PLoS ONE: MIR-187 Mål Androgen-Reguleret Gene ALDH1A3 i prostatakræft

Abstrakt

miRNA forventes at kontrollere aktiviteten på ca. 60% af alle protein-kodende gener, der deltager i reguleringen af ​​flere cellulære processer og sygdomme, herunder kræft. Vi har for nylig demonstreret, at MIR-187 er betydeligt nedreguleret i prostatacancer (PSA) og her vi foreslå en proteomisk tilgang til at identificere sine potentielle mål. Til dette formål blev PC-3-celler transient transficeret med MIR-187 precursor og miRNA mimic negativ kontrol. Proteiner blev analyseret ved en todimensional forskel gelelektroforese (2D-DIGE) og defineret som differentielt reguleret, hvis den observerede fold ændring var ± 1,06. Derefter blev MALDI-TOF MS analyse udført efter protein fordøjelse og lav hyppighed proteiner blev identificeret ved LC-MS /MS. Peptider blev identificeret ved at søge mod ExPASy SWISS PROT-databasen og målvalidering blev udført både in vitro ved western blot og QRT-PCR og i kliniske prøver ved QRT-PCR, immunohistokemi og ELISA. DIGE analyse viste 9 differentielt udtrykte pletter (p 0,05) og 7 viste en nedreguleret udtryk på miR-187 re-introduktion. Blandt disse mål vi identificeret aldehyddehydrogenase 1A3 (ALDH1A3). ALDH1A3 udtryk var signifikant nedreguleret i PC3, LNCaP og DU-145 celler efter miR-187 re-introduktion. Støtte disse data blev ekspression af ALDH1A3 fundet signifikant (p 0,0001) opreguleret i PCA prøver og omvendt korreleret (p 0,0001) med miR-187 udtryk, dens udtryk er direkte forbundet med Gleason score (p = 0,05). Ekspressionen af ​​ALDH1A3 blev målt i urinprøver at vurdere prognosemuligheder af denne biomarkør for tilstedeværelsen af ​​PCa og på et Betydning niveau på 10%, PSA og også ALDH1A3 var signifikant associeret med en positiv biopsi af PSA. Som konklusion vore data illustrerer for første gang rollen som ALDH1A3 som MIR-187 target i PCa og give indsigt i nytten af ​​anvendelse af dette protein som ny biomarkør til PCA

Henvisning:. Casanova-Salas I, Masiá E, Armiñán A, Calatrava A, Mancarella C, Rubio-Briones J, et al. (2015) MIR-187 Mål Androgen-Reguleret Gene

ALDH1A3

i prostatakræft. PLoS ONE 10 (5): e0125576. doi: 10,1371 /journal.pone.0125576

Academic Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: Oktober 20, 2014 Accepteret: 25 marts 2015; Udgivet: 13. maj 2015

Copyright: © 2015 Casanova-Salas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data fra microarray analyse er tilgængelige på NCBI Gene Expression Omnibus database tiltrædelse nummer GSE45604

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Instituto de Salud Carlos III PI10 /01206, FPI11 /00505, Madrid, FPI (CTQ2007-60601; CTQ2011-18195) fra spanske ministerium for videnskab og uddannelse, og fra det italienske ministerium for forskning og undervisning (FIRB projekt nummer: RBAP11884 M_005), den italienske sammenslutning for Cancer Research (Katia Scotlandi-AIRC Project N.14049). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft død hos mænd [1]. Cirka en ud af tre mænd over en alder af 50 år viser histologiske tegn på PSA. Imidlertid vil kun 10% af disse blive korrekt diagnosticeret med klinisk signifikant PCa [2]. PSA niveauer kombineret med digital rektal eksamen (DRE) er de vigtigste kriterier for PCa diagnosen, men ofte føre til over diagnose og overbehandling [3]. Derfor er identifikation af nye biomarkører, i stand til at forbedre diagnose og registrering af potentielt aggressiv PCa, er nødvendig for at bedre kliniske støtte beslutninger.

miRNA er en klasse af små ikke-kodende RNA-molekyler, der består af 19-22 nukleotider; de er involveret i en række biologiske processer, herunder udvikling, differentiering, apoptose og celleproliferation. miRNA regulere genekspression gennem translationel undertrykkelse og mRNA spaltning af mere end 60% af protein kodning gener [4, 5]. Flere undersøgelser tyder på, at en person miRNA kan regulere hundredvis af mål [6], og kan fungere enten som en tumor suppressor eller onkogen, afhængigt af målgener [7], samt bidrage til initiering og udvikling af forskellige former for kræft, herunder PCa [5].

