PLoS ONE: PIPKIγ Regulerer Focal Vedhæftning Dynamics og Colon Cancer Cell Invasion

abstrakt

Focal vedhæftning samling og adskillelse er afgørende for cellemigrering og cancer invasion, men de detaljerede molekylære mekanismer, der regulerer disse processer stadig ikke belyst. Phosphatidylinositol phosphat-kinase typen Iγ (PIPKIγ) binder talin og er nødvendig til fokal adhæsionsdannelse i EGF-stimulerede celler, men dens rolle i reguleringen af ​​fokale vedhæftning dynamik og cancer invasion er dårligt forstået. Vi viser her, at overekspression af PIPKIγ forfremmet omdrejningspunkt vedhæftning dannelse, mens celler, der udtrykker enten PIPKIγ

K188,200R eller PIPKIγ

D316K, to kinase-døde mutanter, havde meget færre fokale sammenvoksninger end dem udtrykke WT PIPKIγ i CHO-K1 celler og HCT116 colon cancerceller. Desuden overekspression af PIPKIγ, men ikke PIPKIγ

K188,200R, resulterede i en stigning i både fokale vedhæftning samling og adskillelse satser. Udtømning af PIPKIγ ved hjælp shRNA stærkt inhiberede dannelsen af ​​fokale adhæsioner i HCT116-celler. Overekspression af PIPKIγ

K188,200R eller udtømning af PIPKIγ reducerede styrken af ​​HCT116 celleadhæsion at fibronection og hæmmede de invasive kapacitet HCT116 celler. PIPKIγ udtømning reducerede PIP

2 niveauer til ~ 40% af kontrol og PIP

3 til ikke målbart, og hæmmede vinculin lokalisere til grupper sammenvoksninger. Tilsammen PIPKIγ positivt regulerer fokale vedhæftning dynamik og kræft invasion, sandsynligvis gennem PIP

2-medieret vinculin aktivering

Henvisning:. Wu Z, Li X, Sunkara M, Spearman H, Morris AJ, Huang K (2011) PIPKIγ Regulerer Focal Vedhæftning Dynamics og Colon Cancer Cell invasion. PLoS ONE 6 (9): e24775. doi: 10,1371 /journal.pone.0024775

Redaktør: Maddy Parsons, Kings College London, England

Modtaget: 11. juli, 2011; Accepteret: August 17, 2011; Udgivet 12. september, 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af Markey Cancer center Start-up fond (University of Kentucky) (til Cai Huang) og delvist af Migration Consortium tilskud (NIH GM64346) (til Ken Jacobson, University of North Carolina-Chapel Hill). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

focal sammenvoksninger (FA’er, også kaldet celle-matrix sammenvoksninger) er specifikke typer af store makromolekylære forsamlinger på den ventrale overfladen af ​​celler, der fungerer som både mekaniske machineries og lovgivningsmæssige signalering hubs [1], [2]. Tidsmæssige og rumlige regulering af fokal vedhæftning montering /demontering er nødvendig for celle migration [3]. Under cellemigrering, er vordende fokale adhæsioner (også kaldet fokale komplekser) udformet til at stabilisere lamellipodia på forsiden af ​​celler, mens fokale adhæsioner opløses ved den bageste kanter af celler [4], [5].

Focal vedhæftning samling og adskillelse er også impliceret i cancer invasion, en forudsætning for metastase. DRR (nedreguleret i Renalcellecarcinom) forbinder med actin og mikrotubuli og stimulerer gliom invasion ved at fremme fokal vedhæftning demontering [6]. Den actin tværbinding protein filamin A undertrykker fokal adhæsion demontering og brystkræft celleinvasion [7]. Rho /Rock signalering fremmer tumorcellemigration og invasion ved at regulere fokale vedhæftning dynamik gennem caveolin-1 phosphorylering [8]. FAK fremmer også omdrejningspunkt vedhæftning demontering og kræft invasion [9], [10], [11]. Focal vedhæftning dynamik og signalveje, der regulerer denne proces kunne derfor et attraktivt mål for kræftbehandling.

