PLoS ONE: IL-1 Bidrager til Anti-Cancer Effekten af ​​Ingenol Mebutate

Abstrakt

ingenolmebutat er godkendt til lokal behandling af aktiniske keratoser og kan i sidste ende også finde nytte i behandling af hudkræft. Her viser vi, at tilbagefald af subkutan B16 melanom tumorer behandlet topisk med ingenolmebutat ikke var signifikant forskellige i C57BL /6 og RAG1

– /- mus, hvilket tyder B og T-celler ikke spiller en stor rolle i den anti-cancer effekt af ingenolmebutat. Tilbagefald blev dog steget betydeligt i MyD88

– /- mus og C57BL /6 mus behandlet med anti-IL-1 middel, anakinra. Ingenolmebutat behandling inducerer en udtalt infiltration af neutrofiler, som har vist sig at have anti-cancer-aktivitet hos mus. Heri vi dokumentere, at IL-1 fremmer neutrofil rekruttering til tumoren, nedsætter apoptose af infiltrerende neutrofiler og øger neutrofil tumor celledræbende aktivitet. Disse undersøgelser antyder IL-1, via sin indsats på neutrofiler, fremmer anti-cancer effekt af ingenolmebutat, med ingenolmebutat behandling forårsager både IL-1β induktion og IL-1α frigivet fra keratinocytter

Henvisning:. Le TT, Skak K, Schroder K, Schroder WA, Boyle GM, Pierce CJ, et al. (2016) IL-1 Bidrager til Anti-Cancer Effekten af ​​ingenolmebutat. PLoS ONE 11 (4): e0153975. doi: 10,1371 /journal.pone.0153975

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, UNITED STATES

Modtaget: 7. oktober, 2015; Accepteret: April 6, 2016; Udgivet: 21 April, 2016

Copyright: © 2016 Le et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. forskningen blev primært udført på QIMR Berghofer Medical Research Institute og blev i vid udstrækning finansieret af Leo Pharma, og delvist af en bevilling fra Australian National Health Medical Research Council (APP1043104). Leo ydet støtte i form af løn til TTL og hjælpematerialer, var involveret i den første undersøgelse design, men var ikke involveret i indsamling og analyse af data. Leo var involveret i beslutningen om at offentliggøre, men forudsat minimal input til skrivning af manuskriptet. K. Schroder er støttet af en australsk Forskningsråd Future Fellowship (FT130100361), og Queensland Smart Futures Fund. AS er en Principal Research Fellow med National Health Medical Research Council, Australien (APP1058391)

Konkurrerende interesser:. K. Skak er ansat i Leo Pharma. AS var en betalt konsulent for Leo Pharma i 2011. AS er en opfinder af en række patenter, der dækker ingenolmebutat (Picato), men modtager ingen royalties eller finansielle (eller andre) ydelser som følge heraf. Disse kommercielle tilhørsforhold ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

ingenolmebutat (Picato

®) er en godkendt aktuel lægemiddel til felt behandling af aktiniske keratoser (AKS) [1,2,3]. AKs er læsioner normalt findes på sol-eksponerede hud forårsaget af UV-eksponering og er karakteriseret ved atypisk prolifererende keratinocytter [4]. I omkring 8% af tilfældene, kan AKs videre til invasive planocellulært karcinom (SCCS) [5], den anden mest almindelige form for hudkræft. Fjernelse af AKs og muterede keratinocytter ved ingenolmebutat behandling således søger at reducere den efterfølgende risiko for at udvikle SCC [1,6,7,8]. Ingenolmebutat kan i sidste ende også finde nytte i behandling af andre hudkræft [9,10], med effekt vist i humane undersøgelser for SCC og basalcellekarcinomer [11,12,13]. Ingenolmebutat er afledt af saften fra

Euphorbia peplus

og aktiverer protein kinase C (PKC) [14,15].

In vivo

topisk lægemiddeltilførsel inducerer primære nekrose af (i) keratinocytter, herunder pletter af keratinocytter, der bærer p53-mutationer og (ii) subkutane tumorer celler, der vokser under behandlingsstedet [16,17]. Topisk behandling hos mennesker [7,18,19] og mus [16] resulterer i en hurtig indtræden transient erytem og en udtalt rekruttering af neutrofiler [17,20,21]. Neutrofiler rekrutteret og stimuleret af ingenolmebutat synes også at mægle anti-cancer aktivitet ved at reducere tumor-tilbagefald i mus tumormodeller, herunder B16 melanom model [21].