Brug miRNA microarray analyse (NCBI Gene Expression Omnibus database tiltrædelse nummer GSE45604), vores gruppe identificeret miR-187 som en tumor suppressor miRNA i PCa [8]. Selv om dens anvendelighed er blevet påvist i den diagnostiske indstilling, til dato ingen eksperimentelt bekræftet mål for miR-187 er blevet identificeret i PSA. De fleste beregningsmæssige algoritmer forudsiger miRNA mål baseret primært på sekvens komplementaritet mellem 5′-enden af ​​den modne miRNA og 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af target mRNA; men disse algoritmer giver forholdsvis høje både falsk positive og falsk negative [6]. Desuden er det kendt, at mere end 25% af eksperimentelt validerede mål ikke kan forudsiges af nogen af ​​de mest almindelige miRNA target forudsigelse software [9]. Derfor er et presserende behov for genekspression og proteomisk screening tilgange til eksperimentelt identificere miRNA targets.

Denne undersøgelse brugt en proteomisk tilgang baseret på todimensional gelelektroforese (2D-DIGE) efterfulgt af matrix-assisteret laser desorption-ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) analyse og, for første gang, identificeret

ALDH1A3

som miR-187 mål i PSA. Desuden blev den potentielle anvendelighed af ALDH1A3 som en tumor biomarkør evalueret.

Materiale og fremgangsmåder

2.1. Kliniske prostata prøver

Formalin-fikseret og paraffin-embedded (FFPE) blokke svarende til 195 PCA patienter blev hentet fra arkivet i Biobank af

Fundación Instituto Valenciano de Oncología

udføre følgende inklusion kriterier: prøver taget fra radikale retropubisk prostatektomi mellem 1996 og 2002, og ingen historie tidligere behandling for PCa (herunder androgen deprivation terapi eller kemoterapi før kirurgi). Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke til vævsdonation til forskningsformål før vævet indsamling, og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for Fundación Instituto Valenciano de Oncología (ref. Nummer. 2010-19). Eksklusionskriterier omfattede tidligere behandling eller tilstedeværelsen af ​​andre tumorer sammen med unacceptance af donation samtykke. De kliniske data blev revideret fra kliniske journaler og opbevares i en PCa-specifik database. Patientkarakteristika og demografiske er vist i tabel 1. Gleason score blev ensartet vurderet af samme patolog (AC). Til sammenligning og kalibreringsformål, 8 prøver af normal prostata væv opnået fra patienter, der gennemgår radikale cystectomies uden patologiske symptomer på prostata sygdom blev også analyseret.

Ti friske vævsprøver fra histologisk bekræftet PCa blev hentet fra arkiverne af biobanken fra Hospital Clínico Universitario de Valencia (INCLIVA) til validering. Total urinprøver blev opnået efter DRE og umiddelbart før diagnostisk nålebiopsi fra en uafhængig kohorte af 123 mænd med mistanke om PCa, fra hvem 63 fører til en positiv biopsi.

2.2. Cellelinier og miRNA transfektion

PC-3, LNCaP, DU-145, og 22RV1 blev dyrket i RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Life Technologies, CA, USA), mens VCap PCa-afledte celler blev dyrket i DMEM (ATCC, Middlesex, UK) medium, med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml Penincillin og 0.1ug /ml streptomycin ved standardbetingelser celledyrkningsbetingelser (37 ° C i 5% CO

2 i en befugtet inkubator). MIR-187, som tidligere er blevet fundet at være nedreguleret i PCa [8], blev analyseret i disse cellelinjer ved QRT-PCR som beskrevet nedenfor.

