PLoS ONE: pTyr421 Cortactin er overudtrykt i tyktarmskræft og dephosphoryleres ved curcumin: Inddragelse af ikke-receptor type 1 proteintyrosinphosphatase (PTPN1)

Abstrakt

Cortactin (CTTN), først identificeret som en vigtig substrat af Src tyrosinkinase, deltager aktivt i forgrening F-actin forsamling og i celle motilitet og invasion.

CTTN

gen forstærkes og dens protein overudtrykt i flere typer af kræft. Den phosphorylerede form af cortactin (pTyr

421) er påkrævet for kræftcellen motilitet og invasion. I denne undersøgelse, viser vi, at et flertal af de testede primære kolorektale tumor prøver viser stærkt forbedret udtryk for pTyr

421-CTTN, men ingen ændring på mRNA niveau i forhold til raske forsøgspersoner, hvilket tyder på posttranslationel aktivering i stedet genamplifikation i disse tumorer. Curcumin (diferulolylmethane), en naturlig forbindelse med lovende kemoforebyggende og kemosensibiliserende virkninger, reducerede indirekte associering cortactin med plasmamembranen proteinfraktionen i colonadenocarcinom celler som målt ved overfladen biotinylering, massespektrometri, og Western blotting. Curcumin faldt betydeligt i pTyr

421-CTTN i HCT116 celler og SW480 celler, men var ineffektiv i HT-29 celler. Curcumin fysisk interageret med PTPN1 tyrosinphosphataser at øge sin aktivitet og føre til dephosphorylering af pTyr

421-CTTN. PTPN1 hæmning elimineret effekten af ​​curcumin på pTyr

421-CTTN. Transduktion med adenoviralt-kodet CTTN øget migration af HCT116, SW480, og HT-29. Curcumin faldt migration af HCT116 og SW480 celler, som stærkt express PTPN1, men ikke for HT-29-celler med signifikant reduceret endogen ekspression af PTPN1. Curcumin reducerede signifikant fysisk interaktion af CTTN og pTyr

421-CTTN med p120 catenin (CTNND1). Kollektivt, disse data antyder, at curcumin er en aktivator af PTPN1 og kan reducere celle motilitet i tyktarmskræft via dephosphorylering af pTyr

421-CTTN som kunne udnyttes til nye terapeutiske tilgange i tyktarmskræft terapi baseret på tumor pTyr

421 -CTTN udtryk

Henvisning:. Radhakrishnan VM, Kojs P, Young G, Ramalingam R, Jagadish B, Mash EA, et al. (2014) pTyr

421 Cortactin er overudtrykt i tyktarmskræft og dephosphoryleres ved curcumin: Inddragelse af ikke-receptor type 1 proteintyrosinphosphatase (PTPN1). PLoS ONE 9 (1): e85796. doi: 10,1371 /journal.pone.0085796

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: August 22, 2013; Accepteret: December 2, 2013; Udgivet: 22 Jan 2014

Copyright: © 2014 Radhakrishnan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. National Institutes Sundhedsstyrelsen [5 R01 DK067286 til PRK og FKG]. NIH tilskud, P30 CA 23074 [EAM] NIEHS giver ES006694 til Southwest Environmental Health Sciences Center (SWEHSC), NIH /NCI tilskud CA023074 til Arizona Cancer Center og af BIO5 Institute på University of Arizona. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cortactin, der kodes af

CTTN /EMS1

gen, er en v-Src-substrat lokaliseret med cortical actin på plasmamembranen og overudtrykkes i mange typer af cancer [1]. Cortactin overekspression resultater fra 11q13.3 kromosomale region amplifikation i forskellige kræftformer, såsom hoved og hals pladecarcinom, hepatocellulært carcinom, bryst og blærecancer og korrelerer med dårlig patient prognose og nedsat overlevelse [2] – [5]. Cortactin, generelt til stede i flere forskellige celletyper, er beriget i kortikale strukturer såsom membran flæser og lamellipodia, og spiller vigtige roller i Microfilament-membran interaktioner såvel i transducerende signaler fra celleoverfladen til cytoskelettet [6], [7 ]. Cortactin deltager aktivt i ARP2 /3-medieret actinpolymerisation associeret med plasmamembranen [7] og virker som en F-actin modulator i tyrosinkinase-reguleret cytoskelet reorganisering [8] antyder en mekanisme for dets rolle i motilitet. Dens rolle i celle migration og invasion er godt undersøgt i epitelceller, fibroblaster, endotelceller, og brystcancerceller [8] – [10]. Phosphorylering af murine cortactin på Tyr