For at undersøge den rolle, adaptive og medfødte immunrespons til anti-cancer effekt af ingenolmebutat, vi undersøgte tilbagefald efter lokal behandling af subkutane B16 tumorer med ingenolmebutat i en serie af genmodificerede mus. Selvom T og B-celle responser ikke synes at spille en stor rolle, giver vi dokumentation for, at IL-1 spiller en væsentlig rolle i den anti-cancer effekt af ingenolmebutat.

Materialer og metoder

Animal etik redegørelse

Alt mus arbejde blev udført i overensstemmelse med god dyr praksis som defineret af National Health og Medical Research Council of Australia. Musen arbejde blev godkendt af QIMR Berghofer Medical Research Institute dyreetik udvalg. Mus blev aflivet, når tumorer nåede 100 mm

2, en tumor størrelse, der ikke forårsager overdreven belastning af dyrene.

Mus, tumor podning og ingenolmebutat behandling

hunmus, 8 -12 uger gamle blev injiceret med B16-melanomceller (4-5×10

5 celler /mus i 50 ul medium) ved overfladisk sc indsprøjtning. B16-celler blev opnået fra ATCC (CRL-6322) passeret mere end 10 gange og viste sig at være Mycoplasma negative ved MycoAlert

™ Mycoplasma Detection Kit (Lonza, Basel, Schweiz) og Hoechst-farvning [22]. Når gennemsnittet tumorstørrelsen nåede 10-20 mm

2 (2-4 dage efter injektion) mus blev valgt således, at hver gruppe havde en lignende gennemsnitlig tumorstørrelse og tumorstørrelse distribution; mus med tumor størrelser, der ikke kunne være passende matchede blev fjernet. Tumorstederne blev derefter behandlet topisk en gang med 10 pi placebo eller 0,1% ingenolmebutat gel dagligt i 2 på hinanden følgende dage (behandlingsstart betragtes som dag 0). Når tumorerne nåede 100 mm

2 mus blev aflivet ved anvendelse af carbondioxidgas. 0,1% gel omfatter 1 mg /g ingenol-3 angelate i en excipiens indeholdende isopropylalkohol, hydroxyethylcellulose, citronsyremonohydrat, natriumcitrat, benzylalkohol og renset vand. Denne dosis og blev valgt som tidligere arbejde havde vist det gav en 50-100% regression sats i B16 musemodel [16,21].

C57BL /6 mus blev købt fra ARC, Perth, Australien. MyD88

– /- (B6.129P2 (SJL) –

MyD88

TM1

1Defr

/J.), RAG1

– /- (B6.129S7-

RAG1

tm1Mom

/J) og μMT (B6.129S2-

Igh

-6

tm1Cgn

/J) mus på en C57BL /6 baggrund blev opnået fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA), og blev opdrættet i-huset på QIMR B. FcR-fælles gamma-kæde-deficiente mus (FcyR

– /-.) (B6.129P2-

Fcer1g

tm1Rav

N12) på en C57 /BL6 baggrund blev købt fra Taconic (Hudson, NY, USA)

anakinra behandling

Kineret (anakinra) SOBI (Swedish Orphan Biovitrum) fik ip ved 1 mg /mus (i 100 pi i PBS) dagligt, dag 0 (3-4 timer før ingenolmebutat behandlingsstart) gennem til dag 7. Den samme volumen PBS blev givet til at styre mus.

Histologi og immunhistokemi

Hematoxylin og eosin (H katalognummer NMP-R14, Abcam, Cambridge, MA, USA) blev gennemført som tidligere [23,24] beskrevet. Slides blev digitalt scannet ved hjælp af en scanning ScopeXTdigital slide scanner (Aperio, Vista, CA) og image-analyser af sektioner i to eksemplarer blev foretaget ved hjælp af Aperio ImageScope software (V10) og den positive Pixel Count v9 algoritme, der anvender standardindstillingerne.

