PLoS ONE: Kræft Cell Analyser på det indre Celle-Level Brug Elektroaktive Microwell Array enhed

Abstrakt

Cirkulerende tumorceller (CTCs), kaste fra primære tumorer og formidles i perifert blod, spiller en stor rolle i metastaser. Selv efter isolering af CTCs fra blod, målcellerne er blandet med en population af andre celletyper. Her foreslår vi en ny metode til analyser af celle blanding på single-celle-niveau ved hjælp af en mikrofluid enhed, der indeholder grupperede elektroaktive mikrobrønde. Dielektrophoretisk (DEP) kraft, der induceres af elektroderne mønstrede på bundfladen af ​​mikrobrøndene, tillader effektiv indfangning og stabil positionering af enkeltceller til high-throughput biokemiske analyser. Vi viste, at forskellige on-chip analyser herunder immunfarvning, levedygtighed /apoptose assay og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) på single-celle plan kan gennemføres blot ved at anvende specifikke reagenser for hver analyse. Vores enkle metode bør i høj grad hjælpe diskrimination og analyse af sjældne kræftceller blandt en population af blodlegemer

Citation:. Kobayashi M, Kim SH, Nakamura H, Kaneda S, Fujii T (2015) Cancer Cell Analyser på Single Cell-niveau Brug elektroaktive Microwell Array enhed. PLoS ONE 10 (11): e0139980. doi: 10,1371 /journal.pone.0139980

Redaktør: Arum Han, Texas A M University, UNITED STATES

Modtaget: September 6, 2015; Accepteret: September 18, 2015; Udgivet: 11. november 2015

Copyright: © 2015 Kobayashi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle data er inkluderet i manuskriptet

Finansiering:.. Dette arbejde blev delvist støttet af Japan Science and Technology Agency for Core Forskning for evolutional Videnskab og Teknologi (CREST) ​​og strategiske International Research Cooperative Program (SICP)

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cirkulerende tumorceller (CTCs), kaste fra primære og metastatiske tumorer og strømmer ind i blodet, betragtes. som en væsentlig årsag til cancer metastase [1]. Tælle antallet af CTCs i perifert blod gør det muligt at overvåge terapeutiske virkning og prognose [2]. En udfordring i detektering af CTCs i en blodprøve, er, at eksistensen af ​​CTCs er ekstremt sjældne og blandet med normale blodkomponenter (1 i 10

9 blodlegemer). Mikrofluidenheder er egnede til sortering og analyse af sjældne celler, idet man effektivt kan håndtere komplekse cellulære fluider med minimal skade på suspenderede celler [3, 4]. Desuden er allerede blevet vist evne mikrofluidenheder at behandle den store mængde af fuldblodsprøver [5]. For nylig har adskillige grupper udviklet mikrofluidenheder at isolere CTCs fra normale blodkomponenter, for eksempel ved hjælp af antistof-coatede microposts, dielektroforese, størrelse-baseret separation ved et mikrofilter eller akustoforese etc. [6-11]. Selvom tidligere metoder ved hjælp mikrofluidenheder succes demonstreret adskillelse af CTCs, har de separerede celler, der skal indsamles og helst blive analyseret på enkelt-celle niveau.

En praktisk spørgsmål på CTC analyse er, at kræftcellerne blandes med normale blodceller selv efter isolering af CTCs fra blod. De tidligere CTC isolation metoder viser afvejning mellem nyttiggørelse af CTCs og udtømning af hvide blodlegemer (WBCs) [9-11]; den højere recovery rate af CTCs, jo lavere udtømning på WBCs. Disse resultater indikerer, at de isolerede cancerceller stadig blandes med mange WBCs. For eksempel kan en mikrofluid fremgangsmåde under anvendelse magnetophoretic WBC depletion tillader 3,8-log depletering af WBCs og et udbytte på 97% af cancerceller [12]. Hvis en original blodprøve indeholder 10-kræftceller og 10

6-WBCs, indeholder en oprenset prøve 10-cancerceller og 156-WBCs efter isolation med magnetophoretic WBC udtynding metode. Derfor efter isolering af målceller fra blod, diskrimination mellem cancerceller og WBC’er er stærkt påkrævet for at påvise eller analysere målcellerne.

Immunostaning eller fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) er almindeligt anvendt fremgangsmåde til diskrimination af cancerceller. Imidlertid konventionelle protokoller bruger reagensglas eller en mikrotiterplade kræver store mængder af reagenser, herunder antistoffer eller prober til hybridisering. Desuden centrifugeringer, der kræves for at ændre reagenser af hver analyse, muligvis forårsage kritisk tab af originale prøver, eller skade på cellelevedygtighed samt celle funktion på grund af stærke centrifugale kræfter, der virker på en celle [13-15]. En enkel og effektiv metode til biokemisk analyse er derfor meget ønskeligt at reducere mulige risici ved de konventionelle metoder.