421, Tyr

466 (Tyr

470 i mennesker) og Tyr

482 (Tyr

486 i mennesker) er nødvendig for effektiv celle motilitet i flere celletyper , hvilket indikerer, at cortactin tyrosinphosphorylering spiller en vigtig rolle i celle migration [8], [11], [12]. Generelt tyrosinphosphorylering af cortactin udløser rekruttering af SH2-domæne proteiner, herunder flere kinaser og NCK adapter protein NCK1, der forbinder cortactin med Wiskott-Aldrich syndrom-lignende protein (wasl, N-WASP) og VAR /wasl interagerende protein familiemedlem 1 (WIF1, WIP). Dette fører igen til forøget aktivering af ARP2 /3-kompleks (actin-relateret protein 2-homolog /3-homolog) og fører til filament actin forgrening [13] – [16].

Talrige epidemiologiske undersøgelser har vist, at plante baseret phenolforbindelser i kosten agenter spiller en vigtig rolle i chemoprevention af kolorektal cancer [17], den anden mest almindelige kræftform hos mænd og tredje mest almindelig hos kvinder. Regelmæssig indtagelse af frugt og grøntsager, der indeholder disse forbindelser er blevet forbundet med en nedsat forekomst af kolorektal cancer [18]. Blandt de naturlige bi-phenolforbindelser, curcumin, en curcuminoidet fra rhizomet

gurkemeje longa

, er kendt for sin anti-cancer og anti-inflammatoriske, antioxiderende aktivitet in vivo og in vitro [19] – [ ,,,0],21], og er veltolereret i store doser. I et fase II studie med avancerede bugspytkirtlen kræftpatienter blev en dosis på 8 g administreret i 2 måneder med observeret toksicitet [22]. En anden fase I klinisk forsøg evaluerede tolerabiliteten af ​​curcumin i 25 patienter med høj risiko forstadier til kræft. blev observeret histologiske forbedringer i 7 af de 25 forsøgspersoner, med ingen behandlingsrelaterede toksicitet op til 8 g /dag [23]. Anticancer virkninger af curcumin og dens derivater er typisk blevet tilskrevet hæmning af celleproliferation, cellecyklusstop, og /eller induktion af apoptose [21], [24], [25]. En klinisk undersøgelse viste, at administration af doser på op til 2,2 g

Curcuma

udtrække (indeholdende 180 mg curcumin) per dag i op til 4 måneder viste kliniske fordele for patienter med fremskreden refraktær kolorektal cancer [26].

i den foreliggende undersøgelse, viser vi, at pTyr

421 cortactin er overudtrykt i colorectal cancer uden samtidige ændringer i mRNA-niveauer. Curcumin faldt niveauerne af pTyr

421 cortactin i colon cancerceller

in vitro

ved fysisk at interagere med den ikke-receptor type 1 proteintyrosinphosphatase (PTPN1; PTP1B) for at øge dets aktivitet, og dephosphorylere cortactin, således reducerer cancercelle migration. Vores data tyder på potentielle nytte af pTyr

421 cortactin immunfarvning som biomarkør for invasiv tyktarmskræft og give yderligere indsigt i mekanismen for kemoforebyggende virkninger af curcumin og dens potentielle rolle i forebyggelsen af ​​metastatisk tyktarmskræft.

Materialer og Metoder

Reagenser

curcumin med 98,05% renhed og fri for forurenende curcuminoider (demethoxy-curcumin og bis-demethoxy curcumin), var custom-renses ved ChromaDex (Irvine, CA). PTPN1 inhibitor XXII (3-(3,5-dibromo-4-hydroxy-benzoyl)-2-ethyl-benzofuran-6-sulfonicacid-(4-(thiazol-2-ylsulfamyl)-phenyl)-amide), en celle-permeabelt, selektiv, reversibel, og en ikke-kompetitiv allosterisk inhibitor af PTPN1 [27] blev opnået fra EMD Millipore (Billerica, MA). Rekombinant adenoviral cortactin blev opnået fra Vector Biolabs (Philadelphia, PA).

