PLoS ONE: Kræft stamceller Følsomhed Assay (STELLA) hos patienter med fremskreden Lung og Kolorektal Cancer: En Feasibility Study

Abstrakt

Baggrund

Kræft stamceller repræsenterer en population af umodne tumorceller findes i de fleste faste tumorer. Deres særegne egenskaber gør dem ideelle modeller til undersøgelse af lægemiddelresistens og følsomhed. I denne undersøgelse undersøgte vi, om cancer stamceller isolation og in vitro følsomhed assay er mulige i et klinisk miljø.

Metoder

Kræft stamceller blev isoleret fra effusioner eller fersk kræftvæv af 23 patienter der skred efter standardbehandling fiasko. Specifikke dyrkningsbetingelser udvalgt til umodne tumorceller, som udtrykker markører for stemness. Disse celler blev udsat in vitro for kemoterapeutiske og targeted midler.

Resultater

Kræft stamceller blev ekstraheret fra levermetastaser i 6 tilfælde (25%), lungeknuder i 2 (8%), lymfeknudemetastaser i 3 (12,5%) og pleural /peritoneal /perikardieeffusion i 13 (54%). Cancerstamceller lykkedes isoleret i 15 patienter (63%), herunder 14 med lungecancer (93,3%). En følsomhed assay blev positivt resultat i 7 patienter (30,4%), med en median på 15 stoffer /kombinationer afprøvet (interval 5-28) og en median tid, der kræves for resultaterne af 51 dage (spændvidde 37-95).

Konklusion

den fremgangsmåde, der anvendes til STELLA retssagen tillod isolation af cancer stamceller i en sammenhængende del af patienterne. Den lave andel af sager, der fuldfører den fulde procedure og den lange mediane tid til at opnå resultater understreger behovet for en mere effektiv procedure.

Prøve registrering

ClinalTrials.gov NCT01483001

Henvisning: D’Arcangelo M, Todaro M, Salvini J, Benfante A, Colorito ML, D’Incecco A, et al. (2015) Cancer Stamceller Følsomhed Assay (STELLA) hos patienter med fremskreden Lung og Kolorektal Cancer: en forundersøgelse. PLoS ONE 10 (5): e0125037. doi: 10,1371 /journal.pone.0125037

Academic Redaktør: Xiaoan Liu, The First Affiliated Hospital med Nanjing Medical University, KINA

Modtaget: August 6, 2014 Accepteret: 10 Marts 2015; Udgivet: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 D’Arcangelo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte informationsfiler

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af italienske sammenslutning for Cancer Research (AIRC 5×1000) til MatildeTodaro, Giorgio Stassi og Federico Cappuzzo ved Fondazione Ricerca Traslazionale (ForRT) til Federico Cappuzzo og ved Istituto Toscano Tumori til Federico Cappuzzo og Armida D’Incecco. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser eksisterer

Introduktion

Kræft er den anden dødsårsag efter kardiovaskulære sygdomme på verdensplan og lunge, bryst, og kolorektale tumorer er de tre store aktører. Breast (BC) og lungecancer (LC) er den førende årsag til kræft død hos kvinder og mænd, hvorimod kolorektal cancer (CRC) tegner sig for ca. 10% af al kræft forekomst og dødelighed [1]. Kirurgisk resektion og adjuverende behandling kan helbrede tidlige fase primære tumorer. På den anden side, metastatisk sygdom er for det meste uhelbredelig grund af dets systemiske karakter og modstandsdygtighed over for terapeutiske midler. Faktisk kan mere end 90% af cancer-relaterede dødsfald tilskrives tilbagefald /tilbagefald og ikke til primære læsioner [2,3]. I de sidste to årtier har behandlingsresultater især forbedret takket være en bedre forståelse af kræft biologi, indførelse af nye målrettede /kemoterapeutiske stoffer og, vigtigst, udvælgelse af patienter baseret på biomarkører eller tumor-assays. Men selv denne nye fremgangsmåde viste sig at være uegnet til at helbrede patienter med metastatisk sygdom [4-7]. Denne kliniske virkelighed understreger behovet for at evaluere nye tilgange til behandling af kræftpatienter, og at udvikle nye kliniske værktøjer til udvælgelse af den bedste løsning for den enkelte patient behandling.