Her foreslår vi en ny metode til on-chip single-kræftcelle analyser bruger elektroaktiv mikrobrønd array (EMA) enhed. EMA indeholder mønstrede tynd-film-elektroder i bunden af ​​hver mikrobrønd til enkelt-celle trapping med dielektroforese (DEP) [16, 17]. Da DEP kraft giver hurtig, aktiv og stabil fældefangst, kunne vi effektivt fælde cancerceller suspenderet i prøveopløsningen. Fanget celler kan stabilt holdes på en chip af DEP, som muliggør en hurtig udveksling af reagenser med en ekstremt lille prøvevolumen. Således er high-throughput biokemiske assays for grupperede enkeltceller lettes. Vi demonstrerede gennemførligheden af ​​vores tilgange med en blanding af forskellige celletyper ved at udføre tre slags analyser; cancer diskrimination celle ved immunofarvning, levedygtighed /apoptose assay og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) analyse. Hele processen for analyser kræver bare sekventiel indsprøjtning af celle suspension og reagenser til analyserne uden komplicerede ventil eller slanger systemer. Vi forventer vores enkle metode letter high-throughput og parallel enkelt celle analyser, og samtidig fjerne ekstra celle manipulationer uden for enheden.

Elektroaktive Microwell Array

Design

Enheden består af en mikrofluid kanal lavet af polydimethylsiloxan (PDMS), og et glassubstrat, der indeholder et stort antal mikrobrønde fremstillet på sammenflettet indiumtinoxid (ITO) elektroder (figur 1A). Afstanden mellem elektroderne er omkring 6 um og diameteren af ​​mikrobrønde er 30 um, som er større end diameteren af ​​målcellerne (20 um). Og højden af ​​mikrobrønd struktur, som var lavet af epoxyharpiks, er 25 um. Mikrobrøndene passer med interdigiterede ITO elektroder for at lokalisere et par elektroder (anode og katode) i hver af brøndene. En enhed indeholder 3168 mikrobrønde. Påtrykte elektriske felt er meget lokal inde i hver mikrobrønd eftersom interdigiterede elektroder er placeret i bunden af ​​mikrobrøndene. Fig 1B viser proceduren ifølge enkelt celle analyse. Først celler indføres i mikrokanal og fanget i mikrobrøndene ved anvendelse positive DEP induceret af vekslende spænding til elektroderne. Derefter er reagenser til analyserne indføres i strømningstekniske kanal. Fig 1C viser billedet af fanget celler i mikrobrøndene.

(a) Konfiguration af enheden og dimensioner mikrobrønd og sammenflettede elektroder. (B) Cell trapping og reagens gengæld for enkelt-celle analyse. Cellesuspensionen indføres i mikrofluid kanal på enheden, og celler er fanget i mikrobrøndene ved positiv DEP. Efter celle indfangning, analyser af de fangne ​​celler udføres ved indføring nødvendige reagenser i mikrokanal. (C) Billede af fangne ​​DU145 celler (angivet ved pile) i mikrobrønde.

Fabrication

Fig 2 viser fremstillingsprocessen ifølge den foreliggende indretning. Formen af ​​elektroderne blev mønstret ved anvendelse af fotoresist (AZP1350, AZ Electronic Materials) på en ITO-overtrukket glassubstrat (TOA optisk teknologi, LTD.), Efterfulgt af ætsning af ITO med 0,2 M FeCl

3 + 6 M HCI-opløsning til 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev substratet renses og skylles for at fjerne AZP1350 fotoresist der forbliver på ITO. Den mikrobrønd arrayet er fremstillet med fotoresist (KMPR1005, NIPPON Kayaku CO.) Oven på de mønstrede elektroder. Fotoresisten var spin-coated på elektroderne, og et chrom foto-maske mønstret for mikrobrønd arrayet blev tilpasset de mønstrede ITO elektroder. Den fotoresist blev udsat for ultraviolet lys gennem foto-maske, efterfulgt af udvikling og skylning.

(a) Microwell array. De interdigiterede elektroder er fremstillet ved en konventionel mønsterdannelsesprocessen af ​​ITO og mikrobrønde fremstillet af KMPR flugter med elektroden. (B) PDMS strømningsteknisk chip. Fluidik chip er fremstillet gennem blødt-litografi proces. (C) Afsluttet mikrofluidanordning lavet ved at binde to dele sammen.