Antistoffer, cellelinier og humane væv

T-84-celler (human colorectal carcinom) oprindeligt beskrevet af Murakami og Masui [28 ] blev leveret af Dr. Declan McCole, University of California San Diego, CA. HCT116 blev HT29 og SW480-celler opnået fra ATCC og blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), 10% kalvefosterserum (Cellgro, Manassas, VA), og 1% penicillin-streptomycin (Life Technologies, Grand Island, NY). Celler blev dyrket i en 10 cm skål eller i seks-brønds plader (Greiner Bio-One, Monroe, NC). Muse monoklonalt anti-GAPDH, kanin polyklonalt phospho-specifik (pTyr

421) cortactin antistof og anti-PTPN1 antistof blev indkøbt fra EMD Millipore. Anti-cortactin muse monoklonale og anti-cortactin kanin polyklonale antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnologies, (Santa Cruz, CA). Muse monoklonalt anti-p120 catenin antistof blev købt hos BD Biosciences, (San Jose, CA). Frosne menneskelige kolon tumor prøver og ikke-maligne væv blev opnået fra Cooperative humant væv Network, Vanderbilt University Medical Center (Nashville, TN). 44 prøver blev udvalgt på grundlag af tumor type og procent tumor celle indhold ( 80%) sammen med 37 normale væv. Disse undersøgelser blev evalueret af University of Arizona mennesker Protection Program og vurderet til at være fritaget, da prøverne blev de-identificeret.

QRT-PCR

Total RNA blev ekstraheret fra væv ved hjælp TRIZOL ifølge fabrikantens protokol (Life Sciences). 500 ng af total RNA blev revers-transkriberet ved anvendelse af et cDNA-syntese kit (Bio-Rad, Hercules, CA). QPCR blev udført med Taqman qPCR mix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD) og forhåndsudformede TaqMan-primere og prober (alle fra Applied Biosystems /Life Technologies) ifølge fabrikantens protokol med iCycler CFX96 (Bio-Rad). Den qPCR Målingen blev vurderet på grundlag af den relative kvantificering af CTTN gen normaliseret til ekspression af GAPDH. Dataene blev udtrykt som ACt værdier og Students t-test blev anvendt til at analysere data.

Immunhistokemi

Tyktarmskræft væv vifte af paraffin indlejret prøve kerner blev opnået fra US BioMax Inc (Rockville, MD). Phosphospecifikt anti-pTyr

421 cortactin og totale cortactin antistoffer blev anvendt til immunfarvning. Objektglassene blev deparaffineret, skyllet med phosphatbufret saltvand (PBS; pH 7,4) og blokeret med gedeserum (Santa Cruz). De blev derefter inkuberet med de primære antistoffer i 4 timer ved 4 ° C. Objektglassene blev vasket og derefter inkuberet med gede-anti-kanin-HRP-konjugeret antistof (Santa Cruz) ved stuetemperatur i 1 time. Objektglassene blev fremkaldt med en DAB-substrat kit (Vector Labs) og modfarvet med hematoxylin.

Cell overflade biotinylering

Apikal celleoverflade biotinylering blev udført som tidligere [29] beskrevne. Kort fortalt blev 2 × 10

5 T84 tyktarmscancerceller podet på Transwell filtre (Corning Incorporated) og dyrket i 5 -7 dage indtil monolag modstand nået mindst 600 Ω

Cm

2. Celler blev derefter behandlet med curcumin (50 uM) eller dimethylsulfoxid (DMSO, køretøj) på den apikale side i 1 time. Overfladeproteiner blev biotinyleret ved anvendelse af 0,5 ml NHS-S-S-biotin (Pierce; Rockford, IL) i PBS i 30 minutter ved 4 ° C ved den apikale side. Efter standsning, blev filtre udskåret og celler blev lyseret med 0,5 ml RIPA lysis buffer indeholdende protease og phosphataseinhibitorer (Halt protease /phosphatase inhibitor cocktail, Pierce). Lyserede prøver blev kortvarigt lydbehandlet og centrifugeret ved 13.000 rpm i 10 min ved 4 ° C, og supernatanten blev opsamlet og anvendt til proteinanalyse og træk-down eksperimenter. Biotinylerede proteiner blev trukket ned med streptavidin-agarose-perler (Pierce). Bundne proteiner blev elueret ved inkubering af perlerne i radioimmunudfældning assaypuffer (RIPA; 50 mM Tris HCI, pH 7,42, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% Na-deoxycholat, protease og phosphatase inhibitor cocktails, og phenylmethylsulfonylfluorid) ved 98 ° C i 5 min. Prøverne blev centrifugeret ved 10.000 rpm i 5 minutter, og supernatanten blev skilt fra og blandet med 0,125 ml trichloreddikesyre (TCA), inkuberet i 10 minutter på is og centrifugeret ved 14.000 rpm i 5 min. Supernatanter blev kasseret, og pellets vaskes tre gange med iskold acetone. Pellets blev lufttørret og protein kvantificeres før det blev bearbejdet til MS-analyse. For immunoblotting blev proteiner separeret ved SDS-PAGE, efterfulgt af immunblotting med anti-cortactin antistof. Selv lastning af biotinylerede overfladeproteiner blev bekræftet med gede polyklonalt anti-transferrin receptorantistof (Santa Cruz).

