PLoS ONE: oleanolsyre Undertrykker Aerobic Glycolysis i cancerceller ved at skifte pyruvatkinase Type M Isoforms

Abstrakt

Warburg effekten, et af kendetegnene for kræftceller, er kendetegnet ved metaboliske skifte fra mitokondrie oxidativ fosforylering til aerob glykolyse. I de senere år øget ekspressionsniveau af pyruvatkinase M2 (PKM2) har vist sig at være den skyldige af øget aerob glykolyse i cancerceller. Der er imidlertid ingen agent inhibering aerob glycolyse ved at målrette PKM2. I denne undersøgelse fandt vi, at oleanolsyre (OA) inducerede et skift fra PKM2 til PKM1, og konsekvent, ophævet Warburg effekten i kræftceller. Undertrykkelse af aerob glykolyse af OA medieres af PKM2 /PKM1 switch. Endvidere blev mTOR signalering sig at blive inaktiveret i OA-behandlede cancerceller, og mTOR inhibering er nødvendig for virkningen af ​​OA på PKM2 /PKM1 switch. Nedsat udtryk for c-myc-afhængige hnRNPA1 og hnRNPA1 var ansvarlig for OA-induceret skifte mellem PKM isoformer. Kollektivt, vi identificeret, at OA er en antitumorforbindelse der undertrykker aerob glykolyse i kræftceller, og der er potentiale, PKM2 kan udvikles som et vigtigt mål i aerob glykolyse vej for udvikling af nye anticancer midler

Henvisning:. Liu J , Wu N, Ma L, Liu M, Liu G, Zhang Y, et al. (2014) oleanolsyre Undertrykker Aerobic Glycolysis i kræftceller ved at skifte pyruvatkinase type M-isoformer. PLoS ONE 9 (3): e91606. doi: 10,1371 /journal.pone.0091606

Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA

Modtaget: November 6, 2013; Accepteret: 12. februar 2014 Udgivet: 13 marts 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af nationale innovative udviklingsprojekter narkotika projekter (2014ZX-09.102.043-001). Undersøgelsen blev også støttet delvist af National Foundation of Natural Sci. Kina (81302906, 81273550 og 41306157, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Aerobic glykolyse, også kendt som Warburg effekt, er blevet etableret som et adelsmærke for cancerceller [1]. Næsten alle typer af kræftceller ændre deres stofskifte ved at øge glykolyse og undertrykke mitokondrie oxidativ fosforylering, selv under normoxiske betingelser (derfor defineret som aerob glykolyse) [2]. Mange glycolytiske mellemprodukter er uundværlige for syntesen af ​​molekyler, der er afgørende for cellulære strukturer og funktioner, såsom nukleotider, aminosyrer og lipider. Således stærkt prolifererende cancerceller opfylder deres krav til cellulære byggematerialer ved at skifte deres stofskifte fra oxidativ phosphorylering til glykolyse, selvom ATP produktion er mindre effektiv i glycolytiske proces.

PKM

genet koder to protein kinaser, PKM1 og PKM2, og disse kinaser er også ansvarlige for omdannelsen af ​​phosphoenolpyruvat (PEP) til pyruvat, som kan bruges til mælkesyre produktion eller enterring mitokondrie oxidativ fosforylering. PKM1 og PKM2 genereres af EXCLUSIVE mRNA splejsning (exon 9 for PKM1 og exon 10 for PKM2) [3]. https://en.wikipedia.org/wiki/PKM2 – cite_note-Corcoran-5PKM1 er katalytisk mere aktiv end PKM2. PKM2 udtrykkes i alle celler med en høj grad af nukleinsyresyntese [4]. Cancerceller udnytte PKM2 at akkumulere mellemprodukterne til syntese af nukleinsyre og protein og opretholde aerobe [5] glycolyse. Forøgelse PKM2 aktivitet eller skifte mRNA splejsning fra PKM2 til PKM1 er i stand til at undertrykke Warburg virkning, og dermed kompromis tumorvækst [6]. Derfor er PKM2 menes at en lovende mål inden for cancerterapi. Men forbindelserne, der kan øge forholdet mellem PKM1 til PKM2 ikke er blevet fundet,.

oleanolic syrer (OA) er fordelt bredt i mange planter, og det er veldokumenteret, at OA viser antitumoraktivitet til en række humane cancerceller. Tidligere undersøgelse i vores laboratorium har vist, at behandling af humane pankreatiske pan-28 cancerceller, der fører til apoptose via mitokondrie medierede apoptotiske vej [7]. En anden undersøgelse viser også, at OA kan hæmme metastase på gliom celler [8]. Men målet for OA er ikke godt identificeret. I nærværende undersøgelse fandt vi, at OA kan undertrykke aerob glykolyse ved at undertrykke PKM2 udtryk og påvirket

PKM

mRNA splejsning gennem mTOR /c-myc /hnRNP signalering.