Mange molekyler har vist sig at regulere fokale vedhæftning dynamik. FAK regulerer fokal adhæsion omsætning [9], [12], muligvis gennem et dynamin og mikrotubulus-afhængige vej [13]. Paxillin, et knudepunkt vedhæftning adapter, modulerer også fokale vedhæftning dynamik af JNK og PAK-medieret phosphorylering [14], [15]. Tallinn aktiverer integriner og igangsætter omdrejningspunkt vedhæftning dannelse [16], [17], [18], hvorimod spaltning af Tallinn med calpain medierer omdrejningspunkt vedhæftning demontering [19]. Calpain også spalter FAK og paxillin at modulere fokale vedhæftning dynamik [20], [21]. Vi har vist, at Smurf1-medieret ubiquitinering af talin hoved domæne, en af ​​de to spaltningsprodukter, spiller en vigtig rolle i fokal adhæsion afmontering og cellevandring [22]. ACF7, en mikrotubulus og filamentøst actin-bindende protein, regulerer fokal adhæsion montering /demontering gennem sin ATPase-aktivitet [23]. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der styrer fokal adhæsion montering /demontering ikke fuldt klarlagt.

Phosphatidylinositol phosphat-kinase type I y (PIPKIγ) er et enzym, der katalyserer ATP-afhængig phosphorylering af phosphatidylinositol 4-phosphat (PI (4 ) P) for at danne PI (4,5) P

2, der regulerer en række biologiske processer, herunder fokal adhæsionsdannelse [24]. PIPKIγ har en velbevaret kinase katalytiske domæne på den centrale region [25]. Indenfor det katalytiske domæne, der er et underdomæne kaldet aktiveringssløjfen, som bestemmer stedet for phosphorylering på inositolringen af ​​substratet. PIPKIγ stærkt interagerer med Tallinn og konkurrerer om Tallinn binding med β integrin hale [26], [27]. Det er lokaliseret på adherensovergange i epitelceller [28], [29]. Det er blevet rapporteret, at PIPKIγ er påkrævet for fokal adhæsionsdannelse i migrerende celler [30]. Imidlertid er de præcise roller lipid kinase aktiviteterne i PIPKIγ i fokale vedhæftning dynamik ikke defineret.

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi kravet om lipidet kinaseaktiviteten af ​​PIPKIγ i fokale vedhæftning dynamik og coloncancer invasion . Vores resultater identificere en væsentlig rolle PIPKIγ i fokal vedhæftning montering /afmontering og kræft invasion.

Resultater

PIPKIγ fremmer omdrejningspunkt vedhæftning dannelse

For at undersøge en mulig rolle for PIPKIγ i fokal adhæsionsdannelse blev CHO-K1 celler transficeret med EGFP-PIPKIγ eller EGFP-vektor hhv. Cellerne blev genudpladet på fibronectin, fikseret med paraformaldehyd, inkuberet med et anti-paxillin monoklonalt antistof, og derefter farvet med Dylight 549 konjugeret ged anti-mus IgG. Fokale adhæsioner blev stillet op omkring kanterne af EGFP vektor-transficerede celler, med få fokale adhæsioner i centrene af celler, hvorimod PIPKIγ ekspression dramatisk stimuleret fokal adhæsionsdannelse i centrene af cellerne (Fig. 1A). Over-ekspressionen af ​​PIPKIγ stimulerer en stigning i fokale vedhæftning numre (Fig 1B.), Og stigningen var primært bidraget med små fokale sammenvoksninger ( 3 um

2) (. Figur 1C). Stimuleringen af ​​fokal adhæsion dannelse ved PIPKIγ afhængig af sin interaktion med talin, fordi PIPKIγ

W647F, en mutant, der er mangelfuld i interaktionen med Tallinn, ikke var i stand til at fremme fokal adhæsionsdannelse (Fig 1A, B, C).