Protein identifikation ved kvadrupol flyvetid tandem-massespektrometri (QTOF MS /MS)

Fire hundrede nano gram cellemembran-associerede proteiner, opnået som beskrevet ovenfor, blev behandlet for tryptisk fordøjelse og analyseret ved væskekromatografi-massespektrometri ved Arizona Proteomics Consortium delt facilitet. QTOF MS /MS-analyse af trypsin spaltede proteiner blev udført ved anvendelse af en quadrupol time-of-flight massespektrometer (QTOF; Waters Q-TOF Premier, 2008). Peptider blev elueret under anvendelse af Vydac C18 (Hesperia, CA), under anvendelse af en gradient af 0-65% opløsningsmiddel (98% methanol /2% vand /0,5% myresyre /0,01% trifluoreddikesyre) over en 60-minutters periode ved en strømningshastighed på 350 nl /min. Peptidopløsningen udsprøjtes ved et potentiale på 1,6 kV, og den kapillære temperatur ved 200 ° C. Afhængig scanning data blev udført ved Xcalibur v 2,0 SR2 software [30] med en standard gebyr på 2, en isolation bredde på 1,5 amu, en aktivering amplitude på 35%, aktiveringstid på 30 msek, og en minimal signal på 10.000 ion tællinger . Globale afhængige indstillinger data var som følger: afvise masse bredde på 1,5 amu, dynamisk udelukkelse aktiveret, gentag optælling af en, gentag varighed på 1 min, og varigheden af ​​5 min udstødelse. Scan begivenhed serien omfattede en fuld scanning med masseinterval 350 – 2000 Da, efterfulgt af 3 afhængige MS /MS scanninger af den mest intense ion. Dynamisk udelukkelse blev tændt i en periode på 60 sek. Tandem MS-spektre af peptider blev analyseret med Turbo SEQUEST ™ v 3.1, et program, der giver korrelationen af ​​eksperimentelle tandem MS-data med teoretiske spektre dannet fra kendte proteinsekvenser. De søgekriterier, som blev brugt til en foreløbig positiv peptid identifikation er de samme som tidligere beskrevet, nemlig peptid precursor ioner med et en afgift med en Xcorr 1,8, 2 Xcorr 2,5 og 3 Xcorr 3.5. En DCN score 0,08 og et fragment ion forholdet eksperimenterende /theorical 50% blev også brugt som filtrering kriterier for pålidelig matchede peptid identifikation [31]. Alle matchede peptider blev bekræftet ved visuel undersøgelse af spektrene. Alle spektre blev søgt mod ipiHuman 3,72 protein database, der deri har sekvensen af ​​

Rhodobacter

og bovint serumalbumin. Normalt er bovint serumalbumin tilsat som reference protein, men da bovint og humant serumalbumin er ens, vi bruges T33V mutant sekvens af

Rhodobacter

. Stillads (version Scaffold_3.1.2, Proteome Software Inc., Portland, OR) blev anvendt til validering MS /MS baseret peptid og protein identifikationer. Peptid identifikationer blev accepteret, hvis de kunne etableres på mere end 90,0% sandsynlighed som angivet af peptid profeten algoritmen [30]. Protein identifikationer blev accepteret, hvis de kunne etableres på mere end 90,0% sandsynlighed og indeholdt mindst én identificerede peptid. Protein sandsynligheder blev tildelt af Protein profeten algoritmen [32]. Proteiner, der indeholdt lignende peptider og kunne ikke differentieres på grundlag af MS /MS-analyse alene var grupperet at overholde principperne om sparsommelighed.

