PLoS ONE: Genotoksisk Effekt af N-hydroxy-4-Acetylaminobiphenyl på menneskelige DNA: Konsekvenser i Blære Cancer

Abstrakt

Baggrund

Samspillet mellem miljømæssige kemikalier og deres metabolitter med biologiske makromolekyler kan medføre cytotoksiske og genotoksiske virkninger. 4-Aminobiphenyl (4-ABP) og flere andre relaterede arylaminer har vist sig at være kausalt involveret i induktionen af ​​humane urinblære kræftformer. De genotoksiske og kræftfremkaldende virkninger af 4-ABP er udstillet, når det er metabolisk omdannes til en reaktiv elektrofil, aryl nitrenium ioner, som efterfølgende binder til DNA og fremkalde læsioner. Selv om flere undersøgelser har rapporteret dannelsen af ​​4-ABP-DNA-addukter, har ingen omfattende arbejde blevet gjort for at undersøge immunogeniciteten af ​​4-ABP-modificeret DNA og dens mulige involvering i frembringelsen af ​​antistoffer i blærecancerpatienter.

Metode /vigtigste resultater

Humant DNA blev modificeret ved N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl (

N

-OH-AABP), en reaktiv metabolit af 4-ABP. Strukturelle perturbationer i

N

-OH-AABP modificerede DNA blev vurderet ved ultraviolet, fluorescens, og cirkulær dikroisk spektroskopi samt ved agarosegelelektroforese. Genotoksicitet af

N

-OH-AABP modificeret DNA blev konstateret af komet assay. Højtryksvæskekromatografi (HPLC) analyse af indfødte og modificerede DNA-prøver bekræftede dannelsen af ​​

N

– (deoxyguanosin-8-yl) -4-aminobiphenyl (dG-C8-4ABP) i

N

-OH-AABP beskadiget DNA. De eksperimentelt inducerede antistoffer mod

N

-OH-AABP-modificeret DNA udviste meget bedre erkendelse af DNA isoleret fra blærecancerpatienter sammenlignet med DNA opnået fra raske individer i kompetitiv binding ELISA.

konklusioner /betydning

Dette arbejde viser epitop deling mellem DNA isoleret fra patienter og blære kræft

N

-OH-AABP-modificeret DNA implicerer rolle 4-ABP metabolitter i DNA skader og neo-antigen epitop generation, der kunne føre til induktion af antistoffer i blære kræftpatienter

Henvisning:. Shahab U, Moinuddin, Ahmad S, Dixit K, Habib S, Alam K, et al. (2013) Genotoksisk Effekt af

N

hydroxy-4-Acetylaminobiphenyl på menneskelige DNA: Konsekvenser i blærekræft. PLoS ONE 8 (1): e53205. doi: 10,1371 /journal.pone.0053205

Redaktør: Rizwan Hasan Khan, Aligarh muslimske University, Indien

Modtaget: 31 Juli 2012; Accepteret: November 26, 2012; Udgivet: 31 januar 2013

Copyright: © 2013 Shahab et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist finansieret af ICMR giver no. Immuno 18/11/18/2008-ECD-I (som nu står færdig), og midlerne fra universitetet (Aligarh muslimske University). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

DNA celler udsat for en kemisk kræftfremkaldende næsten altid indeholder et sæt af strukturelt forskellige kræftfremkaldende-nukleotid addukter [1]. Det formodes, at forkert replikation eller misrepair af et undersæt af disse addukter giver anledning til mutationer, som igen kan være de genetiske forstadier til kræft fænotype. En sådan kræftfremkaldende er 4-aminobiphenyl, en aromatisk amin. Disse er stand til at inducere en række toksiske virkninger, herunder cancer og met-hemoglobinemia [2]. 4-ABP er en miljømæssig og erhvervsmæssig forurenende genereret hovedsageligt fra cigaretrøg, forbrænding af fossile brændstoffer og fra gummi, kul, tekstil og udskrive industrier [3] – [5]. 4-ABP har vist sig at være en væsentlig ætiologisk agens for human blærecancer, og også en potent urinblære kræftfremkaldende i forsøgsdyr [6], [7]. 4-ABP-rester er blevet rapporteret i hæmoglobin og i DNA isoleret fra blæren af ​​rygere [8], [9]; potentielt implicerer 4-ABP i ætiologien af ​​blærecancer. Den kemiske struktur af 4-ABP og dets fysiologiske metabolit,