I de seneste år, en lille subpopulation af udifferentierede kræftceller med stamceller-lignende funktioner blev identificeret inden for tumorer og navngivne cancer stamceller (CSC) eller tumor initierende celler. De synes ansvarlig for kræft initiering, næring, progression og modstandsdygtighed over for antineoplastiske lægemidler [8]. Ifølge denne hypotese, CSC stammer fra omdannelsen af ​​normale stamceller. Faktisk, på grund af deres levetid, stamceller akkumulerer multiple mutationer, der er nødvendige for carcinogenese. Støtte denne hypotese normale stamceller og CSC aksjer flere vigtige egenskaber, herunder:

(a)

selvfornyelse,

(b)

differentiering,

(c)

aktiv telomerase udtryk,

(d)

aktivering af anti-apoptotiske veje,

(e)

øget membran transporter aktivitet og

(f)

evne til at migrere og metastaserer [9] . Endvidere cancere normalt få omfattende fænotypisk, funktionelle og molekylære heterogenitet, der kan let forklares ved CSC teori [10-12]. To modeller er blevet foreslået at belyse forskellige karakteristika af cancerceller i en tumor: 1) den klonale evolution model, og 2) CSC-modellen. Mens de tidligere postulerer, at alle celler i en cancer har potentiale til at give anledning til nye tumorer, sidstnævnte antyder, at kun cancerceller med stamceller-lignende funktioner kan opretholde tumor initiering og progression [13-16]. Eksperimentel bevis i en række tumorer støtter stærkt CSC hypotese. Betydningen af ​​CSC i tumor initiering er blevet fast etableret i leukæmi og for nylig rapporteret i en række forskellige faste tumorer, såsom bryst-, tyktarms-, hjerne, prostata, ovarie, lungecancer og melanoma [17-24]. Vores gruppe har tidligere identificeret og karakteriseret en CD133

+ tumorcellesubpopulation udstyret med selv-fornyelse og multi-slægt differentiering kapacitet ligesom normale stamceller [25]. Denne lille subpopulation af CSC bevarer tumorigen kapacitet, når transplanteret ind immun-deficiente mus [25,26]. De resulterende xenotransplantater er histologisk og molekylært ligner den parentale tumor, de hidrører [27]. Denne spændende egenskab gør CSC en god model for studiet af biologi og følsomheden af ​​tumorer af individuelle patienter til antineoplastiske midler.

CSC display høje ekspressionsniveauer af ATP-bindende kassette (ABC) transportører, anti-apoptotiske faktorer og en aktiv DNA-reparation kapacitet, som gør dem særligt resistente over for lægemidler og toxiner [28-30]. Desuden er den tilsyneladende tumor massereducere opnået med kemoterapi bidrager til CSC pool berigelse, hvilket øger risikoen for udvikling af mere resistente fænotyper [31]. Denne kollektive tyder på, at den fælles ineffektivitet konventionelle behandlinger på stamceller befolkning delvist kan forklare kræft modstand mod tilgængelige behandlinger. Derfor kende spektret af følsomhed CSC subpopulation af den enkelte tumor og målretning selektivt denne delpopulation kunne give væsentlig forbedring af behandlingsresultater.

I betragtning af den nuværende mangel på specifikke stoffer rettet mod CSC og de tidligere rapporterede observationer, udførte vi en prospektiv ikke-randomiseret undersøgelse (STELLA forsøg, ClinicalTrials.gov: NCT01483001) at vurdere, om isolering og afprøvning CSC mod et bredt spektrum af antineoplastiske midler er muligt i det kliniske miljø. Desuden undersøgelsen søgt at afgøre, om en sådan tilgang vil kunne identificere stoffer med

in vitro

aktivitet mod CSC stammer fra den enkelte patient, hvilket giver nye individualiserede behandlingsmuligheder. Undersøgelsen viste, at test af CSC kemosensitivitet er muligt i den kliniske omgivelser, selv om en mere effektiv

Der er behov for in vitro

metode.

Metoder

Berettigelse, rekruttering og opfølgning

protokollen for dette forsøg og støtte TREND tjekliste er tilgængelige som underbyggende oplysninger; se S1-protokollen og S1 TREND Tjekliste.

