PLoS ONE: Glutathion Udtømmelse og Carbon Ion Stråling potensere grupperet DNA-læsioner, celledød og Forhindre Kromosomal Ændringer i cancerceller Progeny

Abstrakt

Dårlig lokal kontrol og tumorundvigelse er af stor bekymring i hoved-og-hals cancere behandlet ved konventionel strålebehandling eller hadrontherapy. Reduceret glutathion (GSH) er mistænkt for at spille en vigtig rolle i mekanismer, der fører til radioresistance, og dens udtømning bør gøre det muligt oxidativt stress insult, hvorved modificere beskaffenheden af ​​DNA-læsioner og de efterfølgende kromosomale ændringer, der måske føre til tumorundvigelse.

Denne undersøgelse har til formål at fremhæve betydningen af ​​en GSH-udtømning strategi (dimethylfumarat, og l-buthioninsulfoximin forening) kombineret med carbon-ion eller X-ray bestråling på typer af DNA-læsioner (sparsom eller klynger) og den efterfølgende overførsel af kromosomal ændringer af afkommet i en radioresistente cellelinie (SQ20B), der udtrykker et højt endogene GSH-indhold. Resultaterne er sammenlignet med dem for en radiosensitive cellelinie (SCC61) viser en lav endogen GSH niveau.

DNA damage målinger (γH2AX /komet assay) viste, at en transient GSH udtømning hos resistente SQ20B-celler forstærkes virkningen af ​​bestråling ved indledningsvis stigende sparsomme DNA-brud og oxidative læsioner efter røntgenbestråling, mens carbon ion bestråling forøgede kompleksitet klynger oxidativ skade. Desuden blev resterende DNA dobbelt-streng brud målt uanset stråling kvaliteter. Arten af ​​de oprindelige DNA-læsioner og mængden af ​​resterende DNA-skader svarede til dem observeret i følsomme SCC61 celler efter begge typer af bestråling. Misrepaired eller unrepaired læsioner kan føre til kromosomale ændringer, der anslås i celle afkom af cytome assay. Begge typer af bestråling inducerede afvigelser i nondepleted resistente SQ20B og følsomme SCC61 celler. Den GSH-depletion strategi forhindrede overførsel af afvigelser (komplekse rearrangementer og kromosom pause eller tab) i radioresistente SQ20B kun når forbundet med carbon-ion bestråling. En GSH-brydende strategi kombineret med hadrontherapy kan således have betydelig fordel i pleje af patienter, ved at minimere genomisk ustabilitet og forbedre lokal kontrol

Henvisning:. Hanot M, Boivin A, Malésys C, Beuve M, Colliaux A, Foray N, et al. (2012) Glutathion Udtømmelse og Carbon Ion Stråling potensere grupperet DNA-læsioner, celledød og Forhindre Kromosomal Ændringer i kræftceller afkom. PLoS One 7 (11): e44367. doi: 10,1371 /journal.pone.0044367

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: 3. september 2011; Accepteret: August 6, 2012; Udgivet: 20. november 2012 |

Copyright: © 2012 Hanot et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af ETOILE Research Program gennem det regionale program for forskning i Hadrontherapy /Lyon Universitet, under CPER 2007-13 finansiering og Fondation Synergie Lyon kræft og Ligue contre le cancer (Ain). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Carbon ion hadrontherapy er yderst effektivt til behandling af cancer beliggende i nærheden kritiske organer i fare, der er resistent over for konventionel strålebehandling, såsom hoved-og-hals pladecellecarcinom (HNSCC), fordi en mere præcis og kraftfuld dosis kan påføres, hvilket fører til en høj relativ biologisk effektivitet [1]. Carbon ioner fremkalde skadelig grupperet skade, der omfatter en kombination af DNA dobbelt- og enkeltstrengede pauser (DSB og SSB), og abasiske steder i umiddelbar nærhed af oxiderede baser. I modsætning til disse carbon-ion-inducerede klynger læsioner, røntgenstråler inducerer snarere sparse skade [2]. I begge tilfælde kan misrepaired eller udbedrede læsioner føre til kromosomafvigelser [3] – [5]. Nogle kromosomale ændringer transmitteret til celle afkom kan således fremkalde kræft celle tilpasning [6] og tumorundvigelse, den førende årsag til radioterapeutisk svigt. Den stigende interesse for hadrontherapy til behandling stærkt resistente cancere kræver afklaring af virkningen af ​​komplekse DNA-læsioner på den højere forekomst af kromosomale forandringer (CC). Identifikation disse processer vil derfor være et stort fremskridt i forståelsen af ​​kræft tilbagefald, en velkendt træk ved radioresistente HNSCC [7] – [10]