N

-OH-AABP, er placeret som figur 1A

Agarosegelelektroforese af nativt og

N

. – OH-AABP modificeret menneskelige DNA [b]. DNA-prøver fra banerne 2-5 blev behandlet med stigende koncentration af

N

-OH-AABP. Bane 1: Native humant DNA; Bane 2: Native menneskelig DNA med 0,378 mM

N

-OH-AABP; Bane 3: Native menneskelig DNA med 0,757 mM

N

-OH-AABP; Bane 4: Native menneskelig DNA med 1,136 mM

N

-OH-AABP; Bane 5: Native menneskelig DNA med 1,515 mM

N

-OH-AABP

De genotoksiske og kræftfremkaldende effekter er udstillet, når 4-ABP er metabolisk omdannes til en reaktiv elektrofil.. Den primære skridt er

N

oxidation af arylaminer og arylacetamides ved specifik cytochrom

P

450 (CYP1A2) i hepatiske væv [10], efterfulgt af konjugation af

N

hydroxyl funktion med acetat, sulfat, eller glucuronat [11] – [14]. De aktiverede elektrofile derivater af 4-ABP udøver deres genotoksiske virkning gennem interaktion med DNA dannende addukter, der er blevet rapporteret for en rolle i blære carcinogenese både i forsøgsdyr [15] – [17] og mennesker [18], [19]. DNA-addukter er også rapporteret ved eksponering af humane blære celler til

N

-OH-ABP,

N

-OH-AABP og

N

-OAc-AABP [20 ] – [22]. Imidlertid har den største (80%) DNA addukt dannet blevet identificeret som

N

– (deoxyguanosin-8-yl) -4-aminobiphenyl (dG-C8-ABP) [19]. Selvom de store DNA-læsioner er et resultat af kovalent adduktdannelse, disse metabolitter også forårsage oxidativ DNA-skade producerer reaktive oxygenarter [23], der i sidste ende generere DNA-strengbrud og basemodifikationer, såsom 8-oxo-guanin og beslægtede produkter [24] , [25].

virkemåde af forskellige kræftfremkaldende stoffer er bedre konstateres ved at analysere deres genotoksicitet [26]. Den foreliggende undersøgelse rapporterer strukturelle ændringer i menneskets DNA ved inkubering med

N

-OH-AABP i 24 timer. Det modificerede DNA blev karakteriseret ved forskellige spektroskopiske teknikker, gelelektroforese og termiske denaturering undersøgelser. Den genotoksicitet

N

-OH-AABP blev konstateret gennem komet assay. Antistoffer mod

N

-OH-AABP-DNA blev induceret i hunkaniner og anvendt som et immunokemisk probe til påvisning af læsioner forårsaget af 4-ABP metabolitter, i DNA’et af blærecancerpatienter.

Etik Statement-

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Ethics Committee of JN Medical College, AMU, Aligarh, Indien (tillade nr. 401 /CPCSEA). Blodprøver fra patienter og raske personer blev opsamlet efter informeret verbal samtykke.

Materialer og metoder

N

-OH-AABP var fra Midtvesten forskningsinstitut Kansas. Humant placentalt DNA, methyleret bovint serumalbumin (MBSA), ethidiumbromid, protein A-agarose (2,5 ml præ-pakket søjle), anti-kanin IgG alkalisk phosphatase-konjugater, p-nitrophenylphosphat, Tween-20, Freunds komplette ufuldstændige adjuvanser, Histopaque 1077, agarose med lavt smeltepunkt (LMPA), RPMI 1640, Triton-X 100, trypanblåt, og phosphatpufret saltvand (PBS) Ca

2+ og Mg

2+ var fra Sigma Chemical Company , USA. Polystyren mikrotiterplader fladbundet ELISA-plader var fra Nunc (Danmark). Alle andre kemikalier og reagenser anvendt var af højeste analysekvalitet.

Modifikation af human placental DNA

humant placentalt DNA (15 uM) blev modificeret ved inkubering ved 37 ° C i 24 timer med varierende koncentrationer (0,378 mM, 0,757 mM, 1,136 mM og 1,515 mM) af

N

-OH-AABP i DMSO. Ubundne bestanddele blev fjernet ved omfattende dialyse mod natriumphosphatpuffer (10 mM, pH 7,4) indeholdende 150 mM NaCl.

agarosegelelektroforese

iagttoges Ændringen i elektroforetiske mønster af nativt og modificeret DNA på 1% agarose ved 30 mA i 2 timer i TAE-buffer (40 mM Tris-acetat, 2 mM EDTA, pH 8,0). Gelerne blev farvet med ethidiumbromid og visualiseret under UV-lys.