PC-3, LNCaP og DU-145-celler blev transient transficeres ved anvendelse siPORT NeoFX Transfektion Agent (Applied Biosystems, Life Technologies, Californien, USA), med 40nm precursorer af mIR-187 (HSA-mIR-187-3p miRNA mimic) og miRNA efterligner negativ kontrol 1 #, ifølge fabrikantens protokol (Applied Biosystems, Life Technologies, Californien, USA). Celler blev høstet 72 timer efter transfektion og cellelevedygtighed blev målt til at vurdere dets toksicitet under anvendelse af CellTiter 96 Aqueous ikke-radioaktivt celleproliferationsassay (Promega, Wisconsin, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

2.3. Identifikation af målgener for MIR-187

Proteiner fra MIR-187 mimic versus miRNA efterligner negativ kontrol 1 # transficerede PC-3-celler blev analyseret ved todimensional forskel gelelektroforese (2D-DIGE). Kort fortalt blev proteiner i de to sammenlignede grupper præcipiteret under anvendelse af 2-D Clean-up kit (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Prøver blev derefter resuspenderet i DIGE farvning buffer DIGE (7M urinstof, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 20 mM Tris) og kvantificeret under anvendelse Bradford protein assay (BioRad, Hercules, CA, USA). Prøver blev mærket med 400 pmol /50 ug protein med CyDye DIGE Fluor fluorophorer Cy3 og Cy5 (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA) som anbefalet af producenten. En pulje indeholdende lige mængder af alle prøver blev også fremstillet og mærket med Cy2, der skal anvendes som en intern standard på alle geler til støtte billede matching og cross-gel statistisk analyse. Seks biologiske gentagelser af hver transficeret prøve blev udført, og seks geler blev dannet i alt. Proteinadskillelse blev udført ved todimensional elektroforese. I den første dimension blev proteiner separeret efter deres isoelektriske punkt på immobiliseret 24 cm lineær pH-gradient (IPG) strimler (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA), rehydreret i rehydrering buffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% CHAPS, 0,5% IPG puffer, 50 mM DTT) natten over. I den anden dimension blev proteinerne separeret ifølge molekylvægten i 25 cm x 21 cm x 1 mm 12,5% acrylamidgeler. De geler blev scannet med en Typhoon 9400 Variabel tilstand Imager (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA) og de efterfølgende gel billeder blev importeret til Analysis Software i DeCyder Differential. Proteiner blev defineret som forskelligt reguleret, hvis det observerede fold ændring var ± 1,06 (

s

0,05) mellem miRNA efterligner negativ kontrol 1 # transficeret PC-3 og miRNA-187 efterligner transficerede PC-3. Protein fordøjelse blev udført med sekventering trypsin (Promega, Wisconsin, USA) som beskrevet andetsteds [10]. MALDI-TOF MS analyse blev derefter udført under anvendelse af 0,5 pi fordøjelse blanding plettet på MALDI målplade. Efter lufttørring dråberne ved stuetemperatur, 0,5 pi matrix [5 mg /ml CHCA (Sigma, St.Louis, MO, USA) i 0,1% TFA-ACN /H2O (1: 1, vol /vol)] var tilsat og lodes lufttørre ved stuetemperatur. En kendt prøve blev behandlet på samme måde som kvalitetskontrol. De resulterende fraktioner blev analyseret i en 4700 Proteomics Analyzer (ABSciex, Framingham, MA, USA) i positiv reflectron mode (2000 skud hver position). Lav hyppighed proteiner blev identificeret ved LC-MS /MS under anvendelse af en fælde søjle (nanoLC Column, 3μ C18-CL, 75 μ mx 15cm, Eksigen, Dublin, CA, USA) gennem en isokratisk flux på 0,1% TFA ved 2 μ L /min under 10 min. Når peptider blev koncentreret i den præ-kolonnen de blev elueret i den analytiske søjle (LC Column, 3 μ C18-CL, 75um x 25 cm, Eksigen, Dublin, CA, USA) for at separere. Peptider blev endelig elueret under anvendelse af en 5a 40% B-gradient over 30 min, til en nanoESI QqTOF massespektrometer (5600 TripleTOF, ABSciex, Framingham, MA, USA). Oplysningerne fra MS og MS /MS blev analyseret med Paragon algoritmen, Protein Pilot Software (ABSciex, Framingham, MA, USA). Peptiderne blev identificeret ved hjælp af oplysningerne i tandem massespektre ved at søge mod ExPASy SWISS PROT database.