DNA-læsioner og CCs påvirkes af endogene faktorer såsom reaktive. oxygenarter udsugningssystemer. Et højt niveau af endogen reduceret glutathion (GSH) ofte fremmer cancer celleoverlevelse og resistens [11], og dens udtømning, undersøgt i årtier sammen med strålebehandling, citeres i dag for nye terapeutiske overvejelser især til behandling af cancere er resistente over for konventionel eller carbon ion strålebehandling [12] – [15]. Blandt andre strategier, kan en GSH-udtømning strategi bruges som et redskab til at modulere naturen, antallet eller reparation af DNA-skader gennem oxidativt genereret kompleks DNA-skader [16]. Alligevel kun begrænset og er tilgængelige modstridende data vedrørende forholdet mellem GSH-niveau og høj lineær energioverførsel (LET) og lav-LET stråling-induceret DNA-ødelæggelse. For eksempel, Mansour et al. [17] rapporterede, at

N

-acetylcysteine, et GSH forløber, beskytter hepatiske væv fra stråling-induceret DNA-læsioner, mens andre undersøgelser foreslog en svag beskytter rolle eksogen GSH på DNA-læsioner i lymfocytter eller CHO celler [18 ], [19].

Undersøgelser af cytogenetiske virkninger af high-LET stråling er nyttige til at analysere mekanismerne bag tumor celle radioresistance fordi de afspejler de særlige, kapacitet og troskab af reparations- eller misrepair processer, der finder sted i bestrålede celler . De klynger DNA-læsioner induceret af kulstof ion bestråling er kendt for at føre til meget komplekse kromosomforandringer på metafase [3], [5], men lidt er kendt om risikoen for deres overførsel til kræftcelle afkom, som er en potentiel årsag til tumor flugt. Selvom et forhold forbinder oxidativ stress og genomisk ustabilitet er blevet rapporteret [20], [21], data relateret til modulation af antioxidant forsvar (såsom GSH) er stadig modstridende. F.eks uanset stråling kvalitet, en stigning i den endogene GSH pool kan hæmme søsterkromatid udveksling [22], øge veksel- aberrationer [19], eller reducere frekvensen af ​​afvigende metafaser [18]. Sletning er den eneste almindelige type CC rapporteret i tidligere undersøgelser, der viser, at antallet af sletninger korrelerer omvendt med GSH-niveau [18], [19], [23], [24]. Selv om et stigende antal data er tilgængelige, med forklaringer eller hypoteser forbinder disse observationer til de oprindelige radioinduced DNA-læsioner, er data om reparation kapacitet eller risikoen for CC overførsel til cellen afkom stadig mangler. Kun Pujari et al. [19] har foreslået, at høj-LET stråling kombineret med en GSH tilskud marginalt påvirket det kromosomale udveksling frekvens sammenlignet med røntgenstråler, hvilket indikerer, at GSH ikke beskytte celler mod DNA-skade under disse forsøgsbetingelser. Salg

Cytogenetiske undersøgelser har ofte ført til modstridende data, sandsynligvis på grund af de forskelligartede metoder, der skønnes enten tidlige effekter (under metafase eller med for tidligt fødte kromosom kondensationsteknikker) [4], [18], [25] eller senfølger (på afkommet) [26], [27]. Måling af de tidlige virkninger rejser problemet med cellecyklus skift forårsaget af bestråling, hvilket fører til en undervurdering af CCS når data indsamles på kun ét tidspunkt og til en manglende angivelse vedrørende virkningerne på smitsomme hændelser [3], [4 ]. Desuden kræftceller vise en stærkt modificeret genom, der begrænser observationer og målinger af kromosomafvigelser ved hjælp af FISH-maleteknikker [4]. Måling af de senfølger indeholder oplysninger om transformationen eller differentiering i afkommet, men udelukker en begivenhed indtruffet på tidspunktet for første mitose [26], [27]. Der har således været, indtil nu, ingen klar konsensus om der er det mere relevant metode til undersøgelse af risikoen for kromosomafvigelser transmission i overlevende celler.