Metoder og materialer

Celledyrkning og kemiske forbindelsers

humant prostata carcinom-cellelinje, PC-3 og human brystcancer cellelinje, MCF-7, blev indkøbt fra American Type Culture Collection C (ATCC). PC-3-celler blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; GIBCO-BRL) ved 37 ° C under en fugtig 5% CO

2 betingelse. MCF-7-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM).

oleanolsyre (OA) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (O5504, St. Louis, MO). OA blev fremstillet i DMSO ved en koncentration på 10 mg /ml som stamopløsning.

celletransfektion

Plasmider, herunder pWZL Neo Myr Flag PKM2 og pMXs-hcMYC blev opnået fra Addgene (Cambridge, MA). pcDNA Flag GFP (Flag-GFP) blev bevaret i vores laboratorium og blev anvendt som kontrol. Celletransfektion blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev PC-3 eller MCF-7-celler udpladet på en plade med 96 brønde. Når cellerne dyrkes til ca. 85% konfluens blev mediet udskiftet med OPTI-MEM. Derefter blev 3 ug plasmider og 30 pi lipofectamin-reagens blandes i et rør indeholdende 1500 pi OPTI-MEM ved kraftig vortexbehandling. Efter inkubering i 15 minutter blev blandingen tilsat til cellekulturerne og inkuberet i visse tidspunkter.

Immunoblotting assays Salg

Celler blev høstet ved centrifugering ved 1000 g i 10 minutter og lyseres med M- PER pattedyrprotein Extraction Reagent (Thermo Scientific, IL). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af BCA-proteinassay-kit (Thermo Scientific, FL). Det samlede protein blev separeret med elektroforese med 10-12% polyacrylamidgel og overført til 0,45 um nitrocellulosemembraner. Membraner blev inkuberet i blokeringsopløsning (PBS, 0,1% Tween-20, og 5% fedtfri mælkepulver) i 2 timer ved stuetemperatur, og derefter, inkuberet med primære antistoffer (1:1000). Efter inkubering natten over blev membranerne vasket med PBS indeholdende 0,1% Tween-20 for tre gange, og derefter blev inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (IgG gede-anti-kanin eller anti-mus, 1:2000; Bio-Rad , CA) i 1 time ved stuetemperatur. Proteinbåndene blev visualiseret med SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific, IL). Intensiteten af ​​blots blev kvantificeret ved hjælp ImageJ software

De primære antistoffer, der anvendes i vores undersøgelse var som følger:. PKM1 (# 7067, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), PKM2 (# 4053, Cell Signaling Technology , Danvers, MA), β-tubulin (# 2146, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Phospho-mTOR (Ser2448) (# 2971, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); mTOR (# 2983, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); c-Myc, (sc-40, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas); hnRNP A1 (# 8443, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); hnRNP A2 (# 9304, Cell Signaling Technology, Danvers, MA).

immunofluorescensanalyse

PC-3 og MCF-7-celler (5 x 10

4 /brønd) blev udpladet på 24-brønds plader, og derefter, OA (100 ug /ml) blev tilsat. Efter 6 timers inkubering blev cellerne fikseret med 4% polyoxymethylen i 0,5 timer, efterfulgt af inkubation med PKM2 antistof (1:1000) i 2 timer. Den tilsvarende sekundære antistof blev tilsat og inkuberet i yderligere 1 time for at visualisere PKM2. 4 ‘, blev 6’-diamidino-2-phenylindol (DAPI) anvendt til at farve kerner. Den fluorescens blev opdaget under en konfokal mikroskop (CLS-2SS, Thorlabs).