2.4. Western Blotting af ALDH1A3

For in vitro-validering, transfekterede PC-3, LNCaP og DU-145 celler med miR-187 efterligner eller miRNA efterligner negativ kontrol (72 timer) blev høstet, skyllet med PBS og derefter lyseres med iskold lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH = 8, 150 mM NaCl, 0,02% NaN

3, 0,1%, natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Nonidet P-40 (NP40), 0,5% deoxycholsyre (DOC), proteaseinhibitorcocktail tabletter (1 ×). Cellelysater blev centrifugeret ved 10.000 rpm i 10 min ved 4 ° C blev supernatanten blandes derefter med 5 × SDS-prøvebuffer, kogt i 5 minutter og separeret ved 12% SDS . -side geler efter elektroforese blev proteinerne overført til nitrocellulosemembraner ved elektroforetisk overførsel membranerne blev blokeret i 5% skummetmælk i 1 time, skyllet og inkuberet natten over ved 4 ° C med de primære antistoffer:. ALDH1A3 (Novus Biologicals, Littleton , CO, USA; 1: 500 fortynding) og β-actin (Millipore, Billerica, MA, USA; 1:. 200000 fortynding) Overskydende antistof blev derefter fjernet ved vask af membranen i PBS /0,1% Tween 20, og membranerne var inkuberet i 1 time med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer: gede-anti-muse IgG eller æsel anti-kanin IgG (1: 10000) (GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Efter vask i PBS /0,1% Tween 20, blev immun-påvisning udført under anvendelse af forstærket kemiluminescerende (ECL) Western blotting detektionssystem (Euroclone, Milano, Italien) ifølge producentens instruktioner.

2.5. miRNA target reporter assay

PC-3 MIR-187 efterligner eller negativ Kontrolceller blev transficeret med 3’UTR Go Clone Reporter (50 ng) (MNS Genomics, La Hulpe, Belgien) indeholdende 3’UTR-sekvensen af ​​ALDH1A3 klonet nedstrøms for RenSP luciferase reporter eller den tomme vektor indeholdende kun luciferasereporteren hjælp Dharmafect 2 reagens (Dharmacon, GE Healthcare, Piscatawey, NJ, USA). Cellerne blev lyseret og reporter-aktivitet blev målt 24 timer efter transfektion under anvendelse LightSwitch luciferaseassayreagens (koblingsudstyr Genomics).

2.6. RNA-isolering og QRT-PCR

Isolering af RNA fra begge cellelinier og kliniske prøver blev udført under anvendelse Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Technologies, CA, USA). Totalt RNA blev revers transkriberet under anvendelse af TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit og miRNA-specifikke hårnåle-primere (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA) og høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA) i overensstemmelse til producentens angivelser. Derefter, 2 pi af dette cDNA, svarende til 96 PCA tumorprøver, blev amplificeret ved real-time PCR i et slutvolumen på 10 pi pr reaktion på en ABI 7500-hurtig thermocycler anvendelse af mRNA assays (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA). For miRNA evaluering blev 1,33 pi miRcDNA amplificeret i et endeligt volumen på 20 pi. miRNA analyser for RU44 (001.094), RU48 (001.006) og miR-187 (001.193), og mRNA assay for

ALDH1A3

(Hs00167476_m1) blev anvendt (Applied Biosystems, Life Technologies, CA, USA). Alle reaktioner blev udført tre gange. Den relative udtryk for mRNA’er eller miRNA blev bestemt ved anvendelse af middelværdien af ​​de kontrolprøver som kalibrator og efter 2

-ΔΔCt metode [11]. For cellelinje evalueringer blev MIR-187-ekspression analyseret ved QRT-PCR under anvendelse af en universel humane RNA pool (Cat # 740000 Stratagene, La Jolla, CA) som normalisering kontrol.