STELLA undersøgelse var en prospektiv, ikke-randomiseret, open-label, klinisk undersøgelse til evaluering af mulighederne for intervention CSC isolation og kemosensitivitet assay i klinikken (S1 Protocol). Undersøgelsen blev godkendt af “Etik Review Board for Investigation of Drugs” i den borgerlige Hospital i Livorno. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient før indskrivning. Patienter, der blev fulgt eller nævnt Medical Oncology Department of Sygehus Livorno, og som opfylder kriterierne for støtteberettigelse blev inkluderet i forsøget. Egnede patienter havde bekræftet cytologiske eller histologiske diagnose af metastatisk lunge-, bryst- eller colorectal cancer; forbehandlet med standardbehandlinger og uden yderligere standard behandlingsmuligheder; med en performance status på 100% i henhold til Karnofsky score; tilstrækkelige hæmatologiske, nyre- og leverfunktion. Vigtigste manglende valgbarhed kriterier omfattede den manglende evne til at opnå frisk tumorvæv eller neoplastisk effusion egnet til CSC udvinding og komorbiditet potentielt forstyrre undersøgelsen. Kliniske kendetegn for patienter samt molekylære funktioner i tumorer (hvis de findes) blev indsamlet og registreret i en elektronisk database i Institut for Medicinsk Onkologi i den borgerlige Hospital i Livorno. To patienter blev oprindeligt diagnosticeret med en CRC og indgår i undersøgelsen, men en patologi revision viste en anden histologi (kræft i bugspytkirtlen og tyndtarmen adenocarcinom), hvilket repræsenterer en afvigelse fra forsøgsprotokollen.

Det primære formål med undersøgelsen var at vurdere mulighederne for en følsomhed assay på CSC i et klinisk miljø, under hensyntagen til procentdelen af ​​patienter, for hvem det var muligt at udføre analysen og den tidsperiode til opnåelse af de følsomhedsresultater. Sekundære endepunkter var identifikation af LC, CRC og BC stamceller og evalueringen af ​​deres

in vitro

følsomhed over for anti-tumor agenter. Sidstnævnte blev udtrykt som dødelighed, dvs. den procentdel af døde celler efter kemosensitivitet assay.

Patienterne blev indrulleret i løbet af en to måneders periode (december 6

th 2011 januar 31

st, 2012), og blev fulgt op till død eller patientens afvisning (december 2011 til december 2013) med jævne mellemrum i henhold til kliniske behov og udtalelse klinikeren. Telefon interviews blev udført i tilfælde patienten var forhindret i at deltage ambulante besøg.

Tissue Collection, Isolation, og kultur af kræftceller

Neoplastisk effusion (hvis den findes) eller tumorvæv fra primær cancer eller fra den mest tilgængelige metastatisk hjemmeside blev opnået fra alle egnede patienter efter informeret samtykke signatur i Civil Hospital of Livorno. Friske prøver blev afsendt natten over ved stuetemperatur til Cellulær og Molekylær patofysiologi Laboratorium fra University of Palermo, Italien. Tumorprøver blev intensivt vasket i PBS-opløsning og inkuberet natten over i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, GIBCO) suppleret med penicillin (500 U /ml, GIBCO), streptomycin (500 ug /ml, GIBCO) og amphotericin B (1,25 ug /ml , GIBCO) for at undgå mikrobiel kontaminering. Tumorprøver blev enzymatisk fordøjet med collagenase og hyaluronidase og rystet mekanisk i 1 time ved 37 ° C. Alternativt blev neoplastiske effusion separeret ved centrifugering (1200 rpm, 10 min, 4 ° C). Opsamlede celler blev dyrket i stamcelle serumfrit medium suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF, 20 ng /ml, Sigma-Aldrich) og basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 10 ng /ml, Sigma-Aldrich) og udpladet i ultralav fastgørelsesplade (Corning) som tidligere beskrevet [25]. Disse betingelser favoriserer vækst af meget tumorgene stamceller-lignende celler, medens negativt at selektere for mindre tumorgene differentierede tumorceller, som tidligere viste ved Eramo et al [24]. Overlevende umodne tumorceller langsomt proliferere og danne celle sfærer. Sphere-afledte celler blev ekspanderet ved mekanisk og /eller enzymatisk dissociation og re-udpladet i fuldstændig frisk stamcelle medium. Cellekulturer blev holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 fugtig inkubator.