Killing assays

B16-celler (5×10

3), blev podet i 96-brønds flade plader i 100 pi DMEM suppleret med 5% føtalt kalveserum og 10 mM HEPES pH 7,2. Den næste dag (dag 1) knoglemarvsceller blev opsamlet, vasket en gang, og tilsat inden for 45 minutter efter opsamling ved den angivne effektor til target ratioer med 6 replikater. Anakinra (100 ug /ml endelig) eller IL-1β (Shenandoah Biotechnology Inc., Warwick, PA, USA) (40 ng /ml endelig) blev derefter tilsat efterfulgt af ingenolmebutat (40 ng /ml endelig). De næste dage (dag 2) suspension celler blev fjernet ved at vende pladerne på silkepapir og frisk medier blev tilføjet. Efter yderligere 2 dages inkubation (dag 4), blev mediet fjernet ved vending pladerne på tissuepapir og cellen blev fikseret og farvet med krystalviolet. Pladerne blev tørret, 100 pi methanol tilsat per brønd, og absorbans måles ved 595 nm. Drab blev beregnet i forhold til B16-celler uden effektorer efter fradrag af baggrunden.

IL-1a og IL-1 protein målinger

Mus med B16 tumorer blev behandlet med ingenolmebutat dag 0 og 1, behandling sites blev udskåret på de angivne tidspunkter, homogeniseres (under anvendelse Precellys24 vævshomogenisator og keramiske perler) i PBS suppleret med 0,1% Igepal CA-630 ikke-ionisk detergent (Sigma) og protease-inhibitor cocktail (Roche). IL-1a og IL-1 p-niveauer blev målt i supernatanterne under anvendelse af BD ™ cytometrisk Bead Array Flex sæt reagenser (BD Biosciences).

Keratinocytkulturer og anti-IL-1α immunoblotting

Humant voksen epidermiskeratinocytter (Heka-APF, Cascade Biologics, OR, USA) blev dyrket som pr leverandørens anbefalinger om belægning matrix og i lav calcium medium (EpiLife med S7) uden serum (Gibco). Celler vi dyrket til konfluens i plader med 6 brønde, calcium blev derefter tilsat til en slutkoncentration på 1 mM, og cellerne dyrket i 48 timer. Celler blev derefter behandlet med de angivne koncentrationer af ingenolmebutat i 16 timer i 1 ml EpiLife medium indeholdende 1 mM calcium. Supernatanterne blev høstet, centrifugeret ved 1000 g i 5 min, og proteiner i supernatanten præcipiteret under anvendelse af methanol som beskrevet [25]. Præcipitaterne blev derefter analyseret ved Western blotting under anvendelse af et anti-IL-1α antistof (Abcam; katalognummer 9614) og gede-anti-kanin-HRP sekundært antistof (Merck Millipore). Blots blev scannet ved hjælp af ImageQuant LAS 500.

Statistik

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af IBM SPSS Statistics (version19). Overlevelse og tilbagefald er repræsenteret som Kaplan-Meier plot, med statistisk signifikans bestemt ved log-rank (Mantel-Cox) tests. For andre datasæt t-test blev anvendt, hvis forskellen i varianserne var 4, skævhed var -2, og kurtosis var 2; hvor dataene var parametriske og forskel i varianser var 4 blev Mann Whitney U test anvendes, hvis 4 blev anvendt Kolmogorov-Smirnov test. En 2-vejs ANOVA blev anvendt til ApoTag farvning, med data, der viser en parametrisk fordeling og forskelle i varians. 4

Resultater

tilbagefald hos mus mangelfuld T og B celle responser

Både anti-cancer T-celler og anti-cancer-antistoffer induceres efter topisk ingenolmebutat behandling (og regression) af et antal subkutant dyrket tumorer i mus [9,10,21]. Forsøg under anvendelse af LK2 pladecellecarcinom linje dyrket i

Foxn1

nu

mus også antyder en rolle for antistoffer og antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) i forebyggelse af tilbagefald [21]. For at undersøge yderligere bidrag adaptive immunrespons til anti-cancer aktivitet ingenolmebutat blev B16 tumorer dyrket subkutant til 10-20 mm

2 i RAG1

– /- mus (C57BL /6 baggrund), der ikke er i stand til at generere adaptive B- eller T-celle-responser, og i kontrol C57BL /6-mus. Tumorstederne blev derefter behandlet to gange topisk (dag 0 og dag 1) med ingenolmebutat eller placebo gel, og tumorvækst blev fulgt over tid. Tilbagefald var ikke signifikant forskellig mellem RAG1

– /- og C57BL /6-mus (figur A i S1 File), hvilket tyder på hverken B eller T-celler spiller en vigtig rolle i den anti-tumor effektivitet ingenolmebutat i B16 model .