Metaboliske Analyser

Analyser af O

2 indhold, pyruvat kinase (PK) aktivitet, glukoseoptagelse, laktat produktion, og cellulære respiration blev anvendt til at undersøge ændringer i metaboliske skift i cancerceller behandlet med OA. Den pyruvatkinase (PK) Assay Kit (ab83432, Abcam) og OX-500 O

2 Mikrosensor (Unisense, Danmark) blev anvendt til at bestemme PK-aktivitet og O

2 indhold i henholdsvis PC-3 og MCF -7 celle behandlet med OA, i overensstemmelse med producentens anvisninger.

for at måle glucoseoptagelse, PC-3 og MCF-7 blev podet ved en densitet på 5 x 10

3 celler /brønd i 96- brønds plader. Efter inkubering natten over blev cellerne transficeret med visse plasmider eller behandlet med MHY1485. Derefter blev cellerne behandlet med 50 eller 100 ug /ml OA hhv. Efter inkubation i 6 eller 12 timer, blev dyrkningsmedierne høstet ved centrifugering ved 3000 g i 15 minutter. Mængden af ​​glucose forbrug af de testede kræftceller blev påvist under anvendelse glucoseoptagelse Kolorimetrisk Assay Kit I (# K676, BioVision, Milpitas, CA) ifølge producentens instruktioner. Absorptionen densitet (OD) ved 412 nm blev aflæst ved anvendelse af en BioRad680 mikropladelæser (Bio-Rad, Hercules, CA).

Produktionen af ​​mælkesyre blev bestemt ved anvendelse lactat Kolorimetrisk Assay Kit II (# K627, BioVision , Milpitas, CA) som producentens protokoller. Kort fortalt blev PC-3 og MCF-7-celler behandlet med pWZL Neo Myr Flag PKM2, pMXs-hcMYC og pcDNA Flag GFP i 72 timer eller MHY1485 i 1 time hhv. OA blev tilsat i de angivne koncentrationer og inkuberet i de angivne tidsrum. Derefter dyrkningsmedierne blev opsamlet ved centrifugering ved 3000 g i 15 minutter, blandet med 45 pi af lactat-assaybuffer. Absorbansen ved 450 nm blev aflæst ved anvendelse af en BioRad680 mikropladelæser (Bio-Rad, Hercules, CA).

iltforbrug blev undersøgt under anvendelse oxygenforbrugshastighed Assay Kit (# 600800, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI) ved at følge fabrikantens instruktion. VICTOR X3 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer) blev anvendt til at detektere OD-værdi ved 650 nm. Satsen iltforbrug blev vist som levetid versus tid (mikrosekunder /time).

kolonidannelse Assay Salg

PC-3 eller MCF-7-celler blev udpladet på en plade med 6 brønde, og transficeret med plasmider, herunder pWZL Neo Myr Flag PKM2 og pcDNA Flag GFP. Efter inkubation i visse tidspunkter blev cellerne trypsiniseret, suspenderet i DMEM indeholdende 10% FBS, udpladet på et bundlag indeholdende 0,6% agar og dækket med et toplag indeholdende 0,6% agar. Cellerne blev dyrket i en 6-brønds plade og medierne blev ændret hver uge. Efter inkubation i 10 dage blev krystalviolet tilsat, og antallet af kolonier blev talt og analyseret med ImageJ software.

Statistical Analysis

Forsøgene undtagen immunoblot assays blev udført i mindst tre gange. Alle værdier blev udtrykt som middel ± SD, og ​​sammenlignet på et givet tidspunkt af uparret, tohalet t-test. Data blev anset for at være statistisk signifikant, når p 0,05 (*) og p. 0,01 (**)

Resultater

OA Forhindrer Aerobic Glycolysis i cancerceller

Aerobic glykolysen er karakteriseret ved øget glukoseoptagelse og laktat produktion, og kompromitteret iltforbrug i cancerceller med høj tilgængelighed til ilt. Derfor målte vi effekten af ​​OA på disse aktiviteter cancercelle. Reduceret glucoseforbrug blev fundet i flere typer af cancerceller, når OA blev tilsat til kulturerne (fig. 1a). Produktionen af ​​mælkesyre i disse cancerceller viste sig også at være nedsat i celler behandlet med OA (fig. 1B). Endvidere OA forøgede forbrug af oxygen i cancerceller (fig. 1C). De ovennævnte data viste, at OA var i stand til at inducere metaboliske ændringer af cancerceller ved at undertrykke aerobe glycolyse.