PDMS strømningsteknisk chip fremstilles via standard replika støbeprocessen som vist i fig 2B. Fotoresist (SU-8 2100, MicroChem Co.), der tjener som en form, blev mønstret på en siliciumskive. Formen blev grundigt rengjort med isopropanol og deioniseret vand. PDMS (. Silpot 184, Dow Corning Toray, CO Ltd.) blev blandet med hærdemiddel (10: 1 masseforhold) og hældes over formen. Derefter blev PDMS opvarmet til 75 ° C i 1 time efterfulgt af skrælning fra polymeriserede PDMS fra formen. Huller som adgang porte til flow-kanal blev udstanset.

For at binde mikrobrønd array og PDMS strømningsteknisk chip, de blev udsat for O

2 plasma for at aktivere modsatrettede overflader ved hjælp af reaktiv ion ætsning maskine ( RIE-10NR, Samco CO.). Også O

2 plasma behandling gør KMPR mikrobrønde og PDMS kanal hydrofile, hvilket sikrer nem injektion af vandige reagenser ind i kanalen og mikrobrøndene.

Cell fældefangst Brug DEP force

I denne undersøgelse, er cellerne indført i mikrokanalplade aktivt fanget i mikrobrønd udstyret med sammenflettet elektrode af DEP kraft. DEP er et fænomen, hvor neutrale partikler bevæger sig, når den anvendes på ikke-ensartet elektrisk felt. Den tidsgennemsnitlig DEP kraft kan tilnærmes i form af dipol virkninger som (1), hvor

ε

m

er absolut permittivitet af mediet,

r

er radius af partiklen, Re (

f

CM) er den reelle del af Clausius-Mossotti faktor (

f

CM) vedrørende den inducerede dipolmoment og E er RMS-værdien af ​​det anvendte elektriske felt.

f

CM er (2) (3) (4), hvor

ε

s

er absolut permittivitet af mediet. De partikel bevæger sig til et felt maksimum (positiv DEP) eller et felt minimum (negativ DEP) afhængig af Re (

f

CM), der repræsenterer forskellen mellem de dielektriske egenskaber af partiklen og dens suspenderingsmedium (figur 3) [18-20]. Re (

f

CM) kan styres ved at justere ledningsevnen af ​​suspensionsmediet og hyppigheden af ​​anvendte elektriske felt. Således celler er fanget i mikrobrønd ved positiv DEP i tilfælde af EMA enhed [16].

Partikler tiltrækkes til elektroderne på grund af den positive DEP kraft, og frastødt fra elektroderne på grund af den negative DEP kraft .

Materialer og metoder

Prøveforberedelse

U937-celler (leukæmiske monocyt lymfom cellelinie, opnået fra Riken Bio Resource center, Japan), DU145 celler ( prostatacancer-cellelinie, opnået fra Riken Bio Resource center, Japan) og PC3-celler (prostatacancer-cellelinie, opnået fra Riken Bio Resource center, Japan) blev dyrket i en fugtig inkubator (37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2). Dyrkningsmediet for alle celler var RPMI 1640 (Invitrogen Corp.) suppleret med kalvefosterserum (10%, Gemini Bio-produkter) og penicillin-streptomycin-opløsning (1%, Sigma Chemical Co). Den gennemsnitlige diameter af U937-celle, DU145 celle og PC3 cellen var 10 um, 20 um og 22 um hhv. Cellerne blev dispergeret i en DEP-buffer (10 mM HEPES, 0,01 mM CaCl

2, 59 mM D-glucose og 236 mM saccharose; pH7.35) for at justere ledningsevnen af ​​cellesuspensionen medium (21,4 MSM

-1) til positiv DEP [21]. DEP puffer indeholdt bovint serumalbumin (1% vægt /volumen) for at blokere ikke-specifik celleadhæsion. Celler i dyrkningsmediet blev centrifugeret ved 2000 rpm i 5 min. Vi fjernede forsigtigt dyrkningsmediet og tilsat DEP puffer.

forsøgsopstilling

mikrofluidapparat var monteret på x-y translationel fase placeret på omvendt mikroskop (IX71, OLYMPUS). Celler blev overvåget med et kamera (DP73, OLYMPUS), der blev installeret på mikroskopet. Det elektriske potentiale for DEP blev anvendt på de interdigiterede ITO elektroder med funktionsgenerator (WF1974, NF Corp.) gennem en forstærker. (HSA4101, NF Corp.)