2.7. Immunhistokemi af ALDH1A3

De samme FFPE PCA blokke anvendt til RNA-analyse blev indarbejdet i 11 væv microarrays (TMA). To eller tre repræsentative områder (1 mm i diameter) af hver tumor blev udvalgt til TMA produktion ved først at undersøge hematoxylin eosin-farvede prostatektomi tumor dias og derefter prøveudtagning vævet fra de tilsvarende paraffinblokke. Et væv microarray instrument (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI) blev anvendt til TMA samling. Fra TMA blokke, blev 3-um-tykke snit underkastet immunhistokemisk farvning under anvendelse af kanin-anti-human ALDH1A3 polyklonalt-Ab (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA; 1:50). Humant prostatavæv blev anvendt som positiv kontrol som anbefalet af producenten. Procentdelen af ​​ALDH1A3-positive celler og den cytoplasmatiske farvningsintensitet blev bedømt semikvantitativt, danner fire grupper (fra 0 til 3). Sager blev scoret som lave ekspressorer når farvningsintensitet var mellem 0 og 1, og høje ekspressorer når intensiteten var 2 og ovenfor.

2.8. ALDH1A3 ELISA

Urinprøver fra 123 patienter med mistanke om PCa blev centrifugeret ved 1000 x g for at fjerne debris. Urinen supernatant blev anvendt til at estimere ALDH1A3 protein niveau ved hjælp af en kvantitativ human sandwich-ELISA-kit (blå Gene Biotech Co. Ltd., Shanghai, Kina). Standarden henvisning var mellem 0 og 50 ng /ml, med intra og inter-assay CV mindre end 10%. Den optiske densitet (O.D) blev bestemt ved 450 nm ved hjælp af en Victor Multilabel Plate Reader (PerkinElmer Life Sciences, Massachusetts, USA).

2.9. Statistisk analyse

For at undersøge prognostiske værdi af

ALDH1A3

gen vi brugte binære variabler afspejler den positive status af foranstaltninger. Sammenhængen mellem

ALDH1A3

udtryk og klinisk-patologiske parametre (kategoriske) blev vurderet ved hjælp af Spearman med betydning behandlet på 5%. Virkningen af ​​biologiske faktorer på BPFS og klinisk PFS blev bestemt ved Kaplan-Meier proportional risiko log rank test [12]. Biokemisk progression blev defineret som serum PSA større end 0,4 ng /ml under opfølgningsperioden og klinisk progression blev defineret som lokale (prostatisk fossa), regionale (lymfeknuder) eller fjernt (metastase) progression. BPFS og kliniske PFS blev anset individuelt fra datoen for kirurgi til datoen for begivenheden. Statistisk analyse blev udført med SPSS version 20.0. Den Students t-test aplying FDR, p-værdi, PCA og hierarkisk klyngedannelse blev anvendt på prøver af den proteomisk undersøgelse. Alle resultater er givet som middelværdi ± SEM (GraphPad Prism 4.0 Software, Graph Pad Software, Inc.)

Resultater

3.1. miRNA udtryk i PCA-cellelinjer

Analyse af miRNA niveauer ved QRT-PCR bekræftede nedsat ekspression af miR-187 i PCA cellelinjer: PC-3, LNCaP, DU-145 og 22RV1 (Fig 1A). I PC-3 var ækvivalent den MIR-187 ekspressionsniveauet, der blev observeret tidligere i PCA patienter [8], og derfor blev valgt denne cellelinie til den efterfølgende analyse.

A) Ekspression af MIR-187 blev analyseret ved QRT-PCR ved hjælp af en universel menneskelig RNA pulje som kalibrator til at normalisere den relative ekspression af de analyserede miRNA efter 2

-ΔΔCt metode. Som det kan forstås, alle cellelinier men VCap viste nedregulering af MIR-187. B) MIR-187 miRNA efterligne og miRNA efterligner negativ kontrol blev transficeret ind PC-3, LNCaP og DU-145-celler i 72 timer. Genindførelsen af ​​miR-187 i PC-3, blev LNCaP og DU-145 bekræftet ved real-time PCR. Histogrammet viser stigningen i miR-187 mRNA niveau i miR-187 miRNA efterligner transficerede celler sammenlignet med celler transficeret med miRNA efterligner negative kontrol og ikke-transfekterede celler.