(A) TIRF billeder af CHO-K1 celler, der udtrykker EGFP, EGFP-PIPKIγ WT eller EGFP-PIPKIγ

W647F. Cellerne blev kortvarigt transficeret med pEGFP-vektor, -PIPKIγ WT eller -PIPKIγ

W647F, og derefter farvet for paxillin. Scale bar, 20 pm. (B) Ekspression af PIPKIγ men ikke PIPKIγ

W647F forårsagede en stigning i fokal vedhæftning nummer (n = 15, fejl bar = gennemsnit ± SEM, Vector

vs

WT, P 0,001; WT

vs

W647F, P 0,001; Vector

vs

W647F, P 0,05). (C) Område fordeling af fokale sammenvoksninger i celler, der udtrykker EGFP, EGFP-PIPKIγ WT eller EGFP-PIPKIγ

W647F.

PIPKIγ kinase aktivitet er nødvendig for stimulering af fokal vedhæftning dannelse

PI (4,5) P

2 binder talin og styrker interaktionen mellem Tallinn og β integrin hale, stimulerende integrin klyngedannelse [31]. PI (4,5) P binder

2 også vinculin og afslører de actin og Tallinn bindingssteder på vinculin, fremme omdrejningspunkt vedhæftning dannelse [32]. Derfor PIPKIγ-stimuleret PI (4,5) P

2 syntese kan være afgørende for at fremme fokal adhæsionsdannelse. For at teste denne hypotese, muterede vi to lysinrester, K188 og K200, til arginin rester i ATP-bindingsstedet af PIPKIγ. Mutanten PIPKIγ

K188,200R og WT blev oprenset fra CHO-K1-celler og kinaseaktiviteter blev undersøgt

in vitro

ved anvendelse af massespektrometri til kvantificering produktion af PI (4,5) P

2 fra PI (4) P. Som vist i fig. 2A, mutation i K188 og K200 reduceret kinaseaktivitet med 95%. EGFP-mærket mutant PIPKIγ

K188,200R og WT PIPKIγ blev stabilt udtrykt i CHO-K1-celler, og deres virkninger på fokal vedhæftning dannelse blev undersøgt efter paxillin farvning. Celler, der stabilt udtrykker WT PIPKIγ dannede fokale sammenvoksninger rundt om kanterne og i centrene celler, mens celler, som udtrykker PIPKIγ

K188,200R, svarende til forældrenes celler besad små fokale sammenvoksninger, hvoraf de fleste var omkring kanterne af den celler, og havde en defekt i spredning (fig. 2B). Kvantitativ analyse viste, at PIPKIγ øget fokale adhæsioner med mere end 2 gange, hvorimod PIPKIγ

K188,200R ikke signifikant fremme fokal adhæsionsdannelse (Fig 2C . D). Disse resultater indikerer, at PIPKIγ aktivitet er afgørende for fokal vedhæftning dannelse i CHO-K1-celler.

(A) Analyse af aktiviteterne i PIPKIγ og PIPKIγ

K188,200R. (B) TIRF billeder af CHO-K1-celler, som udtrykker PIPKIγ eller PIPKIγ

K188,200R og de parentale CHO-K1 celler. De stamcellerne og celler, der udtrykker EGFP-PIPKIγ WT eller -PIPKIγ

K188, 200R blev farvet for paxillin. Scale bar, 20 pm. (C) Kvantitativ analyse af fokale vedhæftning numre (per celle) i forældrenes celler og celler, der udtrykker PIPKIγ eller PIPKIγ

K188,200R (n = 30, fejl bar = gennemsnit ± SEM, forældrenes vs PIPKIγ, P 0,001; forældrenes vs PIPKIγ

K188,200R, P 0,05). (D) Område fordeling af fokale sammenvoksninger i forældrenes celler og celler, der udtrykker PIPKIγ og PIPKIγ

K188,200R.