Isolering af lymfocytter

Hepariniserede blodprøver (2 ml) fra raske donorer og patienter blev fortyndet passende i Ca

2+ og Mg

2+ free PBS. Lymfocytter blev isoleret fra blod ved hjælp Histopaque 1077 og cellerne blev til slut suspenderet i RPMI 1640.

Levedygtighed Vurdering af lymfocytter

Lymfocytterne blev kontrolleret for deres levedygtighed før starten og efter afslutningen af ​​den reaktion under anvendelse af Trypan Blå udelukkelse test [27]. Levedygtigheden af ​​cellerne viste sig at være større end 93%.

lymfocyt behandling

Lymfocytter (1 × 10

5-celler) blev udsat for forskellige koncentrationer af N-OH-AABP (0,378 mM, 0,757 mM, 1,136 mM, 1,515 mM) i et totalt reaktionsvolumen på 1 ml og inkuberet ved 37 ° C i 90 minutter. Efter inkubationen blev blandingen centrifugeret ved 4000 rpm, supernatanten blev kasseret, og de pelleterede lymfocytter blev resuspenderet i 100 pi PBS (Ca

2+ og Mg

2+ free) og behandles yderligere for Comet assay.

Comet assay

Comet assay blev udført som pr protokollen givet i en tidligere publikation fra vores laboratorium [28].

Fysisk analyse

fluorescens analysen var udført på Shimadzu (RF-5301-PC) spectrofluorophotometer. Prøverne blev anslået ved 325 nm og emission profil blev registreret i 500 til 700 nm området. Cirkulære dichroisme (CD) målinger af indfødte og modificeret menneskelige DNA blev optaget på Jasco J-815 spektropolarimeter i 220-400 nm bølgelængdeområdet. Alle scanninger blev optaget ved et interval på 1 nm.

højtryksvæskekromatografi

Højtryksvæskekromatografi (HPLC) analyse af nativt og modificeret DNA blev udført på Biologic Duo flow-system, BioRad , (USA) udstyret med UV-Visible multi bølgelængde detektor. Absorbansen blev overvåget ved 245 nm. Kort fortalt 50 pM DNA-prøve blev hydrolyseret i 0,1 N HCI (1 ml /mg DNA) ved 100 ° C i 30 minutter (for at frigive de baser) og tørret under vakuum. Baserne blev opløst i 50 pi af 0,1 M Tris-HCI-buffer, pH 8,5 og filtreret gennem 0,42 uM Milex, engangs Syring filter før læsning på C-18 omvendt fase-søjle (Supelco, Discovery 25 cm x 4,6 mm). Eluenten bufferen var 12,5 mM citronsyre, 25 mM natriumacetat, 25 uM ethylendiamintetraacetat (EDTA), pH 5,2 og en strømningshastighed på 1 ml /min blev opretholdt i hele.

immuniseringsprogram

tilfældige opdrættes, New Zealand White (NZW) hunkaniner blev immuniseret som beskrevet tidligere [28], [29]. Kort beskrevet kaniner (n = 4; to hver for nativt og modificeret DNA) blev immuniseret intramuskulært på flere steder med 50 ug respektive antigener kompleksbundet med methyleret BSA i 1:01 forhold (vægt /vægt) og emulgeret med et tilsvarende volumen af ​​Freunds adjuvans.

Oprensning af antistoffer

Immunoglobulin G (IgG) blev affinitetsoprenset fra præimmune og immune sera på en protein a-agarose-søjle [30]. Homogenitet isolerede IgG blev konstateret med 7,5% SDS-PAGE.

DNA Isolation fra humant blod

Blodprøver blev opsamlet i EDTA hætteglas fra forskellige blære kræftpatienter og normale sunde individer. Lymfocyt DNA blev isoleret i henhold til fabrikantens anvisninger. 5 ml blod blev tilsat til 500 pi Qiagen protease og derefter buffer AL (6 ml) blev blandet efterfulgt af kraftig omrystning. Blandingen blev inkuberet ved 70 ° C i 10 minutter og 5 ml ethanol (98%) blev sat til prøven og blandet ved at vende røret og kraftig omrystning. Opløsningen blev forsigtigt overført til QIAamp Maxi-søjle anbragt i et 50 ml centrifugerør og centrifugeres ved 1850 x g (3000 rpm) i 3 min. Filtratet blev kasseret, og 5 ml buffer AW2 blev tilsat og igen centrifugeret ved 4500 x g (5000 rpm) i 1 min. Igen 5 ml AW2 puffer blev tilsat, og centrifugeret ved 4500 x g (5000 rpm) i 15 min, og filtratet blev bortkastet. Derefter 600 pi buffer AE blev hældt direkte på membranen af ​​kolonnen som senere blev inkuberet i 5 min og centrifugeret ved 4500 x g (5000 rpm) i 2 minutter. Eluenten blev genindlæst på membranen af ​​søjlen, inkuberet i 5 minutter og centrifugeret ved 4500 x g (5000 rpm) i 5 min. Eluenten indeholdt DNA blev lufttørret og opløst i PBS, pH 7,4. Renheden og koncentrationen af ​​DNA præparat blev konstateret af A