3.2. Identifikation af ALDH1A3 som formodede miR-187 target

For at identificere potentielle mål for miR-187 en række proteom analyse og validering eksperimenter blev udført. miR-187 miRNA mimic blev genindført i PC-3, LNCaP og DU-145 og viste, at miR-187-ekspression blev genfundet i PC-3, LNCaP og DU-145-celler (Fig 1B). En global proteom tilgang med DIGE og LC-MS /MS blev udført med prøver fra PC-3-celler transficeret med en negativ kontrol, og PC-3 transficeret med MIR-187 miRNA mimic. Celler blev høstet 72 timer efter transfektion, lyseret og adskilt af todimensional elektroforese. Efter adskillelse af proteinekstrakter og fluorescens scanning, blev 9 differentielt udtrykte pletter detekteret (figur 2A). Disse 9 protein spots (p 0,05) vises mindst 1,06 gange regulering over seks uafhængige forsøg. Syv ud af disse 9 pletter viste en nedreguleret ekspression upon MIR-187 genindsætning som stemte overens med den forventede inhiberende virkning af miRNA på de fleste af sine mål (S1 Table). Blandt disse mål aldehyddehydrogenase 1A3 (ALDH1A3) blev identificeret (Fig 2B).

PC-3 celler blev transficeret enten med miRNA efterligner negativ kontrol eller miR-187 miRNA mimic, høstet efter 72 timer, og proteinlysater blev mærket med Cy3 eller Cy5 (mIR-187 og kontrol) og Cy2 for den interne standard. A) 2D-DIGE gel billede opnået ved pH 3-10 og 12,5% SDS-polyacrylamid. Tallene henviser til identifikation givet til pletterne differentielt udtrykte. Spot 655 blev yderligere identificeret ved LC-MS /MS som ALDH1A3. B) Sammenligning af ekspressionen af ​​en af ​​de pletter (655 eller ALDH1A3), i de seks geler analyseret, mellem cellerne transficeret med MIR-187 eller med den negative kontrol. Den gennemsnitlige gange ændring mellem de to betingelser var -1,06 med en p-værdi på 0,003. ALDH1A3, aldehyd dehydrogenase familie 1 medlem A3

3.3. Validering af

ALDH1A3

som formodede miR-187 mål

For at vise, at

ALDH1A3

er et mål for miR-187, bioinformatik target screening; ved hjælp af den mest almindelige miRNA target forudsigelse software (Targetscan, Pictar og Miranda) blev udført. Men ingen af ​​disse programmer matchede 3′-UTR-regionen i

ALDH1A3

med miR-187 sekvens. Ikke desto mindre anvende RNA22 værktøj, som ikke er afhængige af bevaring på tværs af arter, er modstandsdygtig over for støj og tillader G: U parring af target mRNA til miRNA frø sekvens [13], bekræftede en kamp mellem

ALDH1A3

den miR-187 frø sekvens (figur 3A).

A) RNA22 forudsagt mRNA-miRNA heteroduplexer. RNA22 v1.0 software forudsagt tre forskellige miR-187 bindingssteder inden ALDH1A3 mRNA sekvens. Formodede MIR-187 bindingssteder blev fundet i ALDH1A3 5’UTR region (i), kodende region (CDS) (ii og iii) og 3’UTR (iv). Dem alle fuldføre kriterierne for en basepar mindsteværdi på 14 og en maksimal foldning energi på -25. B) Western blot-analyse viser en reduktion i ekspressionen af ​​proteinet ALDH1A3 ved genindførelse af MIR-187 (MIR-187 miRNA mimic transficerede celler), hvilket bekræfter den inhiberende virkning af miRNA gennem sin formodede mål. Celler blev transficeret med MIR-187 miRNA mimic eller negativ kontrol og høstet efter 72 timer. Total celleekstrakter blev fremstillet og elektroforese ved SDS-PAGE, efterfulgt af immunblotting med anti-ALDH1A3 antistof. At sikre lige protein loading membranen immunoblottedes med anti β-actin antistof. C) Luciferase reporter assay udført med ildflueluciferase under kontrol af ALDH1A3 3’UTR bekræfter inhiberingen af ​​ALDH1A3 mRNA-ekspression (20% reduktion af luciferase signal) ved MIR-187 genindsætning. Data er præsenteret i forhold til vektorkontrol tildeles en værdi på 100. Den gennemsnitlige ± S.E.M. af tre uafhængige forsøg er vist. D) Overekspression af ALDH1A3 mRNA blev bekræftet i en kohorte af humane prostatatumorer (n = 96). Der var en omvendt korrelation (ikke statistisk signifikant) mellem nedregulering af miR-187 findes i disse prøver, og opregulering af ALDH1A3.