For yderligere kontrol af det under PIPKIγ aktivitet for fokal vedhæftning dannelse, testede vi kapacitet på en anden kinase død mutant, at PIPKIγ

D316K [33], fremme fokal adhæsionsdannelse som beskrevet ovenfor. Som vist i fig. S1, den gennemsnitlige fokal adhæsion nummer (per celle) i celler, der udtrykker PIPKIγ

D316K var ca. 45, som er omtrent den samme som i celler, der udtrykker EGFP-vektor (fig. 1). De fokale adhæsioner i celler, der udtrykker PIPKIγ

D316K akkumuleret ved kanterne af cellerne, med meget få fokale adhæsioner i centrum af cellerne. Dette resultat bekræfter den væsentlige rolle PIPKIγ aktivitet i fokal vedhæftning formation.

aktivitet PIPKIγ er afgørende for dens fremme fokale vedhæftning dynamik

For at undersøge, om PIPKIγ lipid-aktivitet er nødvendig for fokal vedhæftning dynamik, CHO-K1-celler, der stabilt udtrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ

K188,200R blev transficeret med mDsRed-paxillin og derefter udpladet på Mattek retter (med et dækglas i bunden) belagt med fibronectin (5 pg /ml ) og dyrket i 3 timer. TIRF billeder af mDsRed-paxillin blev taget under anvendelse af et Nikon TIRF mikroskop, og temperaturen blev holdt på 37 ° C ved anvendelse af INU-TIZ-F1 mikroskop inkubationssystem (Tokai Hit). Billeder blev optaget ved 1-minutters intervaller for en 120 min periode. Focal vedhæftning montage og demontering hastighedskonstanter blev beregnet som tidligere [22] beskrevet. FA samling og adskillelse hastighedskonstanter i celler, der udtrykker PIPKIγ

K188,200R var 0,083 ± 0,014 og 0,072 ± 0,010 min

-1 henholdsvis som svarer til dem i normale CHO-K1-celler, som vi rapporteret tidligere [ ,,,0],22], mens FA samling og adskillelse hastighedskonstanter var 0.190 ± 0,019 og 0,136 ± 0,014 min

-1 henholdsvis i celler, der udtrykker WT PIPKIγ (fig. 3). Dette resultat indikerer, at inositol lipid kinaseaktiviteten af ​​PIPKIγ er påkrævet for dets stimulering af fokal adhæsion samling og adskillelse.

(A) CHO-K1-celler, der stabilt udtrykker PIPKIγ eller PIPKIγ

K188,200R blev transient transficeret med mDsRed-paxillin. Cellerne blev udsået på fibronektin og dynamikken i paxillin blev analyseret ved hjælp af time-lapse TIRF mikroskopi. Pilehoveder peger på dynamisk (øverste paneler) og stabile (lavere paneler) fokale sammenvoksninger. (B) Den overlejring af 0 og 24 min i “A”. (C) Kvantificering af de centrale vedhæftning montage og demontering hastighedskonstanter i celler, der udtrykker PIPKIγ eller PIPKIγ

K188,200R. Kvantificeringer er udtrykt som middelværdi ± S.E.M. 50 fokale sammenvoksninger fra 10 celler. Montering, WT vs K188,200R, P 0,00005; demontering, p. 0,005

En væsentlig rolle for PIPKIγ i fokal vedhæftning dannelse i colon kræftceller

Focal sammenvoksninger har været impliceret i reguleringen af ​​kræft invasion, mens rollen som fokale sammenvoksninger i colon cancerceller er ikke veldefineret. For at bestemme om aktiviteten af ​​PIPKIγ påvirker fokal adhæsionsdannelse i colon cancerceller, HCT116 celler, der stabilt udtrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ

K188,200R blev udpladet på fibronectin og farvet for paxillin. Som vist i fig. 4A, de fleste af de fokale adhæsioner var placeret til den perifere region, og HCT116 celler, der udtrykker PIPKIγ

K188,200R havde langt færre fokale adhæsioner end dem der udtrykker WT-enzymet. Det gennemsnitlige omdrejningspunkt vedhæftning nummer i celler, der udtrykker WT PIPKIγ var 22,5 /celle, mens der i celler, der udtrykker PIPKIγ

K188,200R var 11,5 /celle, som begge var færre end dem, der observeres i CHO-K1-celler (fig. 4B) . Desuden PIPKIγ

K188,200R havde mere effekt på de mindre fokale sammenvoksninger end de store (fig. 4C).