En alternativ metode kan give et link hensyn kromosomal ustabilitet mellem disse forskellige data og refererer til cytokinese-blokken mikronukleusanalysen der udvikler sig til en “cytome assay” [28] – [31]. Denne analyse er baseret på de morfologiske observationer af kerner efter cytokinese blokering, dvs. celler, der har gennemført en nuklear division identificeres ved deres binucleated udseende. Den indeholder oplysninger om nogle CCs overføres til datterceller [32], [33] gennem mikronucleus og nucleoplasmic bro formation. Dette velbeskrevet assay er nu betragtes som en reference test til overvågning humane CCS og muliggør identifikation af celler, der passerer gennem den første forsinkede mitose. Sådanne overførbare aberrationer kan inducere genomisk ustabilitet i overlevende celler, hvilket fører til tumorundvigelse.

Formålet med den foreliggende undersøgelse var først til at bestemme kvaliteten og mængden af ​​DNA-læsioner i forhold til endogene GSH-niveau og stråling kvalitet, og for det andet at bestemme de fortløbende CCS i overlevende kræftceller efter røntgen og kulstof ion bestråling for at vurdere risikoen for radioinduced ustabilitet og derefter tumorundvigelse. En resistent HNSCC cellelinje (SQ20B) viser en høj endogen GSH (-70 nmol /mg protein) niveau blev valgt som en undersøgelse model. En forbigående GSH-depletion strategi blev anvendt før bestråling, baseret på brugen af ​​dimethylfumarat (DMF), en glutathion-nedbrydende middel, og buthioninsulfoximin (BSO), en glutathion biosyntese-hæmmer. Denne strategi har tidligere været testet [14] i form af in vitro-toksicitet og de aktiverede veje, som fører SQ20B celler til døden efter bestråling blev tydeligt demonstreret. Det gav SQ20B celler til at vise den samme følsomhed som SCC61 celler, en radiosensitive HNSCC cellelinie, der viser en lav endogen GSH-indhold [14], [34]. I dette papir, blev data fra radioresistente SQ20B celler og GSH-udtømte SQ20B celler derfor sammenlignet med følsomme SCC61 celler. At sammenligne begivenheder, der førte til en tilsvarende af celledød, røntgen og 75 MeV /n kulstof ion bestråling blev anvendt ved biologisk ækvivalente doser, under forudsætning af en relativ biologisk effektivitet på omkring 2 til 10% overlevelse for begge cellelinier [34].

samlet set vores resultater fører til en ny forståelse af kvaliteten og antallet af DNA-læsioner i forhold til GSH-niveau og stråling kvalitet og dermed klarlægge nogle divergerende resultater rapporteret i litteraturen. I den forbindelse cytome analysen gav et klart overblik over kromosomafvigelser transmitteret i de overlevende kræftceller. Det gjorde det muligt for påstanden om, at en forøgelse af DNA-læsion kompleksitet opnået ved GSH-depletion adjuverende behandling kombineret med hadrontherapy kan minimere genomisk ustabilitet i resistente kræftceller og dermed reducere fænomenet tumorundvigelse efter strålebehandling.

Materialer og metoder

Cell Kultur og behandlinger

SCC61 (SF2 = 0,36) og SQ20B (SF = 0,72) cellelinier blev dyrket som tidligere [34] beskrevet. Celler blev dyrket i højst 12 passager. Dimethylfumarat (DMF, 100 uM), en GSH-nedbrydende middel og L-buthioninsulfoximin (BSO, 100 uM), en inhibitor af GSH-biosyntese, blev tilsat til SQ20B dyrkningsmediet 4 timer inden bestråling at depletere GSH, som tidligere beskrevet [14]. I nogle forsøg

N

acetyl cystein (NAC, 5 uM) blev også tilsat til dyrkningsmediet 4 timer før bestråling og i kombination med DMF /BSO behandling.

Kemikalier

Primært γH2AX og centromere protein A (CENPA) museantistoffer blev opnået fra Upstate og Abcam henholdsvis og det sekundære antistof AlexaFluor 488 gede-anti-muse-IgG blev opnået fra Invitrogen. Antifade montering medium blev købt fra Dako. Lavt smeltepunkt agarose og SYBR Green opløsning var fra Sigma, og formamidopyrimidin glycosylase (FPG) blev opnået fra Trevigen.