Yderligere forsøg til at undersøge den rolle, som (i) ADCC [21] ved brug af Fc-receptor fælles gamma-kæde deficiente mus (FcyR

– /-) mus (Figur B i S1 File) og (ii) antistoffer ved hjælp af B-celle mangelfulde μMT mus (figur C i S1-fil), var ufyldestgørende som vækstrater på B16 (i mangel af ingenolmebutat behandling) var forskellige i disse mus.

Øget tilbagefald i MyD88

– /- mus

for at undersøge yderligere bidrag medfødte immunrespons [21] til anti-cancer effekt af ingenolmebutat behandling blev B16-celler dyrket subkutant til 10-20 mm

2 i MyD88

– /-. og C57BL /6 mus og blev derefter behandlet to gange (dag 0 og dag 1) med ingenolmebutat eller placebo gel, og tumorvækst overvåges over tid

De tilbagefald i MyD88

– /- mus var signifikant højere (84%) end i C57BL /6-mus (50%) efter ingenolmebutat behandling (fig 1A), med en deraf følgende betydelig reduktion i overlevelse fra 50% i C57BL /6 til 16% i MyD88

– /- mus (fig 1B)

(A) tilbagefald efter (i) ingenolmebutat behandling af B16 tumorer dyrket i MyD88

-. /- mus (n = 25), ( ii) ingenolmebutat behandling af B16 tumorer dyrket i C57BL /6-mus (n = 21), (iii) placebo behandling af B16 tumorer dyrket i MyD88

– /- mus (n = 18) og (iv) placebobehandling af B16 tumorer dyrket i C57BL /6-mus (n = 19). Mus blev scoret positivt, når en tumor var klart synlig (≥1-2 mm i diameter). Data fra to uafhængige forsøg. Ingenolmebutat behandlingsgrupper var signifikant forskellige p = 0,021, log-rank (Mantel-Cox) test. (B) Overlevelsesrate for de samme mus som beskrevet i A; mus blev aflivet, når tumorerne nåede 100 mm

2. Ingenolmebutat behandlingsgrupper var signifikant forskellige p = 0,018, log-rank (Mantel-Cox) test.

I modsætning til en tidligere rapport [26], observerede vi ingen signifikante forskelle i væksten i B16 i MyD88

– /- og C57BL /6 mus i placebo behandlede mus (figur D i S1 File). Overlevelsesrater var faktisk marginalt (men ikke væsentligt) steg i MyD88

– /- mus sammenlignet med C57BL /6 i fravær af ingenolmebutat (Fig 1B, sammenlign placebogruppen). De to sidstnævnte observationer indikerer, at de øgede tilbagefald i MyD88

– /- mus skrive ingenolmebutat behandling ikke var på grund af sagens natur mere robust vækst af B16 tumorer i MyD88

– /-. Mus

anakinra behandling øget tilbagefald

MyD88 er involveret i signaltransduktion for både Toll-lignende receptorer og IL-1-receptoren, og IL-1β mRNA induceres i mus efter topisk ingenolmebutat behandling [21]. Keratinocytter udtrykker høje niveauer af konstitutiv IL-1α, som frigives efter topisk påføring af phorbolester [27]; phorbolester, ligesom ingenolmebutat, aktiverer PKC [14]. Anvendelsen af ​​IL-1-deficient mus kompliceres af de meget forskellige vækstrater for B16 i disse dyr sammenlignet med vildtypemus [28]. Således at undersøge rollen af ​​IL-1 blev mus behandlet med anakinra, en rekombinant IL-1-receptorantagonist, der anvendes i behandlingen af ​​rheumatoid arthritis. Anakinra behandling signifikant forøget tilbagefald fra 0% til 50% (fig 2A) og nedsat overlevelse fra 100% til 0% (Fig 2B), hvilket antyder, at IL-1 spiller en rolle i anti-tumor effekt af ingenolmebutat. Anakinra behandling ikke påvirke væksten af ​​etablerede B16 tumorer

in vivo

(Figur E i S1 File), i overensstemmelse med tidligere resultater [29,30,31].