Immunfarvning

Fanget celler i mikrobrønde blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS (phosphatbufret saltvand) i 10 minutter og vasket med PBS i 5 minutter. Efterfølgende blev de permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 i PBS i 5 minutter og vasket med PBS i 5 minutter. Celler blev immunfarvet med Hoechst33342 (DOJINDO) for DNA-indhold, FITC-konjugerede anti-cytokeratin antistoffer (BD) for epitelceller og PE-konjugeret anti-CD45 antistoffer (Life teknologi) for leukocytceller i 30 minutter. Endelig blev cellerne skyllet med PBS i 10 minutter. De hele processer blev udført ved en strømningshastighed på 3 pi min

-1.

Levedygtighed og Apoptose Assay

Trapped celler blev udsat for Annexin V Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ved stue temperaturen i det mørke rum i 30 minutter efterfulgt af udveksling af reagenserne i blandede reagenser af Annexin bindingsbuffer (Invitrogen), propidiumiodid (Invitrogen) og calcein blå (Invitrogen) i 10 minutter. Hele processen blev udført ved en strømningshastighed på 3 pi min

-1.

Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH)

Interphase FISH blev udført på de fangne ​​celler i mikrobrøndene ifølge standardprotokollen med følgende modifikationer. Kort fortalt blev fanget celler fikseret med Carnoys opløsning. Anordningen blev vasket med 2 x Saline-natriumcitratpuffer (SSC, Abbott), dehydreret i en stigende serie af alkohol, og lufttørret. Sonden mix (5’BCL-6 probe er mærket med rødt og 3’BCL-6 probe er mærket med grønt) til hybridisering blev tilsat. DNA blev denatureret ved 73 ° C i 5 minutter og derefter hybridiseret ved 37 ° C i 16 timer på den termiske cykler (BECKMAN COULTER). Efter inkubation med 0,4 x SSC /0,3% Nonidet P-40 (NP-40) ved 73 ° C, at anordningen er overført til 2 x SSC /0,1% NP-40 ved stuetemperatur, det blev lufttørret i mørke rum . DNA blev modfarvet med DAPI (DOJINDO), forseglet med dækglas.

Resultater og Diskussion

Feasibility af Enhed for On-Chip Immunfarvning

Muligheden for den nuværende enhed for on-chip single-cancercelle-analyse blev påvist ved udførelse af immunfarvning efter indfangning af en blanding af to forskellige cellelinjer, herunder U937-celler (en model for hvide blodlegemer) og DU145 celler (en cancer cellelinie). Cellesuspensionen blev indført i indretningen med en strømningshastighed på 3 pi min

-1. For den positive DEP, 10 Vp-p og sinusformet elektriske potentiale på 8 MHz, blev anvendt på interdigiterede ITO elektroder. Efter celle fældefangst med DEP, vi udført immunfarvning for at identificere de fangne ​​celler. Fanget celler blev fikseret, permeabiliseret og farvet ved sekventiel injektion af reagenserne i udstyret truget adgangsporten. Cellerne blev farvet med Hoechst33342 (blå) -farvning DNA’er, FITC-konjugerede anti-cytokeratin antistoffer (grøn) for epitelceller og R-PE konjugeret anti-CD45 antistoffer (rød) til leukocyt-celler (Fig 4). Cytokeratin-positive celler blev betragtet som en kræftcelle, hvorimod CD45-positive celler blev betragtet som WBC. Figur 4 viser fanget 11 celler (i 10 brønde, herunder en godt med to celler fanget i øverste venstre), 3 celler farvet med anti-CK-antistof (grøn) svarende til kræftcelle og 8 celler farvet med anti-CD45-antistof (rød) svarende til WBC. På denne måde kan identifikation af cancercellen og WBC kun gøres ved sekventiel injektion af påkrævede reagenser i indretningen uden komplekse ventilsystem eller supplerende udstyr.

Trapped DU145 celler og U937 celler farvet med Hoechst33342 (blue), Anti-cytokeratin antistof (grøn) og Anti-CD45-antistof (rød). Flettet billede identificerer DU145 celler som en model af CTC (blå + grøn).