Western blotting og immunopræcipitering

De proteinlysater opnået fra kolon tumorvæv og coloncancer cellelinier blev fremstillet med RIPA-buffer. De for-klaret proteinprøver blev kvantificeret [DC (detergent-kompatible) kolorimetrisk proteinassaykit; Bio-Rad], og prøver blev separeret ved SDS-PAGE efterfulgt af immunblotting. Blottene blev visualiseret med SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce). For immunopræcipitation blev celler lyseret med RIPA-buffer og protein blev kvantificeret med en DC proteinassaykit (Bio-Rad). 5 ug af anti-pTyr

421 cortactin antistof blev tilsat til 1 mg HCT-116-cellelysater ved 4 ° C og inkuberet natten over. Prøverne blev derefter inkuberet med A /G-protein agaroseperler (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i 1 time ved 4 ° C. Immunoblotting blev udført fra de vaskede og denaturerede komplekser.

Immunofluorescens

Celler blev dyrket i EZ-kamre (Millipore), og behandles med curcumin ved 50 uM koncentration i 15 minutter og blev fikseret med 2 % paraformaldehyd i 0,2 M phosphatpuffer, pH 7,4 (45 min), permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i PBS (10 min) og inkuberet sekventielt med anti-phospho cortactin (Millipore) eller anti-cortactin antistof (Santa Cruz) . The Alexa Fluor 647 ged anti-kanin IgG, (Life Technologies) blev anvendt som sekundært antistof. Objektglassene blev monteret ved hjælp af fluorescens montering medium (Dako, Carpinteria, CA) og blev undersøgt med et Zeiss konfokal mikroskop udstyret med ZEN software (Carl Zeiss Microscopy, GmbH)

PTPB1B /PTPN1 aktivitet assay

HCT 116 celler blev dyrket indtil konfluens og behandlet med curcumin eller DMSO (vehikel) i medier i 30 min. Celler blev vasket med PBS og lyseret med RIPA-buffer, lydbehandlet i 5 sekunder, centrifugeres, og analyseret for proteinkoncentration. En PTPB1B Assay Kit blev opnået fra Millipore og anvendt ifølge producentens anvisninger.

Sekventering af PTPN1 kodende region

Totalt RNA blev ekstraheret fra HCT116, HT29, og SW480 celler under anvendelse TRIZOL (Life Technologies ) ifølge producentens instruktioner, revers transkriberet under anvendelse af et cDNA syntesekit (Quanta), og amplificeret under anvendelse af fremadrettet primer, 5′-ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCG-3 ‘og revers primer, 5′-CTATGTGTTGCTGTTGAACAGGA-3’ (baseret på Gene tiltrædelse NM_002827.2 ) og

Pfu

Taq DNA-polymerase (Life Technologies). PCR-produkter blev geloprenset, subklonet i pGEM-T Easy (Promega, CA), og sekventeret fra 5′- og 3′-enderne under anvendelse af T7 og SP6 sekventeringsprimere.

cellemigrationsassay

Transwell migration assay blev udført som rapporteret tidligere [33] med mindre modifikationer. Kort fortalt Transwell membran (24-brønds insert porestørrelsen 8 um, polycarbonat, Corning Inc, NY) blev anvendt til at bestemme virkningen af ​​curcumin på tyktarmskræft cellemigration

in vitro

. Cellerne blev trypsiniseret, vasket og holdes suspenderet i medium uden FBS. Til de nedre brønde på kamre, migration-inducerende medium (med 10% FBS) blev tilsat. Øvre brønde blev fyldt med serum-frit medium med celler (20.000 celler pr brønd) i nogle tilfælde, også indeholdende 25 pM af curcumin. Derefter blev kammeret anbragt i en befugtet CO

2 incubator. Efter 12 timer blev assays stoppet ved fjernelse af mediet fra de øvre brønde og fjernelse af filtrene. Filtre blev fikseret med methanol ved kortvarig nedsænkning og celler fra oversiden blev fjernet ved vask med PBS. Filtrene blev farvet med krystalviolet-farvning (0,2%, vægt /vol med ethanol 2%, v /v, i 0,5 M Tris-HCl, pH 7,8) i 10 minutter ved stuetemperatur. Den farvede cellelag blev skyllet grundigt med 0,5 M Tris-HCl (pH 7,8) tre gange, Filtrene blev lufttørret, inkuberet med 500 pi SDS-opløsning (0,5% i 50% ethanol, 50% 0,5 M Tris-HCl, pH 7,8 ) i 60 minutter ved 37 ° C, og aflæst ved 586 nm med et spektrofotometer (Molecular Devices, CA). Til ad CTTN transducerede celler, 24 timer efter infektion med Ad-CTTN (10 MOI) blev cellerne trypsiniseret, vasket med PBS og tilsat til den øvre side af Transwell kammer, og assays blev udført som beskrevet ovenfor.

