mikrotubulus-associerede proteiner [6] – [8] eller funktionel ændring i cellesignalering og celleoverlevelsesforløb [9] – [12]. Nylige undersøgelser viser, at autophagic induktion med paclitaxel spiller en stor rolle i udviklingen af ​​paclitaxel resistens i tumorceller [13] – [15] Salg

MikroRNA’er, en særdeles konserveret familie af små, ikke-kodende RNA’er, som for nylig. opstod som en ny klasse af genekspression modulatorer på posttranskriptionel plan [16] – [18]. Dette sker gennem perfekt eller ufuldkommen baseparring på elementer miRNA anerkendelse (MRE’er) inden for 3 ‘utranslaterede region (UTR) af target mRNA, hvilket resulterer i mRNA destabilisering og translationel undertrykkelse [16], [19], [20]. Afvigende miRNA udtryk er ofte blevet observeret i forskellige menneskelige kræftformer, herunder NSCLC [21], [22]. I de senere år er der blevet gjort forsøg på at korrelere dysregulering af særlig miRNA ekspression med tumormodtagelighed til kemoterapi, herunder paclitaxel [13], [23] – [26].

I denne undersøgelse var vi interesseret i at undersøge rolle miRNA i udviklingen af ​​paclitaxel resistens i lungecancerceller relateret til autofagi. Vi udførte miRNA arrays at screene differentielt udtrykte miRNA mellem paclitaxel- følsom (A549) og paclitaxel- resistente lungekræft celler (A549-T24). Vi identificerede, at miR-17-5p blev nedreguleret i paclitaxel resistente lungekræft celler (A549-T24 og H596-TXR) og dets overekspression fremme paclitaxel induceret cytotoksicitet og apoptose. Desuden viste vores data, at beclin1, en af ​​de mest vigtige regulatorer af cellulære autophagy, var et direkte mål for miR-17-5p i lunge kræftceller.

tilsammen alle resultaterne vi har indgået, at miR-17 -5p spillet en afgørende rolle i udviklingen af ​​paclitaxel resistens ved at regulere cellulære autofagi. Undertrykkelse af ekspressionen af ​​miR-17-5p var forbundet med opregulering af beclin1 udtryk og overensstemmende autofagi som spillede en cyto-beskyttende rolle og beskyttet cellerne fra paclitaxel induceret apoptose og celledød.

Materialer og metoder

Materialer Salg

Nutrient blanding Dulbeccos modificerede Eagles medium (suppleret med 1 mM L-glutamin), føtalt bovint serum, penicillin-streptomycin, amphotericin B og 0,25% trypsin-EDTA blev indkøbt fra GIBCO (Invitrogen) . Paclitaxel blev indkøbt fra Sigma, USA. AnnexinV-FITC apoptose kit var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californien, USA). JC-1 og H2-DCFDA blev indkøbt fra Sigma, USA. Bradford protein estimering kit blev købt fra Genei, Indien. Alle andre kemikalier og reagenser var af analytisk kvalitet og blev erhvervet fra Sisco Research Laboratories, Indien.

Cell Line og cellekultur

humane ikke-små lunge epitel adenocarcinomacellelinie type II, A549, blev opnået fra cellen repository af Nationalt Center for Cell Science (NCC’erne), Pune, Indien. Human lunge adenosquamøst carcinom cellelinie NCI-H596 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Både cellerne blev præget af mt-rDNA sekventering til identifikation arter, kort tandem repeat profilering og isoenzym analyse for cellelinie autentificering og blev bekræftet at være negativ for mycoplasma forurening med lageret. Både A549 og H596 celler blev selekteret for resistens over for paclitaxel (Sigma, USA) på en trinvis måde i det væsentlige som beskrevet [27], [28]. Kort fortalt blev A549-celler udsættes først for 2 nM af paclitaxel og når normal vækst blev opnået lægemidlet dosis blev øget i multipla af to, indtil en endelig koncentration på 24 nM paclitaxel (A549-T24) var nået. For NCI-H596-celler, som var lidt tolerant over for paclitaxel, var først eksponeres 5 nM paclitaxel og holdt ved denne koncentration indtil normal vækst var nået. Derefter lægemiddeldosis var forøget i multipla af tre indtil en endelig dosis på 15 nM paclitaxel (H596-TXR) blev opnået. Begge celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 1 mM L-glutamin, 10% dødelig bovint serum, 3,7 g /l NaHCO