(A) TIRF billeder af CHO-K1 celler, der udtrykker PIPKIγ eller PIPKIγ

K188,200R. Celler, der stabilt udtrykker EGFP-PIPKIγ WT eller -PIPKIγ

K188, 200R blev farvet for paxillin. Scale bar, 20 pm. (B) PIPKIγ

K188, 200R undladt at stimulere en stigning i fokal vedhæftning nummer (n = 10, fejl bar = middelværdi ± sem, parret t-test, P 0,005). (C) Område distribution af fokale sammenvoksninger i celler, der udtrykker PIPKIγ og PIPKIγ

K188,200R.

For at teste, om PIPKIγ er afgørende for fokal vedhæftning dannelse i HCT116 celler blev HCT116 celler inficeret med rekombinant lentivira der udtrykker PIPKIγ shRNA eller shRNA kontrol og blev udvalgt med puromycin. Som vist i fig. 5A, ekspression af PIPKIγ shRNA resulterede i en dramatisk reduktion i det endogene PIPKIγ niveau af HCT116 celler. Cellerne blev derefter udpladet på fibronectin og farvet for paxillin. Overraskende PIPKIγ knockdown næsten afskaffet fokal adhæsionsdannelse i HCT116-celler (fig. 5B). PIPKIγ udtømning reducerede omdrejningspunkt vedhæftning nummer med omkring 74% (fig. 5C). Forskellig fra PIPKIγ

K188,200R, PIPKIγ shRNA havde mere effekt på de større fokale sammenvoksninger end de mindre (Fig. 5D). Disse resultater indikerer en væsentlig rolle PIPKIγ i fokal adhæsionsdannelse i HCT116 colon cancerceller. Denne dramatiske effekt af PIPKIγ knockdown forekom ikke i MDA-MB-231 humane brystcancerceller, hvor PIPKIγ knockdown kun delvist inhiberede fokal adhæsionsdannelse (data ikke vist).

(A) Ekspression af PIPKIγ i celler, der stabilt udtrykker shRNA kontrol og PIPKIγ shRNA. (B) TIRF billeder af HCT116 celler, der stabilt udtrykker kontrol og PIPKIγ shRNA. Celler blev inficeret med lentivirale partikler, der bærer kontrol eller PIPKIγ shRNA, valgt med puromycin, og farvet for paxillin. Scale bar, 20 pm. (C) PIPKIγ udtømning hæmmede omdrejningspunkt vedhæftning dannelse i HCT116 celler. (N = 10, fejl bar = middelværdi ± sem, parret t-test, P 0,0001). (D) Område fordeling af fokale sammenvoksninger i celler, der udtrykker kontrol og PIPKIγ shRNA

PIPKIγ positivt modulerer vedhæftning styrken af ​​tyktarmskræft celler til fibronectin

for at undersøge, om aktiviteten af ​​PIPKIγ regulerer celleadhæsion styrke på fibronectin, HCT116 celler, der stabilt udtrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ

K188,200R blev farvet med calcein-AM og podet på en plade med 96 brønde, der blev præ-overtrukket med forskellige koncentrationer af fibronectin. Den calcein fluorescens blev aflæst, og derefter pladen blev vendt og centrifugeret ved 150 x g i 5 min. Den calcein fluorescens blev aflæst igen. Som vist i fig. 6A, celleadhæsions styrke forskel mellem de celler, der udtrykker PIPKIγ

K188,200R og WT var ikke signifikant ved høje koncentrationer af fibronection. Men ved lave koncentrationer af fibronectin, de celler, der udtrykker PIPKIγ

K188,200R havde signifikant lavere adhæsionsstyrke sammenlignet med dem der udtrykker WT. PIPKIγ knockdown forårsagede også et signifikant fald i celleadhæsion styrke i HCT116-celler (fig. 6B). Disse resultater viser, at PIPKIγ aktivitet regulerer celleadhæsion styrke i colon cancerceller.