Kemisk syntese af biotinyleret curcumin

Reaktioner blev udført ved anvendelse flammetørret glasudstyr under et positivt tryk af argon. Hydroskopisk opløsningsmidler blev overført

via

en ovntørret sprøjte eller kanyle. Alle reagenser og opløsningsmidler var kommercielt tilgængelige og blev anvendt som modtaget. Opløsninger blev opkoncentreret

i vakuum

anvendelse af en rotationsfordamper. Analytisk tyndtlagskromatografi (TLC) blev udført på præcoatede silicagel 60 F-254 glasplader. TLC visualisering kræves anvendelse af en iod kammer, UV-lys, og /eller PMA-opløsning (5 g phosphormolybdensyre, 100 ml 95% EtOH) til farvning. Flash og tyngdekraft-kromatografi blev udført under anvendelse af silicagel 60 (230-400 mesh). Smeltepunkter er ukorrigerede. Kernemagnetisk resonans (NMR) blev udført på en 500 MHz spektrometer. NMR-spektre blev refereret til CD

3OD (3,31 ppm, 49,0 ppm). Massespektrometri blev udført ved hjælp af ESI på en Bruker Daltonics MALDI TOF instrument.

N- (13-Amino-4,7,10-trioxatridecanyl) biotinamid (2).

Til en varm opløsning biotin (0,24 g, 1,0 mmol) og

N

-hydroxysuccinamide (0,12 g, 1,0 mmol) i DMF (8 ml) blev der tilsat DCC (0,26 g, 1,3 mmol), og reaktionsblandingen blev omrørt natten over ved stue temperatur. De faste stoffer blev fjernet ved filtrering, vasket med DMF (2 ml), og filtratet (~ 10 ml) tilsat dråbevis til en omrørt opløsning af 4,7,10-trioxa-1,13-tridecandiamin (2,20 g, 10,0 mmol, 2,2 ml) i DMF (20 ml). Efter 3 timer blev opløsningsmidlet fjernet under reduceret tryk. Den resulterende olie blev findelt med ether (50 ml), og blandingen blev omrørt i 30 min. Det faste stof blev opsamlet ved filtrering og underkastet flash-søjlekromatografi på silicagel (50 g). Eluering med methanol /EtOAc (04:01) gav 2 (0,38 g, 0,85 mmol, 85% over to trin) som et farveløst fast stof, smp 104-106 ° C, R

f

0,36 ( MeOH /EtOAc /vandig. NH

4OH 08:02:01). Den

1 H og

13C NMR-spektre var i overensstemmelse med offentliggjorte data [34].

5,21-Dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oic Syre (3).

Til en opløsning af 2 (0,38 g, 0,85 mmol) i methanol (4 ml) blev tilsat glutarsyreanhydrid (0,12 g, 1,02 mmol), og blandingen blev omrørt natten. Opløsningsmiddel blev fjernet under reduceret tryk, og resten blev udsat for flashsøjlekromatografi på silicagel (50 g). Eluering med CH

2Cl

2 (200 ml) efterfulgt af CH

2Cl

2 /MeOH (05:01) gav 3 (0,40 g, 0,71 mmol, 84%) som et hvidt fast stof, mp 124-126 ° C, R

f

0,42 (CH

2Cl

2 /MeOH 01:01).

1H NMR (500 MHz, CD

3OD) δ 1,44 (2, m), 1,56-1,70 (4, m), 1,70-1,78 (6, m), 1,88 (2, kvintet,

J

= 7,5 Hz), 2,18-2,25 (4, m), 2,32 (2, m), 2,70 (2, m), 2,93 (2, dd,

J

= 8 Hz, 5 Hz), 3,19-3,21 (2, m), 3,25 (4, t,

J

= 7 Hz), 3,52 (4, m), 3,59 (5, m), 3,64 (5, m) , 4,30 (1, m), 4,49 (1, m);

13C NMR (125 MHz, CD

3OD) δ 22,3, 26,8, 29,5, 29,7, 30,4, 34,2, 36,1, 36,8, 37,8, 41,0, 56,9, 61,26, 63,3, 69,9 (2), 71,2, 71,5 , 166,1, 175,2, 175,9, 176,8; HRMS (MALDI TOF) beregnet for C

25H

45N

4O

8S 561,2952, observeret 561.2930.

4-((1E,6E)-7-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,5-dioxohepata-1,6-dien-1-yl)-2-methoxyphenyl-5,21-dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oate (4).