3, 100 ug /ml hver af penicillin og streptomycin og 2,5 ug /ml amphotericin B. Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2. Celler blev dyrket op 70-80% sammenflydning i vævskulturkolber, derefter trypsiniseret med 0,25% trypsin- EDTA og opdeles i efterfølgende dyrkningsplader efter behov.

miRNA Micro Array Expression Analysis

miRNA profilering af A549 og A549-T24-celler blev udført fra Exiqon (Vedbæk, Danmark). Totalt RNA herunder miRNA blev ekstraheret fra A549 og A549-T24-celler ved anvendelse Qiagen miRNeasy mini kit ved at følge fabrikantens protokol. De samlede RNA-prøver har tilstrækkelig kvalitet til analyse af miRCURY LNA miRNA microarray platform var mærket ved hjælp af miRCURY LNA microRNA Hi-Power Mærkning Kit, Hy3 /hY5 og par af prøven blev hybridiseret på miRCURY LNA microRNA Array (6th generation – HSA, MMU RNO) og array blev læst i Agilent G2505B Micro-array scanner-system i en ozon frit miljø. Kun de miRNA som blev dysreguleret af mindst to gange (ΔLMR ≥2) blev taget i betragtning.

Pre- miRNA transfektion

Mirvana miRNA 17 efterligne forstadier (pre-miR-17-5p ) og Mirvana miRNA mimic negativ kontrol # 1 (præ-mIR-negativ kontrol) blev indkøbt fra Ambion. Pre-miRNA blev transficeret ind i cellelinjer på -50% sammenløb ved 100 nM koncentration med Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) transfektion reagens. Otteogfyrre timer efter transfektion blev ekspressionen af ​​miR-17-5p opdaget af real-time PCR og udtryk for BECN1 blev testet ved QRT-PCR og /eller Western blotting.

kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)

i miRNA ekspressionsanalyse, blev QRT-PCR udført ved anvendelse af TaqMan microRNA revers transkription kit (Applied Biosystems) og TaqMan microRNA assays kit (Applied Biosystems) ifølge producentens protokoller. U6 snRNA tjente som intern kontrol.

For at analysere ekspressionen af ​​BECN1, Bax, Bcl-2, LC3-II og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) og caspase-3 (tabel 1), cDNA’er blev syntetiseret fra 1 pg totalt RNA ved anvendelse af SuperScript Vilo cDNA Synthesis kit (Invitrogen). CDNA’et blev blandet med 2 x dynamo ColorFlash SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific) og forskellige sæt af gen-specifikke primere og derefter underkastet QRT-PCR kvantificering under anvendelse af StepOne- Plus real time PCR-system (Applied Biosystems). Genekspression blev beregnet i forhold til GAPDH (for BECN1, Bcl-2, Bax, LC3-II, caspase-3 osv) eller U6 snRNA (for MIR-17-5p) ved hjælp af sammenlignende cyklustid (Ct) metode (2

-ΔΔCt metode) [29], [30].