Bestrålingsanlæg Procedurer

Monolag af dyrkede celler blev bestrålet som beskrevet tidligere [35 ]: X-ray bestråling med 6 MV blev udført i Lyon-Sud Hospital (Stråleterapien), Frankrig, på en Clinac CD strålerøret i en dosis på 2 Gy /min. Bestråling med 72 MeV /u kulstof-ioner (lad 33,6 keV /μ) blev udført på GANIL, Caen, Frankrig.

Analyse af Klonogen Cell Survival

Klonogen celle overlevelse blev overvåget efter X-ray og carbon ion eksponering i doser i området fra 1 til 5 Gy. Cellerne blev udsået inden bestrålingen og genpodedes umiddelbart efter eksponering i kolber på 25 cm

2 ved forskellige koncentrationer. Celle overlevelse blev vurderet ved standard kolonidannelse assayet som beskrevet i [35].

HPLC-analyse

Total glutathion blev kvantificeret ved HPLC-analyse. Kort fortalt blev proteiner udfældet fra den cellulære homogenatet med sulfosalicylsyre og centrifugeres ved 13.000 ×

g

. Supernatanten blev derefter derivatiseret med

o

-phthalaldehyde. Kromatografisk separation blev opnået på en 5 um Spherisorb C18-søjle, med en mobil fase bestående af methanol-0,15 M acetatpuffer pH 7 (7.5:92.5). Fluorescens af glutathion

o

-phthalaldehyde derivater blev fundet ved en emission bølgelængde på 420 nm og en excitation ved 340 nm [36].

Immunofluorescens

Påvisning af γH2AX foci eller CENPA blev analyseret ved immunohistokemi. Kort fortalt blev cellerne fikseret i 3% paraformaldehyd i 20 minutter, og immundetektion blev udført som beskrevet [37]. Den CENPA detektion blev udført med cytome beskrevet nedenfor. Digitale billeder blev opnået under anvendelse af et fluorescensmikroskop (Axio Imager Z1 Zeiss mikroskop, 400 ganges forstørrelse). Mindst 100 kerner blev scoret på hver gang til at beregne det gennemsnitlige antal γH2AX foci ved hjælp ImageJ software.

Single DNA Læsion Detection hjælp Alkaline encellede Geleelektroforese (SCGE)

Celler var trypsiniseret, centrifugeret ved 1000 rpm ved 4 ° C, og pelleten blev suspenderet i frysemedium (10% DMSO, 40% DMEM, 50% SVF) og opbevaret ved -80 ° C. Efter optøning blev prøverne centrifugeret (1000 rpm, 4 ° C), og pelleten blev suspenderet i koldt PBS og blandet med 0,6% lav-smeltepunkt agarose. Geler blev spredt ud på objektglas og SCGE teknik blev anvendt som beskrevet af Tice et al. [38]. Objektglas bestemt til oxiderede DNA base-målinger blev vasket med enzymet puffer (0,1 M KCI, 10 mM EDTA, 10 mM HEPES-KOH, 0,02 mg /ml BSA, pH 7,4) og inkuberet i 20 min (37 ° C) med Fpg i enzymet buffer eller med puffer alene. Alle objektglas blev derefter inkuberet i 40 min i en alkalisk elektroforese buffer (pH 13) for at inducere DNA afvikling. Elektroforese blev udført i den samme buffer i 35 minutter ved 25 V /300 mA ved 4 ° C. Objektglassene blev skyllet med 400 mM Tris-base (pH 7,5) for at neutralisere den overskydende alkali. Efter farvning med SYBR Green løsningen blev kerner “kometer” ses på Zeiss mikroskop. blev observeret i alt 100 kometer visuelt og scorede på hvert dias ved hjælp af gratis CASP software. Halen intensitet, defineret som den procentdel af DNA migrere fra lederen af ​​kometen i halen, blev målt for hver scoret kerne.

Cell Cycle Analysis

propidiumiodid (PI) farvning var anvendt til at analysere fordelingen cellecyklus, som tidligere beskrevet [34]. Kort fortalt blev cellerne fikseret med 70% ethanol, inkuberet med 5 ug /ml PI (Sigma-Aldrich) og 0,5 mg /ml RNase A (Sigma-Aldrich), og derefter analyseret ved anvendelse af et FACScan flowcytometer.