Til en opløsning af 3 (100 mg, 0,18 mmol) i DMF (2 ml) blev tilsat

N

-hydroxysuccinamide (21 mg, 0,18 mmol) efterfulgt af DCC ( 48 mg, 0,23 mmol), og reaktionsblandingen blev omrørt natten over ved stuetemperatur. Faststoffer blev fjernet ved filtrering, vasket med DMF (2 ml), og filtratet (-4 ml) tilsat dråbevis til en omrørt opløsning af curcumin (330 mg, 0,89 mmol) og triethylamin (45 mg, 0,44 mmol, 62 pi) i DMF (10 ml). Reaktionsblandingen blev omrørt natten over ved stuetemperatur og flygtige stoffer fjernet under reduceret tryk. Resten blev underkastet flash-søjlekromatografi på silicagel (75 g). Eluering med CH

2Cl

2 (200 ml) og CH

2Cl

2 /MeOH (50:1, 200 ml) gav curcumin. Yderligere eluering med CH

2Cl

2 /MeOH (20:01), efterfulgt af fjernelse af opløsningsmidler gav 4 som en mørkegul gummi, der blev opløst i 20% acetontrile i vand, og opløsningen frysetørres. Biotinyleret curcumin derivat 4 (78 mg, 0,085 mmol, 48% udbytte over de to trin) blev opnået som et fnugget mørkegult fast stof, R

f

0,68 (CH

2Cl

2 /MeOH 05:01). ESI-MS: 911,2 (M + H

+). Den

1H NMR-spektret var i overensstemmelse med publicerede data [35].

Statistisk analyse

blev udnyttet Uparret t-test til statistisk analyse i hele.

Resultater

pTyr

421cortactin udtryk øges i primære tyktarmskræft væv

Overekspression af cortactin er blevet fundet i invasive kræftformer, herunder glioblastom, melanom, brystcancer, og hoved og hals pladecarcinomer, som følge af den EMS1 genamplifikation [36]. I denne undersøgelse undersøgte vi cortactin ekspression i colon cancer. Vi analyserede først cortactin mRNA-ekspression i 81 frosne colon vævsprøver, som omfattede 37 normale væv, 5 godartet og 39 maligne tumorer, ved kvantitativ RT-PCR. Colontumorer og tilstødende normale væv viste ingen forskel i cortactin mRNA-ekspression (figur 1A). Vi observerede ingen signifikant forskel mellem CTTN mRNA-ekspression i normale væv og colon tumorprøver (Fig 1B). Dernæst undersøgte vi 19 matchede par af kolon tumorprøver til cortactin proteinekspression ved western blot. 14/19 (73%) viste forhøjede niveauer af pTyr

421 cortactin og total cortactin (fig. 1C, venstre panel), 2/19 prøver viste reduceret ekspression af begge former (pTyr

421 og total) af cortactin og 3/19 udviste ingen ændring (data ikke vist). Immunohistokemisk analyse af vævsarrays med 6 normale sektioner og 18 colontumor sektioner viste intens membran farvning af pTyr

421 cortactin og total cortactin i 13/18 tumorprøver analyseret sammenlignet med normale vævssnit, som eksemplificeret i fig. 1D. Vi undersøgte også cortactin fosforylering på Tyr

482 og Tyr

470 i kolon tumor prøver. Vi fandt, at i 50% af de analyserede maligne væv, der var en forøget ekspression af pTyr

482 sammenlignet med matchede kontroller (data ikke vist). Men phosphorylering på dette site blev ikke påvirket af curcumin i HCT116 celler (ikke vist), og siden Oser et al [37]. vist, at pTyr

482 ikke bidrager til reguleringen af ​​antallet af frie pigtråd ender i invadopodia, vi ikke forfølge dette websted yderligere. Vi var i stand til pålideligt at analysere ekspressionen af ​​pTyr

470 i tumor prøver med eventuelle kommercielt tilgængelige antistoffer.