260 og A

280 målinger.

ELISA

Specifik binding af antistoffer blev konstateret i kompetitiv binding assay [31]. Procent hæmning blev beregnet ud fra den givne formel:.

Procent hæmning = 1- (A

hæmmet /A

uhæmmet) × 100

Resultater og Diskussion

gelen mønster (figur 1B) viser en stigning i mobiliteten af ​​modificeret DNA med stigende koncentration af

N

-OH-AABP (bane 2-5). Den maksimale mobilitet blev observeret med 1,515 mM

N

-OH-AABP; og enhver yderligere forøgelse af dets koncentration resulterede i fuldstændig tab af DNA-struktur. Den øgede mobilitet af N-OH-AABP behandlede DNA kan skyldes genereringen af ​​enkelt strengbrud, som kan resultere i dannelsen af ​​lille størrelse DNA med hurtigere mobilitet sammenlignet med native DNA af bane 1. Et tab i fluorescensen af DNA blev også observeret som en funktion af stigning i koncentrationen af ​​

N

-OH-AABP. Dette peger igen mod skader på spiralformede struktur af DNA.

encellede gelelektroforese (SCGE) eller komet assay er en meget sensitiv fremgangsmåde til evaluering DNA beskadigelse. Under elektroforese den beskadigede DNA migrerer fra kernen mod anoden og danner en form som en “komet” med et hoved (cellekerne med intakt DNA) og en hale (afslappet og brudt DNA). Derfor kan komet assay anvendes til at teste genotoksicitet af kræftfremkaldende stoffer i dyrkede celler, herunder frisk isolerede humane lymfocytter. I denne undersøgelse har vi anvendt kometen-analysen til at analysere skader på menneskers lymfocyt DNA på

N

-OH-AABP behandling. Comet billeder, ved behandling af lymfocytter med forskellige koncentrationer af

N

-OH-AABP, er præsenteret i figur 2. En komet med en hale er tegn på DNA-brud i enkelt celle gelelektroforese. Vores resultater klart fastslået DNA-skade efter behandling med 1,515 mM

N

-OH-AABP, som det fremgår af dannelsen af ​​særskilte hale fra den spredte hoved (Figur 2E). Vi observerede, at med stigende koncentrationer af

N

-OH-AABP den procentvise DNA i halen også steget. Ved 0,378 mM koncentration af

N

-OH-AABP, 19% af DNA blev fundet i halen. Men på 0,757 mM og 1,136 mM

N

-OH-AABP procentdelen af ​​halen DNA steget til 27% og 58% hhv. Det steg yderligere til 89% ved 1,515 mM

N

-OH-AABP. DNA skader parametre, dvs. oliven hale øjeblik (OTM) og hale længde blev også målt og fundet at øges væsentligt med 1,515 mM

N

-OH-AABP i forhold til 0,378 mM, 0,757 mM og 1,136 mM

N

-OH-AABP. En markant stigning i OTM (94%) blev observeret i lymfocytterne behandlet med 1,515 mM

N

-OH-AABP når sammenlignet med kontrol (ubehandlede lymfocytter). Desuden blev en væsentlig stigning i halen længde registreres også. Det viste sig at være 72% højere end for ubehandlet lymfocytkontrol. Resultaterne er opsummeret i tabel 1.

Alle lymfocytterne blev behandlet i 24 h ved 37 ° C.

I et tidligere publikation, observerede vi 62% hyperchromicitetsassay på 260 nm i UV-absorption spektrum af

N

-OH-AABP modificeret humant DNA [32]. Den observerede hyperchromicitetsassay repræsenterer eksponering af chromofore grupper som følge af generation af strengbrud og dissociation af hydrogenbindinger i tilfælde af modificeret DNA.