Cytome assay: Mikrokerner (MN) og Kromosomal Omlejringer

multiendpoint cytokinese-blokeret mikronukleusanalysen blev anvendt til at vurdere kromosomafvigelser [32]. Cytochalasin B (5 ug /ml) blev tilsat til dyrkningsmediet for at blokere cytokinese og indsamle celler, der var gennemført første kernedeling. Ingen binucleated celler er nummereret i den 5 timer efter tilsætning af cytochalasin B. udvalgt som angivet ovenfor koncentration viste de højeste frekvenser af binucleated celler i kontroller (95%, 28 timer efter tilsætning af cytochalasin B) og havde ingen indflydelse på niveauet for spontant forekommende MN eller nucleoplasmic broer. Cytochalasin B blev sat 4 h før bestråling for at kumulere den mest repræsentative celle population på et binucleated stadie 24 timer senere. Celler blev fikseret i 3% paraformaldehyd og farvet med DAPI (5 ug /ml). I disse forsøg blev forskellige endepunkter overvejet: binucleated celler med MN, centromer-positive MN, nucleoplasmic broer (NPB), og celler med samtidig NPB og MN (NPB + MN) [28], [39], [30]. Disse markører er beskrevet her i stigende rækkefølge af kompleksitet.

Celler med MN. Disse celler er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​både en cellekernen og en eller flere mindre kerner kaldet MN. Hyppigheden af ​​MN i cellepopulationen er udbyttet af MN (Ymn), der beregnes som: hvor MN1 er antallet af celler med én mikronucleus, MN2 antallet af celler med to MN, mnn Antallet af celler med n MN og BN er det totale antal binucleated celler. Tilstedeværelsen af ​​MN er indikativ for tabet af kromosom fragmenter, der svarer til acentriske kromosom /kromatid følge af unrepaired DNA breakage begivenheder. Derimod MN indeholder en eller flere centromerer (immunodetekteret som CENPA) angiver kromatid /kromosom tab. Forholdet mellem centromerfusioner-positive mikrokerner (c + MN) blev estimeret som procentdelen af ​​binucleated celler med c + MN.

Celler med NPB. NPB er kontinuerlige DNA-holdige strukturer forbinder kernerne i en binucleated celle. NPB stammer fra dicentric kromosomer, hvor centromerer trækkes til modsatte poler i anafase og er derfor repræsentative for misrepaired DNA, kromosom omlejring eller telomer ende fusion.

Celler med samtidig udtryk for NPB og MN. Ekspressionen af ​​NPB + MN i opdelte celler skyldes break-fusion-break cyklusser og repræsenterer en meget kompleks omlejring.

Alle kriterier scoring blev anvendt i overensstemmelse med de morfologiske parametre beskrevet af Fenech [33].

Statistisk Analyse

de data fra mindst tre uafhængige forsøg er præsenteret som gennemsnit og standardafvigelse. Dataene blev analyseret ved anvendelse af Students

t

test.

P

. 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen tilstand blev betragtet som signifikant

Resultater

Effekter af DMF /BSO Kombineret med Bestråling på Endogen GSH Niveauer af SQ20B Celler

i det første sæt eksperimenter (tabel 1A), har vi kvantificeret det samlede GSH-indhold i SQ20B celler behandlet under forskellige betingelser. Ved anvendelse i kombination, DMF og BSO behandling resulterede i total GSH udtømning efter 4 timers inkubering med en langsom restaurering af GSH-niveau ved 24 timer. En 4 h DMF /BSO forbehandling kombineret med røntgen eller carbon ion eksponering aktiveret stabilisering af GSH udtømning og inhiberingen af ​​glutathion resyntesen induceret efter bestråling (Tabel 1B). Der blev ikke påvist signifikante variationer af oxideret glutathion under vore eksperimentelle betingelser (data ikke vist). Denne protokol blev derfor anset som optimal for effektivt og forbigående nedbryder SQ20B GSH butikker.