Cell Proliferation inhiberingsassay (MTT Assay)

A549-T24 og H596-TXR celler, enten transficeret med 100 nM præ-mIR-17-5p (T24-mIR-17-5p og TXR-mIR-17-5p henholdsvis) eller med 100 nM pre-mIR-negativ kontrol-RNA (T24-mIR-NC og TXR-mIR-NC henholdsvis) blev udpladet i 96-brønds dyrkningsplader (1 x 10

4 celler per brønd). Efter 24 timers inkubation blev medierne erstattet med frisk medium, og cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af paclitaxel i yderligere 24 timer. MTT (5 mg /ml) opløst i PBS og filtersteriliseres, derefter 20 pi af den fremstillede opløsning blev tilsat til hver brønd. Dette blev inkuberet indtil lilla bundfald var synligt. Efterfølgende 100 pi Triton-X100 sattes til hver brønd og inkuberet i mørke i 2 timer ved stuetemperatur. Absorbansen blev målt på en ELISA-læser (MultiskanEX, Lab systemer, Helsinki, Finland) ved en test bølgelængde på 570 nm og en referencebølgelængde på 650 nm. Data blev beregnet som en procentdel af hæmning ved følgende formel: (1).

A

t og A

s angivet absorbansen af ​​test stoffer og kontrol opløsningsmiddel, henholdsvis [31]

trypanblåt udelukkelse assay for cellelevedygtighed

trypanblå eksklusion assay [32] blev anvendt til at bestemme antallet af levedygtige og døde celler efter forud mIR-17-5p transfektion og efterfølgende paclitaxel behandling. Kort fortalt blev T24-MIR-17-5p eller T24-MIR-NC-celler udpladet i 6-brønds dyrkningsplader (5 x 10

4 celler per brønd). Derefter blev cellerne behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i yderligere 24 timer. Efter 24 timer blev cellerne høstet ved trypsinisering, vasket to gange med 1X PBS og derefter farvet med 0,4% trypanblåt i PBS. Celler blev derefter fremstillet til analyse ved flowcytometri.

Konstruktion af luciferase reporterkonstruktioner og luciferaseaktivitet Assay

3’UTR-luciferasereporter konstruktioner indeholdende 3’UTR af BECN1 med eller uden miR -17-5p bindingssted blev PCR amplificeret fra de samlede cDNA’er fremstillet fra totalt RNA opnået fra A549-T24-celler. PCR-produkterne blev klonet ind

pCI-neo-RL-luc

reporter vektor (En generøs gave fra Dr. SN Bhattacharyya, IICB, Kolkata, Indien.) Mellem

Xba

I og

Ikke

restriktionssteder, umiddelbart nedstrøms for renilla luciferasegenet. Alle luciferase konstruktioner sekvens verificeres. Celler blev forbigående samarbejdede transficeret med renilla luciferase reporter plasmider (

pCI-neo-RL-Bec-3

‘

UTR-vægt

eller

pCI-neo-RL-Bec-3

‘

UTR-mut

), ildflueluciferase plasmid (

pGL3-FF

) og præ-miR-17-5p forløber og /eller anti-miR-17-5p eller præ -miR-negativ kontrol precursor RNA ved anvendelse lipofectamin 2000 transfektionsreagens efter fabrikantens protokol. Efter 48 timers transfektion blev cellerne høstet og lyseret med passiv lysepuffer (Promega). Luciferaseaktiviteterne i celleekstrakterne blev bestemt ved anvendelse af Promega dual luciferase reporter assay kit på en VICTOR X3 Plate Reader-systemet (PerkinElmer). De relative luciferaseaktiviteter blev beregnet ved forholdet Renilla luc /Firefly luc aktivitet og normaliseret med den for kontrolcellerne og fold repression blev beregnet. pGL3-FF vektor blev anvendt som den interne kontrol.

Påvisning af Surt vesikulær organeller (AVOS)

At observere reduktionen i Avos dannelse, T24-miR-17-5p og T24-miR -Nc celler blev podet på dækglas. Efter 48 timers transfektion blev cellerne farvet med acridinorange (AO) (1 ug /ml) ved 37 ° C i mørke i 15 minutter, derefter vasket to gange med PBS. Billeder af AO farvning blev visualiseret straks med fluorescens mikroskop (OLYMPUS IX70, Japan). Den cytoplasmaet og kernen af ​​farvede celler fluorescerede lysegrønne, mens de sure autophagic vakuoler fluorescerede lyse rødt. Lignende forsøg blev også udført med A549 celler.