For at validere disse resultater, vi bekræftede den stærke ned -forordning af ALDH1A3 upon miR-187 genindførelse af western blot analyse i PC-3, LNCaP og DU-145 celler (fig 3B).

for yderligere at bekræfte rolle

ALDH1A3

som en mIR-187 målrette en luciferase reporter plasmid indeholdende 3’UTR-sekvensen af ​​

ALDH1A3

blev klonet ind PC-3-celler transficeret med mIR-187 mimic. Forbedret ekspression af MIR-187 (PC-3 MIR-187 mimic) signifikant reduceret reporter aktivitet af 3’UTR

ALDH1A3

konstruktioner til omkring 20% ​​sammenlignet med kontrolgruppen (PC-3 NC mimic) (fig 3C) .

QRT-PCR-data viste en højere ekspression af

ALDH1A3

(1,2 gange) sammenlignet med prøverne re-udtrykkende mIR-187 (data ikke vist). Endvidere sammenlignede vi udtryk for

ALDH1A3

mRNA-ekspression med nedregulering af miR-187 i to uafhængige grupper af primære PCA tumorer fra FFPE (n = 96) (fig 3D) og frisk væv (n = 10) (S1 fig). Men ingen sammenhæng mellem

ALDH1A3

og klinisk-patologiske parametre blev fundet, og derefter som forventet,

ALDH1A3

ikke udgjorde en prognostisk indikator for enten BPFS (p = 0,773) eller PFS (p = 0,430 ) i denne serie.

ALDH1A3 proteinekspression blev yderligere vurderet ved immunohistokemi (IHC) i de 195 tilfælde indgår i TMA (figur 4). Vi fandt, at ALDH1A3 var signifikant (p 0,0001) opreguleret i PCA prøver (gennemsnitlig intensitet = 1,42) sammenlignet med normalt prostatavæv (gennemsnitlig intensitet = 0,12). Desuden for at undersøge den rolle,

ALDH1A3

som MIR-187 target, studerede vi korrelation med MIR-187-ekspression. Interessant fandt vi, at MIR-187 ekspression signifikant var omvendt korreleret (p 0,0001) med ALDH1A3 proteinekspression. Vi yderligere undersøgte korrelationen af ​​

ALDH1A3

med klinisk-patologiske parametre og prognose. Selvom ALDH1A3 udtryk ikke udgjorde en prognostisk indikator, fandt vi en statistisk signifikant direkte sammenhæng med Gleason score (p = 0,05). Derfor 37% af tilfældene med en Gleason score 7 viste høj ALDH1A3 intensiteten af ​​farvning sammenlignet med 56% af PCa med Gleason≥7

immunhistokemisk farvning for ALDH1A3 er signifikant højere (p 0,0001). I tumor prøver (til højre) end i normale kontroller (til venstre). Farvning mellem forskellige tumor kvaliteter (Gleason score lavere end 7, er lig med eller højere end 7) blev sammenlignet finde en direkte sammenhæng mellem Gleason score og ALDH1A3 ekspression (p = 0,05). Immunhistokemisk farvning er vist for ALDH1A3 (højre kolonne) i hver prøve sammen med hematoxylin eosin-farvede væv (venstre kolonne).

For yderligere at undersøge den rolle,

ALDH1A3

i den diagnostiske indstilling vi udført en ELISA-assay til måling af ALDH1A3 udtryk i urin (n = 123 ). En univariat logistisk regressionsmodel blev udført for at vurdere den prædiktive evne af denne biomarkør, sammen med PSA, for tilstedeværelsen af ​​PCa i diagnostiske biopsier. På et signifikansniveau på 10%, PSA og ALDH1A3 blev begge signifikant associeret med en positiv biopsi af PCa (figur 5).