Klonogen Cell Survival

Resultaterne for klonogen celle overlevelse i Radiosensitivitet SCC61 og radioresistente SQ20B cellelinjer efter røntgen eller carbon ion bestråling er vist i fig. 1. Eksponeringen for carbonioner resulterede i en lavere overlevende fraktion sammenlignet med røntgenstråler i begge cellelinier. Overlevelsen fraktionen ved 2 Gy (SF2) var 0,81 (røntgen) og 0,33 (kulstof-ioner) for SQ20B celler og 0,34 (røntgen) og 0,12 (kulstof-ioner) for SCC61 celler. SQ20B-celler blev systematisk mere resistente end SCC61 celler, selv som reaktion på carbonioner. Den relative biologiske effektivitet på overlevelse niveau 10% var 2,1 for SQ20B celler og 1,9 for SCC61 celler. I nærværelse af DMF /BSO, radiosensibilisering af resistente SQ20B-celler forekom, og den resulterende SF2 (0,28 for røntgenstråler og 0,19 for carbonioner) viste sig at være den samme som målt i den ubehandlede sensitive SCC61 cellelinie. En sådan radiosensibilisering blev vendt i nærværelse af 5 uM NAC, et meget kraftfuld antioxidant middel, som det fremgår af SF2 værdi (0,84) af behandlede SQ20B celler efter X-ray bestråling.

SQ20B, DMF /BSO ( TTT) -behandlede SQ20B, og SCC61 celler blev udsat for røntgenstråling (A) eller carbon ion stråling (B). Den modsatte effekt af NAC over glutathion udtynding behandling blev vurderet ved co-inkubering DMF /BSO (TTT) -behandlet SQ20B med 5 mM

N

-acetyl cystein (NAC) (SQ20B + TTT + NAC) før X- ray stråling.

DNA DSB Analyse af γH2AX Assay

Vi først evalueret effektiviteten af ​​DSB-reparation i henhold til kinetikken af ​​γH2AX foci. Som vist i fig. 2

A

, den indledende top af γH2AX foci per celle efter røntgenbestråling var den samme i både radioresistente SQ20B (31,3 ± 1,0) cellelinie, som viser det højeste niveau af endogen GSH og radiosensitive SCC61 (30,8 ± 2,4) cellelinie, hvilket antyder, at GSH-indhold ikke påvirke udbyttet af DSB efter røntgenbestråling. Imidlertid kinetikken for reparation afveg: reparation var langsommere i de følsomme SCC61 celler og resulterede i en ophobning af resterende DSB (8 foci /kerne) 24 timer efter bestråling. Efter kulstof ion eksponering (fig. 2

B

), det maksimale antal γH2AX foci per celle var lavere end efter X-ray bestråling (19 ± 0,7 og 22,2 ± 0,3 for SQ20B og SCC61 cellelinjer, henholdsvis) . I modsætning til røntgenbestråling respons, reparation kinetik var ens mellem de to cellelinier. Endelig er antallet af resterende γH2AX foci målt i følsomme celler 24 timer efter carbon ion eksponering var ækvivalent med den observeret efter den biologiske isodosiskonturer af røntgenstråler (7,7 ± 0,6 foci /nucleus), hvorimod ingen rest DSB blev målt i resistente celler efter begge typer af bestråling.

Cellerne blev bestrålet med 2 Gy af røntgenstråler (A, C) eller en Gy af kulstof-ioner (B, D). ▴ SQ20B celler, ▵ SQ20B + bestråling, • SQ20B + GSH udtømning, • SQ20B + GSH udtømning + bestråling, □ SCC61 + bestråling. I paneler C og D, den omvendte effekt af

N

acetyl cystein i nærvær af DMF /BSO behandling blev analyseret. Et hundrede celler blev bedømt for hver gang og målingerne blev foretaget i tre eksemplarer og gentaget tre gange. *

P

. 0,05

Depleting det intracellulære GSH-niveau i SQ20B celler ved DMF /BSO behandling forårsagede ikke nogen betydelig variation i den spontane DSB beløb i forhold til kontrol-celler ( 0 og 5 foci) i den tid kurset studeres, mens kombinationen med røntgen eller carbon ion bestråling væsentligt påvirket den cellulære respons. Antallet af γH2AX foci steget markant (