For at kvantificere ændringen i antallet af sure vesikler (AVOS) i A549, T24-miR-NC og T24-miR-17-5p celler, blev de farvet med AO (1 ug /ml) i PBS ved 37 ° C i 15 minutter, blev cellerne høstet, vasket to gange i PBS og resuspenderet i 500 pi PBS og analyseres derefter straks ved flowcytometri assay. Den flowcytometriske data blev analyseret med CellQuest analysesoftware (Becton Dickinson) [33].

Mærkning af Autophagic vakuoler med monodansylcadaverin

A549-T24-celler blev transficeret med enten præ-MIR-17- 5p (100 nM) eller med præ-miR- negativ kontrol-RNA (100 nM), podet på dækglas og holdes i yderligere 48 timer. Celler blev inkuberet med 50 pM monodansylcadaverin i 10 minutter ved 37 ° C i PBS og billeder blev taget ved fluorescens mikroskop (Olympus IX70, Japan). Desuden til kvantitativ analyse af autophagosome dannelse samme prøver blev trypsiniseret og analyseret ved flowcytometri assay [34].

flowcytometrianalyse for apoptotiske celler

T24-miR-NC og T24-miR- 17-5p celler blev behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer. Ca. 1 x 10

5-celler blev derefter farvet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke med FITC-konjugeret annexinV (1 ug /ml) og propidiumiodid (PI) (0,5 ug /ml) i en Ca

2 + beriget bindingsbuffer og analyseret ved en tofarvet flowcytometrisk assay. blev detekteret AnnexinV og PI-udledningen i FL1 og FL2 kanaler af en FACSCalibur flowcytometer (Becton-Dickinson, USA) henholdsvis [31]. Data blev analyseret ved hjælp af CellQuest program fra Becton-Dickinson.

Bestemmelse af mitokondrie membranpotentiale (ΔΨ)

At evaluere mitokondriemembranen potentiale (ΔΨ), 5,5 ‘, 6,6 ‘-tetrachloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid (JC-1), en følsom fluorescerende probe til ΔΨ blev anvendt [35]. T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p celler blev behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer. Celler blev derefter høstet, vasket to gange med PBS, farvet med 5 uM JC-1 i 30 minutter ved 37 ° C i mørke. Celler blev skyllet med PBS to gange, resuspenderet i 500 pi PBS og øjeblikkeligt vurderet for rød fluorescens (JC-1) med FACSCalibur flowcytometer (Becton-Dickinson, USA).

Måling af reaktive oxygenarter (ROS)

ROS niveauer blev bestemt ved anvendelse af fluorescerende markør 2 ‘, 7’dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) [36]. Kort fortalt blev T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p celler behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer. Celler blev trypsinbehandlet, vasket med PBS og inkuberet med 10 mM DCFH-DA i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur, og skift i grøn fluorescens intensitet, som påvist i FL1-kanalen, blev efterfulgt af FACSCalibur flowcytometer (Becton-Dickinson, USA), og dataene blev analyseret med CellQuest analysesoftware (Becton-Dickinson, USA). Salg

Statistical Analysis Salg

QRT-PCR-reaktioner blev kørt tredobbelt for hver prøve og gentaget mindst 3 gange og dataene blev statistisk analyseret med Students ‘t-test “eller Wilcoxon rank sum test. IC

50 data fra MTT-assayet blev analyseret med Wilcoxon rank sum test. Alle data blev vist som middel ± S.E. (Standard error). To målinger var statistisk signifikante, hvis den tilsvarende p-værdi var. 0,05