Undersøgelsen protokol omfattede

in vivo

eksperimenter, der aldrig er blevet udført, fordi alle tilgængelige celler blev anvendt for kemosensitivitet test i indsatsen for at teste så mange lægemidler som muligt og dermed at identificere en potentiel behandling for patienten.

Immunofluorescens karakterisering af kugler

Sphere-afledte celler blev vist sig at være CSC ved immunofluorescens karakterisering for stemness membran markører. Kort fortalt blev tumor sfærer mekanisk og enzymatisk dissocieret til opnåelse enkeltceller. Celler blev fikseret og permeablized som tidligere rapporteret [25]. Cytospun celler blev vasket i PBS og eksponeret natten over ved 4 ° C til antistoffer mod CD133 (AC133, muse IgG

1, Miltenyi), CD166 (muse IgG1, R 50% (tabel 3)

Patienter behandling

undersøgelsen ikke overveje behandling af patienter og dens endepunkter omfattede ikke, om de

in vitro

resultater korrelerer med det kliniske respons. Men ingen gyldig terapeutisk mulighed var til rådighed for disse patienter og, når det er muligt, vi tilbød dem en behandling med et af de afprøvede lægemidler. Den valgte regime var altid den ene med den højeste

in vitro

dødelighed. Da der ikke er anerkendt cut-off værdi på

in vitro

resultat definerer klinisk sensitivitet /modstand, kan det ikke udelukkes, at regimer med lav

in vitro

dødelighed kan producere klinisk respons og, derfor kunne det valgte regimen har haft en lav dødelighed. Som vist i tabel 3, blandt de 7 forsøgspersoner, for hvem en følsomhed assay var tilgængelig, kun 3 fik en behandling baseret på testresultaterne. Den højeste dødelighed observeret

in vitro

var 10% i to af disse patienter og sygdommen skred hurtigt efter behandlingens start. Den første patient var en aldrig ryger kvinde med en metastatisk lunge adenocarcinom uden molekylær driver aberration. Hun modtog en kombination af oxaliplatin og paclitaxel, men sygdommen skred efter kun to cykler. Den anden patient var en tidligere ryger mand med

KRAS

muteret avanceret adenocarcinom i lungerne. Han modtog en kombination af carboplatin og pemetrexed og hans sygdom skred hurtigt efter. På den anden side, i en ung mand med en metastatisk

EGFR

muteret adenocarcinom i lungerne

in vitro

assay viste en celle dødelighed på 40% for kombinationen af ​​oxaliplatin og paclitaxel. Patienten modtog 5 cykler af de ovennævnte kemoterapeutiske lægemidler, opnå en stabilisering af sygdommen. Trods den gavnlige virkning, i betragtning af, at patienten allerede havde modtaget 7 linjer af behandling, klinikeren besluttede at stoppe behandlingen for øget risiko for toksicitet. De andre 4 patienter, for hvem en følsomhed test blev udført ikke modtog behandling, fordi de døde, før resultaterne blev tilgængelige. Samlet set har disse anekdotiske fund tyder på, at højere

in vitro

følsomhed kunne resultere i bedre kliniske resultat.

Diskussion

Akkumulerende beviser understøtter eksistensen af ​​CSCS i humane tumorer. Disse celler har kapacitet til at forny sig selv og differentiere til modne tumorceller. De synes at køre tumor initiering, progression, og metastase. På grund af deres høje modstandsdygtighed over for lægemidler mod cancer, er de menes at bidrage væsentligt til tilbagefald efter kemoterapi og repræsenterer et attraktivt terapeutisk mål til potentielt opnå på langvarige terapeutiske respons. Derfor anerkendelsen af ​​de mest aktive lægemidler på CSC subpopulationen har potentiale til at identificere den bedste behandling valg for den enkelte patient eller nye behandlingsmuligheder for patienter forløber på standardbehandling.