Glucose forbrug (A), mælkesyre produktion (B) og oxygenforbrug (C) blev vurderet i PC 3 og MCF-7-celler behandlet med 50 eller 100 ug /ml OA i 6 eller 12 timer henholdsvis. Detaljerne i metoden er blevet beskrevet i afsnittet om materialer og metoder. Forholdet mellem hver gruppe til bekæmpelse blev præsenteret her. Søjlerne viste gennemsnitsværdier for tre uafhængige forsøg (gennemsnit ± SD). *, P 0,05; **, P. 0,01

Derudover har vi sammenlignet O

2 indhold i kræftceller med eller uden OA behandling. Dataene viste, at OA ikke har nogen indflydelse på koncentrationen af ​​ilt i cellekultur, hvilket udelukker muligheden for, at OA fører til metabolisk ændring ved at påvirke normic betingelser (figur S1).

OA Fremkalde switchen fra PKM2 til PKM1 og øge PK aktivitet i cancerceller

pyruvatkinase muskel isozym 2 (PKM2), hvis enzymatiske aktivitet er mindre aktiv end PKM1, er ansvarlig for omdannelsen af ​​phosphopyruvate til pyruvat i glycolytiske proces. PKM2, især i sin dimere form, akkumulerer glycolytiske mellemprodukter og kanaler dem i biosyntesen af ​​nukleotid- og aminosyrer, hvilket bidrager til væksten af ​​celler. PKM2 har vist sig at være højt udtrykt i alle prolifererende celler, såsom tumorceller [4]. For at identificere de mekanismer, der OA ramt aerobe glycolyse, vi efterfølgende evalueret ændringerne i ekspressionsniveauet af PKM1 og PKM2 i cancerceller behandlet med OA. Den immunoblot-analyse viste at OA kunne falde PKM2 overflod, og øge PKM1 ekspression i både PC-3 og MCF-7cancer cellelinjer, på en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 2A og 2B). Reduktionen i PKM2 ekspression blev også fundet i immunfluorescensfarvning eksperimenter. Behandling af cancerceller med OA nedreguleres den PKM2 ekspression betydeligt i både PC-3 og MCF-7-celler (fig. 2C). Endvidere blev PK-aktivitet vist sig at være forhøjet i OA-behandlede cancerceller, sammen med kontakten fra PKM2 til PKM1 (fig S2A og S2B).

PKM1 og PKM2 ekspressionsniveauet blev bedømt ved immunoblotting assays i PC 3 og MCF-7-celler behandlet med 10, 25, 50,100 pg /ml OA henholdsvis i 12 timer (A) eller 100 ug /ml OA i 0,5, 1, 2, 3, 6, 12 timer henholdsvis (B). β-tubulin blev anvendt som endogene referencer. (C) De PKM2 niveauer (grøn) i PC-3 og MCF-7-celler behandlet med 100 ug /ml OA i 12 timer som bestemt ved immunfluorescent farvning. De kerner (blå) blev farvet med DAPI. De fusionerede billeder blev vist i bunden af ​​panelet. Fluorescensintensiteten blev kvantificeret med ImageJ software. Forholdet mellem hver gruppe til bekæmpelse blev præsenteret her. Søjlerne repræsenterede de gennemsnitlige værdier af 5 tilfældigt udvalgte eksperimenter.

Stigningen i PK aktivitet forårsaget af PKM2 /PKM1 Switch formidler OA Undertrykkelse af Aerobic Glycolysis

På baggrund af konstateringen af, at skifte fra PKM2 til PKM1 forekommer i cancerceller behandlet med OA, vi efterfølgende undersøgte rolle increaed PK aktivitet i OA undertrykkelse af aerob glykolyse. PC-3-celler blev transficeret med PKM2- eller GFP-udtrykkende vektor inden OA stimulation (Fig. 3A). OA-induceret stigning i PK-aktivitet blev reddet af PKM2 overekspression i PC-3-celler (figur S3). Resultaterne viste også, at glucose forbruget, lactat produktion samt oxygenforbruget alle blev gendannet i celler, der overudtrykker PKM2 (fig. 3B, 3C og 3D). Resultaterne antyder, at forøget PK-aktivitet på grund af PKM2 /PKM1 kontakten er påkrævet for den hæmmende virkning af OA på aerob glykolyse i cancerceller.