Resultater

Profiler af miRNA i Paclitaxel- følsomme og resistente Lung Cancer Cells

Vi forberedt paclitaxel- resistent lunge non-small cancercelle (A549-T24) blandt paclitaxel sensitive celler ved kontinuerlig eksponering af A549-celler til paclitaxel (fig. S1A). For at søge efter de kritiske miRNA er involveret i udviklingen af ​​paclitaxel modstand, total RNA, udvundet af lungekræft celler (A549) og deres paclitaxel resistent variant (A549-T24), blev sendt til Exiqon, Danmark for miRNA-array profilering. Fra array resultater blev det identificeret, at 23 miRNA differentielt blev udtrykt i A549-T24 celler end A549-celler (fig. 1).

miRNA array-profiler af paclitaxel følsomme (C1 og C2) og modstandsdygtig (Tx1 og Tx2 ) lungekræft cellelinier blev vist. Overvåget hierarkisk gruppering af cellelinjer baseret på deres differentierede miRNA udtryk med ΔLMR≥2 mellem de to grupper blev udstillet. Hver kolonne repræsenterer en cellelinie og hver række en probe sæt. Varmen kort indikerer høj (rød) eller lav (blå) niveau af ekspression i forhold til middelværdien som pr skalaen vist i figuren.

For at identificere målgener af disse differentielt udtrykte miRNA, vi søgte miRNA target forudsigelse databaser miRBase, microRNA.org og TargetScanHuman 6.2, og vi identificerede miR-17-5p kunne sandsynligvis have en rolle i autophagy ved at målrette autofagi relateret protein beclin 1 (BECN1) ved at binde direkte til dets 3’UTR regionen mellem position 135 til 141. det er allerede rapporteret, at induktion af autofagi af paclitaxel behandling spiller en stor rolle i udviklingen af ​​paclitaxel resistens i tumorceller med opregulering af BECN1 [13] – [15]. Vi observerede øgede autophagy som indikeret ved opregulering af BECN1 og øget LC3-I til LC3-II konvertering og nedregulering af p62-ekspression i A549-T24-celler sammenlignet med A549-celler (fig. 2A). Vi målte også relative mRNA-niveauer af BECN1 og LC3-II (fig. 2B og 2C) og fundet begge disse mRNA’er blev opreguleret i A549-T24-celler sammenlignet med A549-celler. For at udvide vores fund vi forberedt en anden paclitaxel resistent lungekræft cellelinje H596-TXR fra paclitaxel sensitive NCI H596 celler

in vitro

(fig. S1B) og undersøgt status BECN1 og LC3 i denne resistente lungekræft celle line (H596-TXR). Vi fandt lignende opregulering af BECN1 og øget LC3-I til LC3-II konvertering i paclitaxel resistente H596 celler (H596-TXR) sammenlignet med forældrenes H596 celler (Fig. S2A). Desuden analyse af relative mRNA-niveauer af BECN1 og LC3-II (fig. S2B og fig. S2C) bekræftede også signifikant opregulering af cellulære autofagi i H596-TXR celler sammenlignet med H596 celler.

(A) Expression status af visse autophagic markørproteiner BECN1, MAP-LC3, P62 og GAPDH (lastning kontrol) blev målt ved Western blotting. (B-C) Relative BECN1 og LC3-II mRNA ekspressionsniveauer blev kvantificeret ved QRT-PCR-analyse i A549 og A549-T24-celler,

barer

repræsenterer middelværdi ± S.E. (

*

p 0,03 vs kontrol, hvor n = 3) (D) Nedregulering af MIR-17-5p ekspression i paclitaxel-resistente lungecancerceller (A549-T24) sammenlignet med A549-celler. Taqman QRT-PCR blev udført for at påvise de relative niveauer af MIR-17-5p i A549 og A549-T24-celler. Resultater blev normaliseret til snU6 ekspressionsniveau og repræsenteret som middelværdi ± S.E. fra tre uafhængige gentagelser.