ROC kurver fra PSA og ALDH1A3 til at forudsige PCa i urinprøver. Arealerne under kurven er 0,610 (95% CI 0,509-0,710; p = 0,036 og 0,591 (95% CI 0,490-0,692;. P = 0,083) henholdsvis På et signifikansniveau på 10%, både PSA og ALDH1A3 var signifikant associeret med en positiv biopsi af PSA.

diskussion

miRNA forventes at kontrollere aktiviteten på ca. 60% af alle protein-kodende gener, og har vist sig at deltage i reguleringen af flere cellulære processer. af baseparring til mRNA’er, microRNA medierer translationel undertrykkelse eller mRNA nedbrydning [4]. under tidligere påvist rolle mIR-187 i PCa progression og diagnose [8], besluttede vi at yderligere at undersøge potentielle mål for denne miRNA at kunne også være af interesse som biomarkører. til dette formål genindført vi mIR-187 precursor i PC-3-celler og udførte en proteomisk tilgang.

genkendes af miRNA frø findes i mange gener, hvilket gør det vanskeligt at identificere fysiologisk relevante miRNA målgruppen relationer fra sekvensanalyse alene [14]. Endvidere tidligere resultater opnået ved Yang et al. [6] og Schramedei et al. [15] blev det bekræftet, at mindre end 10% af proteinerne identificeret ved en proteomisk fremgangsmåde blev forudsagt af almindeligt anvendte algoritmer såsom Pictar, Targetscan og Miranda. I overensstemmelse med disse resultater, blev ingen af ​​de proteiner identificeret ved proteomisk screening i nærværende undersøgelse forudsagt

in silico

af de ovennævnte algoritmer. Alligevel hjælp af RNA22 værktøj det var muligt at finde et match mellem MIR-187 og vores potentielt mål i

ALDH1A3

kodende region (CDS). Denne algoritme er forskellig fra tidligere rapporterede fremgangsmåder ved, at den ikke anvender en cross-arter sekvenskonservering filter, hvilket således muliggør opdagelsen af ​​microRNA bindingssteder, som måske ikke er til stede i nært beslægtede arter [13]. Desuden RNA22 tager hensyn til hypotesen om, at der ud over 3’UTRs, talrige bindingssteder sandsynligvis eksistere i 5’UTRs og CDS muliggør identifikation af hidtil uidentificerede miRNA /mRNA heteroduplexer.

I denne undersøgelse , 9 formodede mål for miR-187 blev identificeret ved 2D-DIGE og MS-analyse (S1 tabel). Fra disse vi valgte aldehyddehydrogenase 1A3 (

ALDH1A3

) for yderligere evaluering, fordi det er blevet beskrevet at være reguleret af androgener [16]. Western blot-analyse, QRT-PCR og IHC bekræftede direkte regulering af

ALDH1A3

af miR-187. Først blev den omvendte korrelation mellem ALDH1A3 og miR-187 bekræftet ved at inddrive miR-187-ekspression i PC-3, LNCaP og DU-145 celler, hvilket førte til en nedregulering af ALDH1A3 protein niveauer. For det andet blev den inhiberende virkning af MIR-187 på ALDH1A3 ekspression bekræftes yderligere af en luciferase reporter assay, der viste et fald i ALDH1A3 ekspression (-20% reduktion i luciferase signal) ved MIR-187 mimic transfektion. For det tredje, hæmning af

ALDH1A3

blev observeret, når man analyserer en kohorte af PCA menneskelig patientprøver, både friske og FFPE væv. I disse kohorter blev den stærke nedregulering af miR-187 ledsaget af en øget

ALDH1A3

mRNA-ekspression. Forth, rolle

ALDH1A3

som miR-187 mål blev bekræftet ved IHC-analyse. Derfor ALDH1A3 fandtes at være opreguleret i prostatatumorer og ekspressionen af ​​dette protein er omvendt korreleret med ekspressionen af ​​miRNA. Hertil kommer, at potentielle rolle

ALDH1A3

som kandidat prognostisk biomarkør for PCa blev evalueret, selv i kohorte af analyserede prøver det gav ikke yderligere oplysninger. Ikke desto mindre, sammenslutningen af ​​

ALDH1A3

udtryk med Gleason score giver tegn på en stigning i

ALDH1A3

udtryk med tumor iscenesættelse. Vi har tidligere postuleret, at tabet af MIR-187 under PCa progression kunne indikere en rolle som tumorsuppressor [8]. Derudover ALDH1A3 fandtes at samarbejde med PSA i forudsigelsen af ​​biopsi resultat. Bortset fra sin tilknytning til tilstedeværelsen af ​​tumoren i IHC af FFPE dias, var vi i stand til at måle ALDH1A3 i urinprøver, at finde en positiv sammenhæng med tumor udseende.