(A) tilbagefald efter C57BL /6 mus med B16 tumorer blev behandlet med ingenol mebuate eller placebo, og modtaget daglige injektioner af PBS eller anakinra, dag 1-7. (N = 9-12 mus per gruppe). Mus blev scoret positivt, når en tumor var klart synlig (≥1-2 mm i diameter). Statistik sammenlignet + anakinra med + PBS i ingenolmebutat behandlede grupper ved hjælp af log-rank (Mantel-Cox) test. (B) Overlevelse af musene er beskrevet i A; mus blev aflivet, når tumorerne nåede 100 mm

2. Statistik som i A.

Anakinra og neutrofil rekruttering og apoptose

Aktuel ingenolmebutat behandling resulterer i en udtalt rekruttering af neutrofiler til behandlingsstedet [9,17,20,21] , der heri blev kvantificeret ved hjælp af anti-Ly6G antistof farvning, immunhistokemi og billedanalyse (Aperio Positiv Pixel tælle). Som forventet blev der observeret signifikant rekruttering af neutrofiler til behandlingsstedet (topper på dag 2 efter behandlingsstart) (fig 3A, behandlingsstedet, sammenligne dag 0 med dag 2 PBS). Selvom IL-1 har vist sig at fremme neutrofil rekruttering i flere indstillinger [32,33,34] anakinra behandling påvirkede ikke signifikant rekruttering til behandlingsstedet (Fig 3A, behandlingsstedet, sammenligne dag 2, PBS versus anakinra). Men i sektioner, hvor tumoren klart kunne ses, tætheden af ​​neutrofiler inden ≈200 um af tumormassen var marginalt ( 2 gange), men signifikant lavere i anakinra behandlede dyr (fig 3A, Inden ≈200 um af tumor, sammenligne dag 2, PBS versus anakinra). Eksempler på sidstnævnte er vist i fig 3B, med neutrofiler farvning brun og tumormassen let genkendelige ved de sorte melanosomer (Fig 3B, hvide ovaler). Anakinra således syntes at reducere neutrofil rekruttering til tumoren, med tumor-afledt IL-1β tidligere rapporteret at rekruttere anti-cancer neutrofiler til tumoren [35].

(A) neutrofilrekruttering til behandlinger sites (venstre søjle figur) og til inden for ≈200 um af tumor (højre søjlediagram). Behandling sites; dag 2 efter initiering af ingenolmebutat behandling blev behandlingssteder skåret ud og behandlet for immunhistokemi og farves med neutrofil markør, anti-Ly6G. Slides blev scannet og analyseret af Aperio Pixel tæller software til brun farvning (standardindstillinger) eksklusive områder, der indeholder tumor (som melanosomer give et falsk positivt signal). To sektioner pr mus, 6 mus per gruppe. Statistik fra Kolmogorov-Smirnov tests (forskelle i varians mellem grupperne var 4). Inden ≈200 um af tumor; i sektioner, hvor tumormassen kunne let identificeres (ved tilstedeværelsen af ​​sorte melanosomer) blev brun farvning omgiver tumoren (inden ≈200 um) kvantificeret som ovenfor. Én sektion per mus, 4-5 mus pr gruppe. Statistik fra Mann Whitney U test (ikke-parametrisk fordeling data og forskelle i varians 4). (B) billeder, der illustrerer den reducerede densitet af anti-Ly6G farvende neutrofiler (brun plet) inden ≈200 um af tumormassen i anakinra versus PBS-behandlede mus. Tumorerne afgrænset af hvide linjer og identificeret ved tilstedeværelsen af ​​sorte melanosomer. Sektioner er orienteret med huden (ikke vist) i toppen, med tumorerne placeret i dermis. (C) ApoTag farvning af sektionerne er beskrevet i A. Seks mus per gruppe, 2/3 sektioner pr mus, statistik med 2 vejs ANOVA (parametrisk data distribution og forskelle i varians 4, narkotika og mus som faste faktorer, 2 /3 sektioner per mus som afhængige variable). (Eksempler på farvningen er vist i figur F i S1 File).