(** p 0,001

vs kontrol, n = 3)

miRNA-17-5p nedreguleres i Paclitaxel- Resistant Lung Cancer Cells

Vi. yderligere valideret array data for miR-17-5p ved Taqman QRT-PCR. Brug af Taqman probe- baseret qRT- PCR-assay, sammenlignede vi ekspressionsniveauet af MIR-17-5p i paclitaxel sensitiv og resistente A549-celler. Fig. 2D viser en ~7.2 fold nedregulering i den relative miR-17-5p udtryk niveau i A549-T24 celler sammenlignet med A549 celler, validere de mikro-array-resultater. Vi vurderede også udtrykket niveau af miR-17-5p i H596-TXR celler og sammenlignet det med den for H596 celler. Vi fandt, at H596-TXR celler udviste næsten ~2.62 fold nedregulering af relativ MIR-17-5p ekspression sammenlignet med paclitaxel sensitive H596 celler (Fig. S2D) indikerer associering mellem MIR-17-5p og paclitaxel modstand var ikke cellelinie specifikke .

Følsomhed til paclitaxel moduleres af overekspression af miR-17-5p

in vitro

for at undersøge om miR-17-5p overekspression sensibiliseret A549-T24 celler til paclitaxel vi transficerede A549-T24-celler med 100 nM pre-mIR-17-5p (T24-mIR-17-5p) eller 100 nM pre-miR- negativ kontrol-RNA (T24-mIR-NC) og 24 h efter transfektion blev celler behandlet med forskellige doser af paclitaxel (0-200 nM). Det blev observeret, at sammenlignet med den negative kontrol (T24-miR-NC), overekspression af miR-17-5p betydeligt sensibiliseret de A549- T24 celler til paclitaxel (figur 3A,

s. 0,05

s 0,03

). For eksempel T24-MIR-17-5p celler udviste næsten 86%, 51%, 31% og 6% cellelevedygtighed når celler blev behandlet med 12 nM, 50 nM, 100 nM og 200 nM paclitaxel i 24 timer henholdsvis. Under lignende forhold viste T24-miR-NC celler næsten 99%, 89%, 78% og 58% levedygtighed. Lignende resultater blev opnået når vi overexpresed 100 nM pre-MIR-17-5p i H596-TXR celler (TXR-MIR-17-5p) og behandlet af cellerne med tilsvarende doser af paclitaxel (0-200 nM) i 24 timer. Det blev observeret, sammenlignet med den negative kontrol (TXR-MIR-NC), TXR-MIR-17-5p celler udviste meget lavere cellelevedygtighed ved behandling med stigende koncentrationer af paclitaxel. Komplette dosisresponskurver er vist i fig. S3A.

(A) A549-T24-celler blev enten transficeret med 100 nM pre-miR-negative kontrol (T24-miR-NC) eller præ-miR-17-5p (T24-miR-17-5p ) precursor RNA og blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

4 celler pr. Efter 24 timer blev celler behandlet med 0, 12, 24, 50, 100, 200 nM paclitaxel i yderligere 24 timer. Cellelevedygtigheden blev vurderet ved MTT-assayet. Data er præsenteret som% af cellelevedygtighed målt i celler behandlet med paclitaxel.

Kolonner

, betyde tre uafhængige forsøg;

barer

, gennemsnit ± S.E. (* P 0,05 vs negativ kontrol, p 0,03 vs A549 kontrol, hvor n = 4). (B-C) Celler (T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p) blev efterfølgende behandlet med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer og underkastes FACS-analyse efter at være blevet farvet med trypanblå. Histogram repræsenterer den røde fluorescens intensitet (FL3-H) vs. tæller plot hvor dosisafhængig forøgelse af celledød indtræffer. Resultaterne repræsenterer det bedste af data indsamlet fra tre forsøg med lignende resultater.