Hverken native DNA eller dens modificeret form har sin egen fluorescens og derfor et ydre fluorophor ethidiumbromid, blev anvendt til fluorescens-spektroskopi af DNA og dets

N

-OH-AABP-modificeret form. Native og

N

-OH-AABP modificerede DNA blev inkuberet med ethidiumbromid i 30 minutter og emission profil blev registreret under anvendelse excitationsbølgelængde (325 nm) af ethidiumbromid (figur 3A). Et fald på 43.17% i fluorescensintensiteten af ​​modificeret DNA, sammenlignet med dens native form, betyder forstyrrelser i DNA dobbelt spiralformet struktur som følge af

N

-OH-AABP modifikation.

fluorescensemissionsspektrer af nativ human DNA (—) og modificeret humant DNA med 1,515 mM

N

-OH-AABP (-) [a]. Cirkulære dichroic spektre af indfødte menneskelige DNA (-) og

N

-OH-AABP modificeret humant DNA (—-) [b]

Ændringer i DNA-strukturen var. evalueret af ellipseform målinger.

N

-OH-AABP modificerede DNA udstillet en 5 nm skift (275-280 nm) i cd-signalet sammen med en stigning i ellipseform 5,57-9,27 mdeg (figur 3B), hvilket indikerer strukturelle ændringer i DNA-molekylet. Stigningen i ellipseform svarer til 39,9% tab i DNA-struktur ved ændringer. Denne strukturelle tab kan skyldes afstabling af DNA baser som følge af helix destabilisering. De strukturelle forstyrrelser foreslår udfoldning af DNA, kan skyldes den generation af enkelte strengbrud.

Figur 4A og 4B viser repræsentative HPLC-kromatogrammer af sure hydrolyserede prøver af indfødte og

N

-OH- AABP modificeret humant DNA hhv. Veldefinerede toppe ved retentionstiden 4,467 min, 7,332 min og 8,727 min blev observeret i native menneskelige DNA. Men i tilfælde af modificerede DNA disse toppe flyttet til 4,631 min, 7,443 min og 9,164 min henholdsvis tyder modifikation af DNA-baser. Den ekstra top ved en retentionstid på 22,029 minutter i det sure hydrolysat af modificeret DNA er karakteristisk for dG-C8-4-ABP addukt, en kendt markør for DNA beskadiget af 4-ABP og

N

-OH- AABP [33]. Identifikationen af ​​dG-C8-4-ABP addukt er i overensstemmelse med de offentliggjorte rapporter om dna-addukter med arylaminer i forsøgsdyr [15] – [17]. Lignende DNA-addukter er blevet rapporteret i de biopsi prøver fra mennesker urinblære [18], [19].

Repræsentant HPLC kromatogram af syre hydrolysat af

N

-OH-AABP modificeret humant DNA [b].

Kvindelige kaniner immuniseret med

N

-OH-AABP modificeret humant DNA viste kraftig humorale respons fremkalde høje titre immunogenspecifikke specifikke antistoffer. De eksperimentelt inducerede antistoffer blev anvendt som et immunokemisk probe til påvisning

N

-OH-AABP eller beslægtede arylaminer inducerede læsioner i det genomiske DNA af blærecancerpatienter. Den bindende mønster af DNA isoleret fra blærecancerpatienter blev ganske afslørende i kompetitiv inhiberingsassay. Hæmning af anti-

N

-OH-AABP-DNA IgG ved lymfocyt DNA fra blære kræftpatienter blev indspillet i størrelsesordenen 60,5% til 77,6%. Mens inhiberingen forårsaget af lymfocyt DNA fra normale sunde individer var ret lav (tabel 2). Markant høj anerkendelse af lymfocyt-DNA fra patienter blærekræft ved eksperimentelt inducerede antistoffer mod

N

-OH-AABP modificeret DNA en klar indikator for epitop deling mellem det genomiske DNA af patienter blærekræft og menneskelige DNA ændret

in vitro

af

N

-OH-AABP. Dette fører til den konklusion, at

N

-OH-AABP, eller et beslægtet arylamin, genererer neo-epitoper på DNA-molekylet, der er anerkendt som ‘

alien

‘ eller

ikke self

af immunsystemet resulterer i autoantistof produktion i blærecancerpatienter. Markant højt anerkendelse af det genomiske DNA fra patienter blærekræft ved eksperimentelt inducerede antistoffer mod

N

-OH-AABP modificeret menneskelige DNA er et bevis mod inddragelse af modificerede baser og enkelte streng regioner i sygdommen patogenese .

anerkendelser

forfatterne anerkender støtte for infrastruktur fra DST-FIST facilitet af afdelingen.