IL-1 er blevet rapporteret at inhibere neutrofil apoptose [36,37,38]. Parallelle sektioner til de ovenfor beskrevne blev derfor farvet med ApoTag og billedanalyse (som ovenfor) af neutrofile rige områder gennemføres for at måle omfanget af apoptose. Eksempler på Apotag farvning er vist i fig F i S1 Fil. Anakinra behandling mere end fordoblet ApoTag farvning tæthed i neutrofile rige områder i behandlingssteder i dermis 2 dage efter ingenolmebutat behandlingsstart (fig 3C), hvilket tyder på IL-1 fremmer overlevelsen af ​​neutrofiler rekrutteret af ingenolmebutat behandling.

ingenolmebutat og IL-1β fremmer drab på B16-celler

in vitro

Vi har tidligere vist, at humane neutrofiler viser forøget drab af humane melanomaceller

in vitro

i tilstedeværelsen af ​​ingenolmebutat [21]. For at undersøge yderligere evne ingenolmebutat at fremme tumor drab af neutrofiler, udviklede vi et murine system ved hjælp af B16-celler og knoglemarvsceller, som omfatter ≈40% neutrofiler, ≈40% B-celler, ≈ 10% monocytiske celler og et lille antal af andre celletyper. Ingenolmebutat var konsekvent stand væsentligt til fremme drab af B16-celler ved disse celler ved ≥ 2 gange (figur 4A, p = 0,005 og 0,002). Denne aflivningen er ikke inhiberet i nærvær af anakinra (Fig 4A, punkteret linier) tyder på, at hverken ingenolmebutat-stimulerede neutrofiler [39] eller B16-celler generere tilstrækkelig IL-1 til at stimulere tumorcelledrab [35]. Men i nærværelse af exogent tilsat IL-1β og dræbte var marginalt men konsekvent, og ofte signifikant, forøget i både nærvær og fravær af ingenolmebutat (Fig 4B). Disse data understøtter den opfattelse, at IL-1 forbedrer anti-cancer aktivitet af neutrofiler

in vitro

, i overensstemmelse med tidligere rapporter, der viser, at IL-1 kan fremme degranulering og respiratorisk burst aktivitet i humane neutrofiler [40,41] . (Vi kunne ikke formelt at udelukke, at andre celler i knoglemarven var ansvarlige for anti-cancer-celle-aktivitet, som rensning af murine neutrofiler resulterede i inkonsistente resultater).

(A) Knoglemarvsceller (≈ 40% neutrofiler) blev inkuberet med B16-celler i 96 brønds plader (6 gentagelser) ved de angivne effektor til target ratioer og celledrab opgjort i forhold til B16 celler med intet lægemiddel eller effektorer. Statistik fra Kolmogorov-Smirnov (forskel i varians 4) p = 0,005, og Mann Whitney U test (ikke-parametrisk distributions- og forskel i varians 4) p = 0,002. Ingenolmebutat (40 ng /ml endelig) og /eller anakinra (100 ug /ml endelig) var til stede under assayet. (B) som for en undtagen en lang række effektor til target ratioer (dvs. 15: 1 til 250: 1) blev anvendt, og IL-1β (40 ng /ml endelig) blev tilsat. Statistik fra Kolmogorov-Smirnov (til datasæt, hvor forskellen i varians var 4) og t test (til datasæt med parametrisk fordeling og forskelle i varians 4).

IL-1 protein niveauer ved de ingenolmebutat behandlingssteder

de data hidtil støtter det synspunkt, at IL-1 fremmer anti-cancer effekt af ingenolmebutat ved at fremme neutrofil anti-cancer aktivitet, med MyD88 kræves for IL-1 receptor signal transduktion [42]. For at få yderligere indsigt i IL-1 produktion, blev vævet IL-1α og IL-1 protein niveauer på behandlingssteder kvantificeres før og efter ingenolmebutat behandling. IL-1a proteinniveauer ved behandlingsstedet sites var høj før behandling (Fig 5A), med IL-1α ekspression begrænset til huden i stedet for B16 tumor (figur G i S1 File). Denne observation er i overensstemmelse med den kendte høje konstitutive pro-IL-1α proteinekspression i keratinocytter [27]. IL-1a protein niveauer faldet betydeligt (≈3 fold) efterbehandling (Fig 5A), sandsynligvis forbundet med omfattende keratinocyt nekrose induceret inden 6-24 h ingenolmebutat behandling [17]. Dette mønster af IL-1α proteinekspression var den samme i MyD88

– /- mus (fig 5A, MyD88

– /-; Figur G i S1 File).