Dette tab af cellelevedygtighed af miR-17-5p overekspression og efterfølgende paclitaxel behandling blev yderligere vurderet ved trypanblåt udelukkelse under anvendelse flowcytometer (. figur 3B og 3C,

s 0,01

) med A549-T24 celler. Levende celler besidder intakte cellemembraner, der udelukker trypanblåt, dog døde celler ikke og til sidst optager trypanblåt. Fig. 3B og 3C viser, at med MIR-17-5p overekspression og efterfølgende paclitaxel behandling (24 og 50 nM) i 24 timer, residual cellelevedygtighed af T24-MIR-17-5p celler blev faldet i forhold til de respektive negative kontroller. For eksempel, mens MIR-17-5p overekspression og efterfølgende behandling med 24 nM og 50 nM paclitaxel i 24 timer forårsagede næsten 25% og 46% celledød, svarende negative kontroller udviste kun 4% og 6% celledød hhv. Disse resultater indikerede, at MIR-17-5p overekspression spiller en central rolle i sensibiliserende paclitaxel resistente A549-T24-celler til paclitaxel.

Beclin 1 er et direkte mål for MIR-17-5p i lungecancerceller

for at bestemme om miR-17-5p direkte binder sig til 3’UTR region BECN1 mRNA, vi konstrueret 3’UTR reportere af BECN1 indeholder formodede miR-17-5p bindingssted og tilsvarende mutant konstruktion, mangler miR- 17-5p bindingssted nedstrøms for luciferasereportergenet (fig. 4A). Co-transfektion af præ-MIR-17-5p med BECN1 vildtype reporterkonstruktion i A549-T24-celler stærkt undertrykt Renilla luciferaseaktivitet (fig. 4B), medens co-transfektion med mutant reporterkonstruktion viste ingen signifikant ændring i relativ luciferaseaktivitet med den for kontrollen (fig. 4B). Desuden, når A549-T24-celler blev co transficeret med anti-MIR-17-5p (100 nM) og 3′- UTR reportere af BECN1, med eller uden formodede MIR-17-5p bindingssted, noget signifikant fald i relativ luciferaseaktivitet blev observeret (fig. 4B). Disse resultater kollektivt bekræftet, at BECN1 var et direkte mål for MIR-17-5p i lungecancerceller.

(A) Skematisk repræsentation af 3’UTR af human BECN1 transkript. Predicted miR-17-5p bindingssted blev afbildet. Tallene (+ 135-141) repræsenterede de nukleotider, der blev forudsagt at basepar med MIR-17-5p frø sekvens. (B) MIR-17-5p binder direkte til 3’UTR af BECN1 genet i A549-T24-celler. A549-T24-celler blev samarbejdede transfekteret med renilla luciferase reporter plasmider (

pCI-neo-RL-Bec-3

‘

UTR-vægt

eller

pCI-neo-RL-Bec -3

‘

UTR-mut

), ildflueluciferase plasmider (pGL3-FF) og præ-miR-17-5p forløber eller anti-miR-17-5p eller pre-miR-negativ kontrol forløber RNA under anvendelse lipofectamin 2000 transfektionsreagens. Efter 48 timer blev celler høstet og lyseret med passiv lysebuffer. Luciferaseaktivitet blev målt ved anvendelse af Promega dual luciferase reporter assay kit. Resultaterne var repræsenteret relative fold repression (Renilla luc /Firefly luc aktivitet) sammenlignet med kontrolceller. (* P 0,05, ** p 0,03 vs kontrol, n = 4)

Overekspression af miR-17-5p i Paclitaxel Resistant Lung Cancer Cells Fører til Beclin 1 Nedregulering

for at eksperimentelt validere mål forudsigelse, vi vurderede protein niveauer af BECN1 følgende miR-17-5p overekspression i både A549-T24 og H596-TXR celler. Fig. 5a viser, overekspression af MIR-17-5p faldt betydeligt BECN1 ekspression i sammenligning med den negative kontrol (T24-miR- NC). Dette blev yderligere bekræftet ved vurderingen af ​​mRNA-niveauer af BECN1 af QRT-PCR. Vi fandt, miR-17-5p overekspression reduceret BECN1 mRNA niveau ved ~5.6 fold (