Tidligere undersøgelser har allerede beskrevet isoleringen fremgangsmåden i CSC. Den STELLA undersøgelse er den første prospektive undersøgelse, der vurderer anvendelsen af ​​denne procedure i en klinisk indstilling med det formål at teste

in vitro

følsomhed CSC og potentielt identificere nye terapeutiske muligheder for patienten. I betragtning af at mulighederne var det primære endepunkt af undersøgelsen, blev et begrænset antal personer tilmeldt, langt de fleste med en diagnose af LC, den hyppigste sygdom henvises til vores institution. Undersøgelsen viste, at proceduren var muligt i 65% af tilfældene, hvilket fører til en kemo-følsomhed resultat i en tredjedel af patienterne i mediant 51 dage. Samlet set denne foreløbige erfaring gav os meget relevante oplysninger.

Først og fremmest, stedet for tumor prøvetagning var afgørende for succes isolation procedure, da neoplastiske udgydelser var de mest dygtige til dette formål. Dette er også en relevant aspekt for klinisk praksis, da effusion samling er forholdsvis let og ofte kræves for symptom management, det har lav risiko, og det er generelt godt accepteret af patienterne. Det er vores opfattelse prøven type, uanset om det var friske biopsi væv eller neoplastisk effusion, var den faktor, der primært påvirket på den lave procentdel af patienter, er omfattet af den test. Andre faktorer, såsom typen af ​​dyrkningsmediet, kan have haft en mindre effekt.

Den mediane tid mellem indsamling prøve og følsomhed analyseresultater var 51 dage. Dette er en relativt lang tidsperiode for metastatiske kræftpatienter, forklarer, hvorfor mindre end 50% af forsøgspersoner, for hvem følsomhed test var tilgængelig modtaget en behandling, baseret på resultaterne. Hvorvidt dette tidsrum er tilstrækkeligt til yderligere at ændre tumoren cellebiologi og deres følsomhed over for narkotika er ikke kendt, og i øjeblikket er der ingen videnskabelige beviser for dette. For at forkorte denne tidsramme, baseret på STELLA erfaring, er et igangværende klinisk studie (LUCAS) ved hjælp af en anden assay (Tecan Infinite F500 efter Cell Titer-Glo Selvlysende Cell Levedygtighed Assay, Promega). Denne metode bestemmes antallet af levedygtige celler baseret på kvantificering af et luminescerende signal, der er proportionalt med mængden af ​​ATP; det kræver et mindre antal celler og kan handle resultater på kun 7 dage fra biopsi. Dette kan bidrage til at opnå resultater i en kortere periode og teste flere lægemidler til patienter med langsom

in vitro

vækst CSC. Desuden leverer kvantitative resultater, hvilket eliminerer ringere præcision af den tidligere semikvantitativ metode. Denne nye tilgang kan også forbedre den procentdel af patienter, hvor kemosensitivitet test kan udføres vellykket. Faktisk i STELLA studere følsomhed assay blev udført på kun 7 sager hovedsagelig til fattige

in vitro

cellevækst.

I vores undersøgelse viste CSC høj modstandsdygtighed over for i øjeblikket tilgængelige lægemidler, herunder standard kemoterapeutiske stoffer og målrettede behandlinger, med kun ét tilfælde viser en dødelighed på over 50%. Dette er ikke uventet i betragtning af den høje modstand CSC til almindeligt anvendte antitumormidler, fremhæver det presserende behov for mere effektive lægemidler specifikt rettet mod denne celle population.

Som konklusion, den fremgangsmåde, der anvendes til STELLA retssagen tilladt CSC isolation i en konsekvent del af patienterne. Den lave andel af sager, der fuldfører den fulde procedure for kemosensitivitet assay og den lange mediane tid til at opnå de fulde resultater understreger behovet for en mere effektiv procedure. I et sådant perspektiv vil den igangværende LUCAS undersøgelse klarlægge de potentielle kliniske implikationer af behandlingsformer rettet mod CSCS.

Støtte Information

S1-protokollen. Undersøgelse protokol, informationsbrev til praktiserende læge og informeret samtykkeerklæring

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125037.s001

(PDF)

S1 TREND Tjekliste. . TREND tjekliste

doi: 10,1371 /journal.pone.0125037.s002

(PDF)