(A) OA-behandlede PC-3-celler blev transficeret med pWZL Neo Myr Flag PKM2 (Flag-PKM2) eller kontrol vektor (Flag-GFP). Immunblot-assays blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​PKM2 protein. β-tubulin blev anvendt som endogene referencer. Glucose forbrug (B), mælkesyre produktion (C) og oxygenforbrug (D) blev vurderet i PC-3-celler behandlet med 100 ug /ml OA i 12 timer. Detaljerne i metoden blev beskrevet i afsnittet om materialer og metoder. Forholdet mellem hver gruppe til bekæmpelse blev præsenteret her. Søjlerne viste gennemsnitsværdier for tre uafhængige forsøg (gennemsnit ± SD). *, P 0,05; **, P. 0,01

OA Undertrykkelse af mTOR medierer Ændring i Expression Profiler af PKM Isoformer og Metabolic Skift i kræftceller

Vi var interesseret i, hvordan OA induceret falde i kontakten fra PKM2 til PKM1 i kræftceller. mTOR signalering har vist sig at deltage i kontakten af ​​PKM isoformer i cancerceller [9]. Derfor har vi opdaget ændringerne i aktiv status mTOR i OA-behandlede cancerceller. Immunoblotting-analyse afslørede, at mTOR aktivering blev formindsket, da OA blev tilsat til kulturen i cancerceller (fig. 4A). Genaktivering mTOR af MHY1485 beskyttede kræftceller fra OA-medieret fald i PKM2 udtryk og stigning i PKM1 niveauer (fig. 4B). Vores yderligere undersøgelse viste, at glucoseforbrug, lactatet produktion og forbruget rate oxygen også gendannes i celler behandlet med MHY1485 (fig. 4C, 4D og 4E). Resultatet viser, at mTOR er ansvarlig for OA inducerede skift af PKM isoformer og stofskifte.

(A) Niveauerne af phosphoryleret mTOR blev undersøgt i PC-3 og MCF-7 celler behandlet med 50 eller 100 mg /ml OA i 6 eller 12 timer henholdsvis som bestemt ved immunoblot assays. β-tubulin blev anvendt som endogene referencer. (B) Immunoblotanalyse af PKM1 og PKM2 ekspression blev udført i PC-3-celler inkuberet med OA (100 ug /ml) eller /og en mTOR aktivator MHY1485 (2 uM). Glucose forbrug (C), mælkesyre produktion (D) og oxygenforbrug (E) blev påvist i PC-3-celler behandlet med OA (100 ug /ml) og /eller MHY1485 (2 uM) i 12 timer. Forholdet mellem hver gruppe til bekæmpelse blev præsenteret her. Søjlerne viste gennemsnitsværdier for tre uafhængige forsøg (gennemsnit ± SD). *, P 0,05; **, P. 0,01

OA-induceret mTOR Suppression inducerer switchen af ​​PKM Isoformer Ved at hæmme c-myc-afhængige hnRNPA1 og hnRNPA2 Expression

mTOR er blevet påvist at ophøje PKM2 niveau ved at stimulere c-myc-afhængige hnRNPA1 og hnRNPA2 udtryk [9], som begge er ansvarlige for den eksklusive splejsning af PKM mRNA [3]. Vi efterfølgende bestemt indflydelse OA på ekspressionen af ​​hnRNPA1 og hnRNPA2. Resultaterne viste, at OA kan reducere ekspressionsniveauet af c-Myc, samt dens målgen hnRNPA1 og hnRNPA2 ekspression (fig. 5A). mTOR aktivering medieret af MHY1485 kunne genoprette ekspressionen af ​​c-myc, hnRNPA1, og hnRNPA2 i OA-behandlede cancerceller (fig. 5B). Endvidere transfektion af OA-behandlede cancerceller med plasmider, der udtrykker c-Myc ophævet virkningen af ​​OA baseret på ændringen i PKM1 og PKM2 udtryk (fig. 5C). Resultaterne antyder, at OA kan inducere PKM2 /PKM1 kontakten via c-Myc-afhængige hnRNPA1 og hnRNPA2 mTOR signal pathway’en.

(A) Ekspressionen af ​​c-Myc, hnRNPA1 og hnRNPA2 blev bestemt ved immunoblotanalyse i PC -3 og MCF-7-celler behandlet med 50 eller 100 ug /ml OA i 6 eller 12 timer henholdsvis. (B) Den expressionof c-Myc, hnRNPA1 og hnRNPA2 ekspression blev bestemt ved immunoblotanalyse i PC-3-celler behandlet med OA (100 ug /ml) eller /og MHY1485 (2 uM) hhv. (C) Niveauet af c-Myc, hnRNPA1, hnRNPA2, PKM1 og PKM2 blev bestemt ved immunoblot assays i PC-3-celler behandlet med plasmider pMXs-hcMYC (Flag-cMyc) i nærvær eller fravær af OA. β-tubulin blev anvendt som endogene referencer.