s 0,01

) i A549-T24 celler sammenlignet med den negative kontrol. Vi testede ekspressionsniveauerne for to andre autophagic markører, LC3-II og p62, som er nedstrøms for BECN1 ved Western blotting. Overekspression af MIR-17-5p i A549-T24-celler reduceret omdannelse af LC3-I til LC3-II (fig. 5A, andet blot og fig. 5C) og forøget niveau af p62 (fig. 5A, tredje blot). I tilfælde af H596-TXR celler, vi også fundet, at overekspression af MIR-17-5p resulterede i overensstemmende nedregulering af BECN1 og LC3-II i H596-TXR celler (Fig. S3B-D). Alle disse data kollektivt bevist, at overekspression af miR-17-5p i paclitaxel resistente lunge kræftceller forårsagede reduktion i cellulær autophagy ved direkte målrettet autofagi relateret protein BECN1.

(A) A549-T24-celler blev transfekteret enten med 100 nM pre-miR-negative kontrol (T24-miR-NC) eller præ-miR-17-5p (T24-miR-17-5p) forløber RNA. Efter 24 timer blev cellelysater fremstillet til Western blotting med antistof mod BECN1, MAP-LC3, P62 og GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (B-C) Relative BECN1 og LC3-II mRNA ekspressionsniveauer blev kvantificeret ved QRT-PCR-analyse i T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p celler,

barer

repræsenterer middelværdi ± S.E. fra tre uafhængige forsøg (** p 0,01 vs kontrol, hvor n = 3)

Overekspression af miR-17-5p Hæmmer Autophagy i Paclitaxel Resistant A549-T24 Cells

. Paclitaxel inducerer autophagy i cancerceller [13] – [15]. Tumorceller bruge denne cytoprotektive autofagi som forsvar fra apoptotisk celledød hvilket igen bidrager til udvikling af paclitaxel resistens. Under authophagy, autophagosomes fuse med lysosomer til dannelse autophagolysosomes som er sure vakuoler (AVO), som binder acridin-orange giver rød fluorescens og kan let vurderes ved fluorescens mikroskopi og flow-cytometer. Fig. 6A-B viste mens paclitaxel sensitive A549-celler udviste næsten ingen røde vesikler (fig. 6A), observeredes stort antal røde fluorescerende vesikler i cytoplasmaet i T24-MIR-NC-celler (fig. 6B). Men når A549-T24-celler blev transficeret med MIR-17-5p (T24-MIR-17-5p celler), forekomst af røde AVO reducerede signifikant (fig. 6C). Disse resultater blev bekræftet ved flowcytometrisk analyse (fig. 6D-G). Vi observerede, at T24-MIR-NC celler viste højere niveauer af autophagic flux sammenlignet med A549-celler (fig. 6D sammenlignet med fig. 6E). Men når A549-T24-celler blev overudtrykt med MIR-17-5p, dannelse af AVO reducerede signifikant sammenlignet med T24-MIR-NC-celler (fig. 6F sammenlignet med fig. 6E). Fig. 6G viser kvantitativ repræsentation af AVOS i celler, som blev beregnet ud fra flowcytometer resultater.

T24-MIR-NC og T24-MIR-17-5p celler blev farvet med AO for AVO observation under fluorescensmikroskop (B og C ). AO farvning af A549 tjente som kontrol (A). (D-F) for at kvantificere ændringen i% af celler udvikler AVO følgende MIR-17-5p overekspression i A549-T24-celler, blomstringen cytometrisk estimering af AVOS blev udført i A549, T24-MIR-NC og T24-MIR-17- 5P celler henholdsvis. (G) Kvantificering af gennemsnitlige AVO positive celler i alle tre cellelinier. Viste data er gennemsnittet ± S.E. (* P 0,05 vs kontrol, hvor n = 3). Fig. Som vist i fig. Fig. Cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assayet. Fig. Som vist i fig. Cellelevedygtighed blev målt ved MTT-assayet.