(A, B) C57BL /6 og MyD88

– /- mus med B16-tumorer blev behandlet topisk med ingenolmebutat dag 0 og 1, blev behandlingssteder udskåret og IL-1a og IL-1 p-niveauer blev målt i ekstrakter ved hjælp BD BD ™ cytometrisk Bead Array ( n = 6 mus pr gruppe og tidspunkt). Statistik fra Kolmogorov-Smirnov tests (forskelle i varians 4). (C) dyrkede voksne humane keratinocytter blev behandlet med den angivne koncentration af ingenolmebutat i 16 timer, og supernatanterne blev analyseret ved hjælp af Western ved anvendelse af et anti-IL-1α antistof. Pilen angiver positionen af ​​18 kDa bioaktive form af IL-1α.

IL-1β proteinniveauer i C57BL /6-mus var lave før ingenolmebutat behandling og forøget (≈3 gange) efter ingenol mebutate behandling, med denne stigning nåede signifikans på dag 6 (fig 5B, C57BL /6) i overensstemmelse med tidligere mRNA data [21]. På dag 6 IL-1β protein niveauer var også signifikant højere i ingenolmebutat behandlet C57BL /6 mus sammenlignet med ingenolmebutat behandlet MyD88

– /- mus (Fig 5B, dag 6). Således MyD88

– /-. Mus har en defekt i IL-1β protein induktion efter ingenolmebutat behandling, i overensstemmelse med den MyD88-afhængige IL-1β induktion ses i flere indstillinger [43,44]

perle baseret IL-1 assays, der anvendes heri på væv lysater, er ude af stand til at skelne mellem inaktive (pro-IL-1) og kløvet-aktiv IL-1 arter, med de seneste data tyder pro-IL-1α skal også blive spaltet til 18 kDa formen være aktive på fysiologiske koncentrationer [45]. Således IL-1α frigivet fra keratinocytter [27] og /eller IL-1β induktion kan tilvejebringe IL-1 efter ingenolmebutat behandling.

ingenolmebutat forårsager IL-1α frigivelse fra keratinocytter

in vitro

De væsentligt højere niveauer af IL-1α, sammenlignet med IL-1β (figur 5A vs 5B), måske hævde, at IL-1α er en vigtig aktør i denne indstilling. Faldet i de samlede IL-1α niveauer efter ingenolmebutat behandling (Fig 5A) (samtidige med keratinocyt nekrose [17]) antyder keratinocyt IL-1α kan frigives, da andre topikalt PKC aktivatorer forårsager IL-1α frigivelse fra keratinocytter [27 ]. Keratinocytter konstitutivt udtrykker høje niveauer af intracellulære pro-IL-1α [27], som er bundet til IL-1 receptor 2 (IL1R2) [46], med IL1R2 faktisk opreguleret efter ingenolmebutat treament [15]. Produktion af fysiologisk aktivt IL-1α menes at kræve (i) frigivelse af pro-IL-1α fra IL-1R2, en proces medieret af caspase-1-medieret spaltning af IL-1R2, og (ii) efterfølgende spaltning af det frigivne pro-IL-1α ved calpain at generere fysiologisk bioaktive 18 kDa IL-1α [45].

for at bestemme om ingenolmebutat behandling af keratinocytter forårsager frigivelse af IL-1α, dyrkede primære humane keratinocytter blev behandlet med ingenol mebutate

in vitro

i 16 timer, og supernatanten analyseres for tilstedeværelsen af ​​de 18 kDa arter af IL-1α ved Western. Behandling med ingenolmebutat på 50 pg /ml, men ikke 20 eller 5 mg /ml, resulterede i frigivelsen af ​​18 kDa IL-1α (Fig 5C, pil). Den /ml koncentration 50 ug forårsager stigninger i cytosolisk calcium, men er lige under den koncentration, der forårsager åbenlys cytotoksisk påvirker i keratinocytter [47]; (Vi også observeret nogen åbenlys celledød i disse kulturer).