Reduceret Aerobic Glycolysis Delvist regnskab for Anti-tumor aktivitet af OA

For at løse bidrag nedsat aerob glykolyse til tumor suppressor aktivitet OA på kræftceller, vi har registreret ændringer i maligne fænotyper af OA-stimulerede kræftceller, som stadig gennemgik aerobe glycolysen grund PKM2 overekspression. OA blev fundet at reducere væksten af ​​PC-3-celler (fig. 6A). Også antallet af kolonier dannet i PC-3-celler blev også mindskes under behandling af OA (OA + GFP gruppe) (fig. 6B). Imidlertid PKM2 restaurering signifikant afskaffet effekten af ​​OA på cancerceller, fremgår af stigningen i vækstraten og antallet af dannede kolonier i PC-3-celler co-behandlet med OA og PKM2-udtrykkende vektorer (OA + PKM2 gruppe) ( fig. 6A og 6B).

(A) PC-3-celler blev talt 12, 24, 36 og 48 timer efter behandling af OA (100 ug /ml) eller /og MHY1485 (2 uM) ved anvendelse hemacytometry. De gennemsnitlige værdier af tre uafhængige forsøg blev vist som gennemsnit ± SD. **, P 0,01. Den repræsentativt tal blev vist for hver gruppe. (B) Celler blev behandlet med OA (100 ug /ml) eller /og MHY1485 (2 uM) i 10 dage, blev antallet af kolonier af PC-3-celler talt og analyseret ved anvendelse ImageJ software. Den repræsentativt tal blev vist for hver gruppe. (C) OA undertrykker aktiveringen af ​​mTOR i cancerceller. Denne inhiberende virkning på mTOR signalering til gengæld ophævet c-Myc /hnRNPA1 /hnRNPA2-afhængig PKM2 ekspression. Derfor blev den aerobe glykolyse hæmmet i cancerceller behandlet med OA.

Sammenfattende OA undertrykker aktiveringen af ​​mTOR signalering i kræftceller. Til gengæld den inhiberende virkning af OA på mTOR pathway fører til omskifteren fra PKM2 til PKM1 ekspression, der medieres af c-Myc /hnRNPA1 /hnRNPA2 pathway. Til sidst blev aerobe glycolyse undertrykt i OA-behandlede cancerceller (fig. 6C).

Discussion

OA, en naturlig forbindelse vidt udbredt i planter, er blevet dokumenteret at besidde en række bioaktiviteter herunder anti-tumor ejendom [10]. Mekanismerne i OA antitumoraktivitet involverer apoptose induktion, cellecyklusstandsning og metastaseinhibering [7], [8]. Men virkningen af ​​OA på den metaboliske vej i cancerceller er stadig uklar. I denne undersøgelse fandt vi, at OA var i stand til at undertrykke Warburg virkning i kræftceller, som fremgår af en øget iltforbrug, reduceret laktat produktion og lavere glukoseoptagelse (Fig. 1A-1C). Så vidt vi ved, er dette den første gang at afsløre, at OA påvirker den metaboliske skift af cancerceller. Vores fund kan bidrage til forståelsen af ​​OA virkning på cancerceller og hjælpe til udvikling af OA og dets derivater med mere potent virkning til klinisk anvendelse.

Aerob glycolyse antages at være en hidtil ukendt, vigtig og effektiv mål i cancer kemoterapi. Stigende beviser tyder på, at aerob glykolyse spiller en kritisk rolle i opståen og udvikling af maligne sygdomme. Flere forbindelser er blevet rapporteret at undertrykke væksten af ​​tumorceller ved at påvirke aerob glykolyse [11] – [15]. For tilfælde blev ekstrakten fra Spatholobus suberectus vist at inhibere aktiviteten af ​​lactatdehydrogenase A (IdhA), hvorved undertrykke den aerobe glycolyse i brystcancerceller [13]. En anti-inflammatorisk forbindelse, curcumin, er for nylig blevet demonstreret at vende Warburg påvirkning via tumornekrosefaktor (TNF) stimulering i brystcancerceller [14]. Vores undersøgelse bekræftede, at OA også besidder den inhiberende aktivitet på aerob glykolyse. Undersøgelsen øger forståelsen af ​​anticancer mekanisme for OA.