Trapping præstationer på de forskellige cellelinjer blev undersøgt ved at tælle antallet af fanget celler i mikrobrønde efter immunostaning. Fig 5A viser trapping mønster af hver af de celletyper, hvor billedet repræsenterer hele matrix i anordningen, og hver pixel repræsenterer hver mikrobrønd. DU145 celler tendens til at blive fanget ved opstrøms for mikrobrønd arrayet mens U937-celler tilfældigt fordelt på mikrobrønd array. Årsagen ville være den større diameter af DU145-celler end det U937-celler, genererer større DEP kraft som vist i ligning (1). Da den kraft induceret af DEP er proportional med den kubiske celle radius, DU145 celle modtager større kraft end U937 celle. Det samlede antal fanget DU145 celler og U937-celler var 763 og 801, henholdsvis. 39% af indførte celler blev fanget i mikrobrøndene, og 33% af mikrobrøndene blev besat af enkelt celle. Eftersom de foreliggende elektroaktive mikrobrønde blev designet til effektivt fælde enkelt DU145 celle hvoraf diameter er større end den for U937 celle, indretningen udviser god ydeevne på enkelt DU145 celle trapping, hvor 728-brønde blev besat af enkelte DU145 celler (598-brønde var besat af enkelte DU145 celler og 130-brønde blev besat af en enkelt DU145 celler og enlige U937-celler). Kun 15-brønde blev besat af to eller tre DU145 celler. Dog kan flere U937 celler let fanget i en samme mikrobrønd siden U937 celle (11 um i diameter) er mindre end den for DU145 celle.

(a) Pixel billede af mikrobrønd på enheden. Hver pixel svarer hver mikrobrond på enheden og (b) Fordeling af indholdet af fanget celler i mikrobrønd. Farver viser indholdet af fanget celler i mikrobrønd.

Levedygtighed og Apoptose Assay

Vi undersøgte levedygtigheden af ​​indespærrede kræftceller til at opdage og selektivt analysere levedygtige CTCs der kunne være involveret i metastaser. Eftersom næsten alle kræftceller i blodet dræbes af cytotoksiske celler, såsom T-celler, etc., og døde på grund af de anoikis eller skader forårsaget af forskydningsspænding [22], er det stærkt nødvendigt at identificere levedygtige kræftceller blandt en population af celler til yderligere analyse. For at kontrollere levedygtigheden af ​​kræftceller, blev DU145 celler fanget i mikrobrøndene og dyrket i enheden ved at indføre dyrkningsmedium. Efter 6 timer blev de fangne ​​cellerne farvet med calcein (blå) for levedygtige celler, annexin V (grøn) til apoptose celler eller PI (rød) til døde celler. Næsten alle de fangne ​​celler (85%) udsender blå fluorescens, hvilket indikerer, at cellerne er levedygtige, selv efter 6 timers inkubation på enheden (figur 6).

Annexin V (grøn) pletter apoptotisk celle, PI (rød) farver døde celler og Calcein (blå) pletter levedygtige celler. Flettet billede identificere både apoptotiske og døde celler (grøn + rød). Billeder af celler fanget i mikrobrøndene efter 6 timers inkubation.

Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH)

Vi udførte on-chip FISH i EMA at lokalisere nærvær eller fravær af specifikke DNA sekvenser på kromosomer, eftersom cancerceller ofte fremkalde kromosomal omlejring for drug-resistens. For demonstration, B-celle Lymphoma6 (BCL6; gen for hæmning af apoptose [23]) genomlejring blev vurderet for dyrkede PC3 celler ved hjælp af on-chip FISH. FISH-negative viser nærhed af røde pletter (opstrøms del af BCL6 gen) og grønne pletter (nedstrøms del af BCL6 gen). Betragtninger FISH-positive shows tofarvet break-hinanden sonde. Figur 7 viser resultatet af FISH analyse for et PC3 celle i mikrobrønd array. Translokation af apoptotisk gen i PC3 celler kan med held kontrolleres ved on-chip FISH, og kromosom 3q27 af cellen ikke forårsage translokation fordi røde og grønne pletter på samme sted.

Pilene angiver signal af BCL6 probe. Grønt signal viser nedstrøms del af BCL6 genet og rødt signal viser opstrøms del af BCL6 genet. Flet billede viser gul signal på grund af røde og grønne signaler er på samme sted. Det betyder kromosom 3q27 ikke forårsager translokation.

Konklusioner

I denne undersøgelse, vi foreslog en ny metode til enkelt kræftcelle analyser ved hjælp af EMA-enheden. Enheden muligt for os at gennemføre en effektiv enkelt celle fældefangst og tre slags biokemiske analyser; immunfarvning, levedygtighed /apoptose assay og FISH på single-celle niveau. Da de fangne ​​enkeltceller kunne stabilt holdes inde mikrobrønde, gennemførte vi hele processen for analyserne ved sekventiel indsprøjtning reagenser uden komplicerede ventil eller slanger systemer. Vores enkle EMA enhed kombineret med meget følsomme analytiske assays lover high-throughput og paralleliseret analyser af sjældne kræftceller i en population af andre celletyper. Man kan også anvende denne teknik til at screene en lægemiddelkandidat til tumor behandling ved at overvåge respons af target celler gennem on-chip analyser.