P

0,05) 30 min efter X-ray bestråling (42,3 ± 2,3 foci versus 31,3 ± 1,0 i bestrålede SQ20B celler) og reparation kinetik blev derefter langsommere end dem, der observeres i bestrålede, men ubehandlede SQ20B-celler. Stigningen i antallet af oprindelige DNA-læsioner førte til residual DSB (9,7 ± 1,5 foci) på 24 timer, et niveau svarende til det målte i følsomme SCC61 celler. Interessant, efter carbon ion eksponering, respons GSH-depleterede SQ20B-celler matchede perfekt den for bestrålede SCC61 celler i form af den oprindelige DNA-skader, reparation kinetik, og resterende DSB. Disse resultater indikerer, at nedbrydningen af ​​endogene GSH pool i resistente celler kombineret med røntgen eller carbon ion eksponering ved en biologisk tilsvarende dosis førte til vedvarende DNA-læsioner på et niveau svarende til den i de følsomme SCC61 celler.

for at bekræfte rollen som redox ændringer på DNA-skader, vi inkuberes SQ20B celler med Nac. Under disse eksperimentelle betingelser, har NAC fremprovokere γH2AX foci i kontrolforsøg (fig. 2 C og D). I nærværelse af DMF /BSO behandling og NAC tilsat 4 timer inden bestråling, udviste de γH2AX målinger, at niveauet for DSB og kinetik for reparation match med bestrålede, men ubehandlede, SQ20B-celler, for begge typer af bestråling. NAC kan således vende effekten af ​​GSH udtynding.

Single Strand Breaks og oxidativ DNA-læsioner målt ved SCGE Assay

Niveauet af alkali-labile steder og SSB i DNA blev undersøgt ved hjælp af SCGE assay. Som vist i fig. 3

En

, følsom SCC61 og resistente SQ20B cellelinier tydeligt viste tydelige svar i form af radioinduced SSB. Intet signal blev opnået fra SQ20B-celler under undersøgt med enten type bestrålingstiden. Derimod SCC61 celler responderer kraftigt og viste et højt niveau af pauser på de korteste tidspunkter efter bestråling. Rapid reparation forekom efter X-ray eksponering, hvilket fremgår af det faldende antal bryder med tiden. Selvom carbon ion bestråling inducerede en lignende initial procentdel af hale-DNA sammenlignet med røntgenbestråling, reparation kinetik i SCC61 celler var betydeligt langsommere og viste en vedvarende stigning op til 2 timer efterfulgt af et fald i længere tid. Interessant, viste GSH-forarmet SQ20B celler et lignende mønster, der observeres for SCC61 celler og satsen svarede efter udsættelse for begge typer af stråling. Dette tyder på, at høje endogene GSH-niveauer beskytter DNA mod stråling i SQ20B celler. I et andet sæt eksperimenter blev procentdelen af ​​halen DNA identificeret under anvendelse SCGE alene subtraheres fra den, der opnås efter behandling med Fpg enzym for at studere den rumlige fordeling af oxiderede baser. Resultaterne er vist i fig. 3

B

viser, at i SQ20B celler, har X-ray eller carbon ion bestråling ikke ændre oxidation af DNA-baser i forhold til kontroller. Imidlertid GSH-depleterede SQ20B celler udviste mere spredt oxidativ skade på den korteste tid efter røntgenbestråling, mens en mindre variabel mønster af skader efter udsættelse for carbonioner foreslog den lokale produktion af frie radikaler.

gennemsnitlige procentvise af DNA-skader i SCC61, SQ20B, og DMF /BSO (TTT) -behandlede SQ20B cellelinier efter 10 Gy af X-ray eller 5 Gy af kulstof ion eksponering. Comet assays blev udført under alkaliske betingelser uden (A) eller i nærvær af Fpg enzym (B). ▵ SQ20B celler, ▴SQ20B + bestråling, • SQ20B + GSH udtynding, ○ SQ20B + GSH udtynding + bestråling ▪ SCC61, □ SCC61 + bestråling. *

P

. 0,05

Radioinduced G2 /M Phase Anholdelse og Ophobning af Celler i Sub-G1 fase efter Cell Cycle Analysis

For at bestemme til hvilket omfang GSH udtømning og den resterende DSB kunne påvirke den cellulære respons på røntgen eller carbon ion bestråling gennem cellecyklus omfordeling, det relative antal af SCC61, SQ20B, og GSH-udtømte SQ20B celler i sub-G1 (fig. 4