Mange undersøgelser har afsløret, at PKM2 spiller en central rolle i aerob glykolyse i cancerceller [3]. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at PKM2 ekspression kan inhiberes i celler behandlet med OA på en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 2A-2C). Vigtigere, forøget PK-aktivitet, på grund af PKM2 /PKM1 switch, medieret effekten af ​​OA på aerob glykolyse i cancerceller, da reducerende PK-aktivitet ved overekspression PKM2 niveau i cancerceller afskaffet OA-induceret metabolisk omskifter (fig. 3A-3D ). OA er derfor identificeret som den første sammensatte reducere PKM2 overflod, og udøver sin virkning på stofskiftet i kræftceller via et nyt mål. Derfor har vi forudsat indledende beviser, at målrette PKM2 kan være en roman strategi for at udvikle kræft agenter, og OA kan være en ledende stof til udvikling af anti-cancer lægemidler rettet mod PKM2.

Afvigende aktivering af mTOR signalering er tæt involveret i en række forskellige cancere [16]. mTOR aktivering fremmer resistens af cancerceller over for apoptose induceret af begge cytokiner og kemoterapeutiske midler, accelererer proliferation af en lang række af cancerceller, og letter metastaser [16]. De fleste af de nuværende mTOR inhibitorer undertrykke væksten af ​​cancerceller primært ved at inducere apoptose og cellecyklusstandsning, eller forringe metastase [17] – [19]. I denne undersøgelse fandt vi, at OA reducerer ekspressionsniveauet af phosphoryleret mTOR i cancerceller (fig. 4A) forbundet med dets inhiberende aktivitet på aerob glykolyse. For nylig er mTOR signalering vist sig at modulere metabolisk omskifter i cancerceller og denne virkning er medieret af ændringen i PKM2 ekspression [14], [20], [21]. Endvidere mTOR /PKM2 vej er ansvarlig for i det mindste, lever tumorigenese [22]. Disse nye fund tyder på, at målrette metabolisme kan være en roman strategi mTOR-hæmmer til at undertrykke væksten af ​​kræft.

Kollektivt, beviste vi beviser for, at OA var i stand til at skifte metaboliske mønstre fra aerob glykolyse til oxidativ fosforylering gennem påvirker mTOR /c-Myc /PKM2 pathway i cancerceller. I betragtning af dets lave toksicitet over for normale væv, kan OA og dets analoger være en lovende kandidat middel til udvikling anticancermidler målretning metabolisme. Vores undersøgelser bidrage til en bedre forståelse af mekanismen for OA antitumor ejendom, og også den undersøgelse giver primære beviser for, at PKM2 kan vælges som en kritisk terapeutisk mål i aerob glykolyse vej i udviklingen af ​​nye anticancer midler.

Støtte Information

Figur S1.

OA ikke påvirke indholdet af ilt i cellekultur. PC-3 og MCF-7 celler blev behandlet med eller uden OA i 12 timer. O

2-indhold blev påvist med i de angivne tidspunkter. De gennemsnitlige værdier for tre uafhængige forsøg blev vist som gennemsnit ± SD

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091606.s001

(PPT)

Figur S2.

OA inkubation inducerede højden i PK aktivitet i kræftceller. (A) PC-3 og MCF-7 celler blev behandlet med OA i de angivne doser og PK-aktivitet blev bestemt 12 timer efter OA-behandling. De gennemsnitlige værdier af tre uafhængige forsøg blev vist som gennemsnit ± SD. *, P 0,05, ** P 0,01. (B) Aktiviteten af ​​PK blev også vurderet i cancerceller udsat med 100 ug /ml OA i de angivne tidspunkter. De gennemsnitlige værdier af tre uafhængige forsøg blev vist som gennemsnit ± SD. *, P 0,05, ** P 0,01

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091606.s002

(PPT)

Figur S3.

PKM2 overekspression redde elevation i PK aktivitet induceret af PKM2 /PKM1 switch. PK-aktivitet blev evalueret i OA-behandlede PC-3-celler transficeret med PKM2- eller GFP-udtrykkende vektor, 12 timer efter behandling af 100 ug /ml OA. De gennemsnitlige værdier af tre uafhængige forsøg blev vist som gennemsnit ± SD. *, P 0,05

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091606.s003

(PPT)