(A) Samlet RNA blev ekstraheret fra frosne prøver af normal og tumorvæv og cortactin mRNA ekspression blev bestemt anvendelse af kvantitativ RT-PCR. De kassediagrammer skildrer relative mængder af cortactin normaliseret til GAPDH i normale og tumorvæv (n = 37 for normale prøver, n = 44 for tumor prøver). (B) DNA-gelanalyse af PCR-produkter opnået fra qPCR analyse (repræsentativt for 37 normale væv, 5 benigne tumorer og 39 maligne tumorer). (C) vævet lysater af matchede par (N-normale, M-maligne) af colon prøver fremstillet ud fra de samme tumorprøver som i (A) blev analyseret ekspressionen af ​​pTyr

421-cortactin (pTyr

421 -CTTN) og total cortactin ved Western blotting. Repræsentative resultater er vist fra tre matchede par. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (D) Repræsentant pTyr

421-cortactin og total cortactin immunfarvning af colon tumor prøver. Vævsarray indeholdende en række tyktarmskarcinomer blev farvet for pTyr

421-CTTN og total cortactin. Farvningen var for det meste cytoplasmatisk for total cortactin, mens pTyr

421-CTTN viser øget farvning intensitet ved plasmamembranen.

Misforhold mellem uændret mRNA-ekspression og forhøjede niveauer af total og phosphoryleret cortactin udelukkede mulighed for genamplifikation og foreslog mulige posttranslationel modifikation (er) og ændringer i protein stabilitet i kolorektale tumorer.

ændringer i celleoverfladen biotinylerede proteiner efter curcumin behandling i T84 celler

T84 tyktarmscancerceller er blevet grundigt anvendt til at undersøge biogenesen af ​​epitelcelle polaritet [38] og danner godt polariserede og stramme monolag ved dyrkning på en semipermeabel filter support. Vi først undersøgt fordelingen og virkningerne af curcumin på de store membranassocierede proteiner i T84-monolag. At reproducere eksponering for oralt administreret (eller diætetisk) curcumin blev celler behandlet med forbindelsen eller DMSO (vehikel) på den apikale side. Den apikale membran og membran-associerede proteiner blev derefter biotinyleret, trukket ned med streptavidin-konjugeret agarose og analyseret ved LC-MS /MS. Resultaterne af disse forsøg er opsummeret i fig. 2. 56-proteiner blev identificeret ved LC-MS /MS. 13/56 viste nedsat overflade eller overflade-associeret ekspression i området fra 20-80% ikke i curcumin-behandlede celler sammenlignet med DMSO-kontrol (p 0.0001- p 0,05) (Fig 2A). Kun ét protein [isoform 1 af leucin rige repeat (i FLII) interagerende protein 2, LRRFIP2) viste forøget ekspression (data ikke vist). Selvom funktionen af ​​LRRFIP2 er ikke helt klart, har én rapport vist, at det spiller en vigtig rolle som en aktivator af den kanoniske Wnt signalvejen i association med segment polaritet protein pjusket homolog DVL-3, opstrøms for β-catenin (CTNNB1) , hvilket fører til en stabilisering af sidstnævnte [39]. Med henblik på denne undersøgelse har vi fokuseret på de nedsat mængde cortactin som respons på curcumin behandling, fordi det ofte overudtrykkes i cancere og det er blevet rapporteret at øge tumorcellemigration og invasion [40]. Fig. 2B afbilder nedregulering af cortactin i membranassocierede proteinfraktion fra curcumin-behandlede celler, en observation bekræftes ved western blotting i celler behandlet med 50 pM ved den apikale side i 1-4 timer (fig. 2C). Transferrin receptor (CD71), bruges her som en kontrol, viste ingen ændring, der ligner vores tidligere rapport [29].

(A) Tabel med 13 plasma membran-associerede proteiner identificeret ved QTOF-MS /MS som faldt betydeligt i T84-cellemonolag behandlet med curcumin. Dataene viser gennemsnitlige antal unikke peptider identificeret fra tre forskellige eksperimenter ± SD. (B) Kvantitativ analyse af cortactin ekspression i T84-celler ved M /S. Frekvensbehovene værdier blev opnået fra tre forskellige eksperimenter. Kvantificering data for cortactin protein blev afledt fra M /S ved hjælp Stillads proteomanalyse software (version Scaffold_3.1.2). Dataene er midler ± SE, *

s

0,05 sammenlignet med ubehandlede celler, Students t-test. (C) Bekræftelse af CTTN proteinekspression ved western blotting med biotinyleret celleoverfladeprotein fraktion fremstillet fra T84 celler behandlet med DMSO (CTRL) eller 50 pM curcumin i 1-4 timer. CD71 (transferrin receptor) blev anvendt som en loading kontrol. CTRL repræsenterer celler behandlet med DMSO i 4 timer.

Dephosphorylering af pTyr

421-Cortactin af Curcumin

Et veldefineret mekanisme bestemme afvigende migration af kræftceller medieres af GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (B). (C). (D). Som vist i fig.