Diskussion

Heri vi dokumentere, at den anti-cancer effekt af aktuel ingenolmebutat behandling kræver både MyD88 og IL-1. Øget tumor tilbagefald blev set i MyD88

– /- mus, og i C57BL /6 mus efter anakinra (anti-IL-1) behandling, med MyD88 kræves for IL-1-receptor signalering [42]. Topisk ingenolmebutat behandling vides at forårsage en udtalt rekruttering af neutrofiler til behandlingsstedet [9,17,20,21], med IL-1 tidligere vist at fremme anti-cancer aktiviteterne af neutrofiler i B16 model [35,48 ]. (IL-1β ikke har nogen direkte indflydelse på B16 vækst [35]). Neutrofiler er også kendt at mediere anti-cancer aktiviteterne i andre systemer [49,50]. Vi viser her, at IL-1 påvirker tre aspekter af neutrofil adfærd efter ingenolmebutat administration; (I) øget rekruttering til tumoren (fig 3B), i overensstemmelse med den almindeligt rapporterede rolle af IL-1 til at fremme neutrofil rekruttering [32,33,34,35,51,52,53], (ii) reduceret neutrofil apoptose ( fig 3C), med IL-1 tidligere rapporteret at inhibere neutrofil apoptose [36,37,38], og (iii) øget tumordrab, i overensstemmelse med den rapporterede rolle af IL-1 til at fremme neutrofil aktivering [40,41]. IL-1 og IL-1 receptor signalering således synes at spille en rolle i at reducere tilbagefald skrive ingenolmebutat behandling ved at fremme anti-cancer aktiviteter af neutrofiler.

Behandling af keratinocytter

in vitro

, med en dosis af ingenolmebutat der er i stand til at hæve intracellulær calcium [47], resulterede i udgivelsen af ​​18 kDa bioaktive form af IL-1α. Keratinocytafledte IL-1α kan således (i det mindste indledningsvis) være en væsentlig kilde til IL-1 efter ingenolmebutat behandling. Lavere ingenolmebutat doser inducerede ikke IL-1α frigivelse, hvilket tyder PKC-aktivering (som forekommer ved koncentrationer så lave som 10 ng /ml [21]) er ikke tilstrækkelig til IL-1α frigivelse. Forøget intracellulær calcium [16] kan forventes at aktivere calpain [54], med aktiv calpain kræves til spaltning af pro-IL-1α til de 18 kDa IL-1a arter [45]. Dog skal pro-IL-1α først frigives fra IL-1R2, en proces menes at være medieret af caspase-1-medieret spaltning af IL-1R2 [45]. Frigivelse af 18 kDa IL-1α frigivelse kan foreslå aktivering af keratinocyt caspase-1, og kan påvises caspase 1 induktion og aktivering i huden efter ingenolmebutat behandling (figur H i S1 File). Endvidere kan permeabilisering af plasmamembranen være tilstrækkelig til inflammasome (og således caspase 1) aktivering [55], med ingenolmebutat stand til at inducere plasma membranpermeabilisering [16,47]. Men aktivering af keratinocyt caspase-1 (og måske pyroptosis [56]) efter topisk ingenolmebutat behandling stadig at blive formelt demonstreret, og kompliceres af den overflod af neutrofiler, som også udtrykker caspase 1.

keratinocyt -afledt IL-1α kan være involveret i (MyD88-afhængig) induktion af IL-1β (figur 5B), med IL-1β induktion af IL-1 rapporteret tidligere [57,58] og tumor-afledt IL-1β også vist sig at rekruttere neutrofiler til tumoren [35]. Som B16 celler ikke gør IL-1 [35], ikke-maligne celler i /omkring tumoren (fx stromale celler, fibroblaster og /eller makrofager) kan repræsentere kilden til IL-1β. Efter ingenolmebutat behandling

in vivo

(i) B16 tumorvæv viser en ≈1.5 gange induktion af IL-1β mRNA [21] og (ii) tumor behandlingssteder viser en ≈2.5 gange stigning i IL-1β-protein niveauer (fig 5B). Stimulerede neutrofiler kan også gøre IL-1β [39,59]. Toll-lignende receptor engagement kunne også være involveret i IL-1β induktion [43,44], med induktion af primær nekrose og blødning i tumoren (tydelig efter ingenolmebutat behandling i mus [60], se også figur jeg i S1 fil) potentielt give selvstændige afledte Toll-lignende receptor agonister [61].

Tidligere data, der viser øget tilbagefald af LK2 tumorer i SCID mus (der gør lidt eller ingen immunglobulin) versus

Foxn1

nu

mus (der bevarer evnen til at gøre IgM), foreslog en rolle for anti-cancer antistoffer og neutrofil ADCC reducere tilbagefald [21]. Men præsenterede dataene heri bruge B16 tumorer dyrket i RAG1

– /- mus, tyder hverken antistoffer (eller T-celler) spiller en stor rolle i at reducere tilbagefald.