A

) og G2 /M (fig. 4

B

) faser blev analyseret ved flowcytometri. De sensitive SCC61 celler hurtigt undergik apoptose (ca. 32% af sub-G1 celler ved 48 h, stigende til 68% ved 120 h). Derimod blev der ikke signifikant niveau af apoptose målt i SQ20B celler efter begge typer af bestråling. I stedet blev op til 55% af SQ20B-celler standset i G2 /M checkpoint efter 24 timer efter begge typer bestråling, og disse celler reentered cellecyklussen efter 48 timer. GSH udtømning af SQ20B-celler forøgede G2 /M fasen, hvorefter cellerne blev frigivet og vendte tilbage til det basale niveau kun 72 timer efter bestråling. Den tilbagefald af G2 /M anholdelse korreleret med stigningen i procentdelen af ​​apoptotiske celler efter X-ray bestråling (55% ved maksimal). Denne stigning blev lidt forsinket (96 timer) efter kulstof eksponering, men nåede det samme niveau på 120 t. Disse data indikerer, at nedbrydningen af ​​den endogene pool af GSH påvirker andelen af ​​celler standset ved G2 /M checkpoint i kultur og varighed i forhold til stråling kvalitet.

SCC61, SQ20B, og DMF /BSO ( TTT) -behandlede SQ20B celler blev udsat for røntgenstråler eller kulstof ion stråling. (A) Procentdelen af ​​celler i sub-G1-fasen. (B) Procentdelen af ​​celler i G2 /M-fasen. ▴ SQ20B celler, ▵ SQ20B + 5 Gy kulstof ion stråling, ▵ SQ20B + 10 Gy røntgen, • SQ20B + GSH udtynding, ○ SQ20B + GSH udtømning + 5 Gy carbon ion stråling, ○ SQ20B + GSH-depletion + 10 Gy X stråler, ▪ SCC61, □ SCC61 + 5 Gy carbon ion stråling, □ SCC61 + 10 Gy røntgenstråler. *

P

. 0,05

mikrokerner Målinger Registrerede hjælp af Cytome Assay

Ikke-reparerede eller misrepaired DNA-skader kan føre til kromosomforandringer i overlevende kræftceller. Dannelsen af ​​MN, som indeholder et fragment af et kromosom /kromatid, kan være forbundet med ikke-udbedrede DSB, hvilket afspejler en defekt i reparation. Udbyttet af MN blev estimeret ved at beregne Ymn værdi. Som vist i fig. 5

En

, de Ymn værdier efter udsættelse for røntgen og kulstof ion bestråling er korreleret med cellens radiosensitivitet. Mere MN blev produceret i følsomme SCC61 sammenlignet med SQ20B celler efter begge typer af bestråling. Den maksimale udbytte i SCC61 celler var ikke signifikant forskellig mellem de to typer af bestråling (2,1 ± 0,3 efter røntgenbestråling og 1,68 ± 0,3 efter kulstof ion bestråling). Den maksimale værdi blev let forsinket efter carbon ion bestråling (96 h), en tid, der svarer til udløsning af apoptose, som beskrevet ovenfor. Derimod har udbyttet af MN induceret i resistente SQ20B celler ikke overstige 0,75 og var ens for begge typer af bestråling. Selvom radiosensibilisering af SQ20B celler gennem GSH udtømning førte til resterende DSB identiske med dem, der observeres i SCC61 celler efter bestråling, var det ikke fremkalde det samme mønster af MN. De Ymn målte værdier i GSH-udtømte SQ20B var lig med dem i undepleted SQ20B celler efter X-bestråling (undtaget ved 120 timer efter bestråling), men var lavere efter carbon ion eksponering for størstedelen af ​​de kinetiske tidspunkter. Endelig kun kulstof ion bestråling inducerede en oplagt fald i antallet af radioinduced MN i GSH-udtømte SQ20B celler.

Udbytte af mikrokerner (A) og centromerfusioner-positive mikrokerner (B) i SCC61, SQ20B, og DMF /BSO (TTT) -behandlede SQ20B cellelinier efter 10 Gy af X-ray eller 5 Gy af kulstof ion bestråling. *

P

. 0,05

I et andet sæt eksperimenter blev kromosom /kromatid tab (identificeret som centromeren-positive MN, c + MN) estimeret (Fig. 5

B

). Procentdelen af ​​celler med c + MN var lav efter X-ray bestråling og var ikke forskellig mellem følsomme og resistente celler (maksimalt -4% til 5%). Som vist i fig.