(A) Ekspression af PIPKIγ

K188,200R inhiberede HCT116 celler adhærerer til lave koncentrationer af fibronectin. Cellerne stabilt udtrykker PIPKIγ eller PIPKIγ

K188,200R blev inkuberet med Calcein-AM og udpladet på en plade med 96 brønde overtrukket med fibronectin til centrifugeringstrin assays. (B) Udtømning af PIPKIγ hæmmede HCT116 celler klæber til fibronektin. De celler, der stabilt udtrykker kontrol og PIPKIγ shRNA blev inkuberet med Calcein-AM og udpladet på en plade med 96 brønde overtrukket med fibronectin til centrifugeringstrin assays. F

a /F

0 = (fluorescens efter centrifugering) ÷ (fluorescens før centrifugering).

PIPKIγ er afgørende for invasionen, men ikke migrationen af ​​tyktarmskræft celler

Det er blevet rapporteret, at PIPKIγ spiller en rolle i celle migration. For at teste, om PIPKIγ regulerer migreringen af ​​HCT116 colon cancerceller, anvendte vi tidsforkortet sårhelende assays til at undersøge migration af HCT116 celler, der udtrykker EGFP-PIPKIγ og -PIPKIγ

K188,200R henholdsvis i nærvær af HGF . Som vist i fig. S2 A B, celler, der udtrykker PIPKIγ

K188,200R migrerede lidt hurtigere end dem, der udtrykker WT-enzymet som målt ved time-lapse sårhelende analyser. Også, udtømning af PIPKIγ havde ingen signifikant virkning på migration af HCT116 celler i transwell analyser (Fig S2 C . D). Disse resultater antyder, PIPKIγ aktivitet er ikke afgørende for migrationen af ​​HCT116 colon cancerceller.

For at teste rolle PIPKIγ i cancer invasion, invasionen af ​​HCT116 celler, der stabilt udtrykker PIPKIγ shRNA eller en shRNA kontrol i fravær og nærvær af HGF blev undersøgt ved hjælp af Matrigel invasion assays. Som vist i fig. 7 (A B), PIPKIγ knockdown resulterede i signifikant reduktion i invasionen af ​​HCT116 celler enten i fravær eller i nærvær af HGF. Den basale og HGF-stimulerede invasive kapacitet HCT116 celler, der stabilt udtrykker PIPKIγ

K188,200R er også betydeligt lavere end for de celler, der udtrykker WT enzym (Fig 7C . D). Disse resultater indikerer, at PIPKIγ positivt regulerer invasionen af ​​HCT116 colon cancerceller.

(A) Udtømning af PIPKIγ ved hjælp shRNA inhiberede invasion af HCT116 celler. De invasive kapacitet celler stabilt udtrykker shRNA kontrol eller PIPKIγ shRNA blev undersøgt i fravær og tilstedeværelse af HGF (50 ng /ml) af Matrigel-baserede invasion assays. (B) Kvantificering af invasionen af ​​HCT116 celler, der stabilt udtrykker shRNA kontrol eller PIPKIγ shRNA. n = 5, fejl bar = gennemsnit ± sem; ctrl vs PIPKIγ, s 0,01; ctrl HGF vs PIPKIγ HGF, s 0,01. (C) Ekspression af PIPKIγ

K188,200R inhiberede invasion af HCT116 celler. De celler, der stabilt udtrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ

K188,200R blev testet for invasive kapacitet i fravær og tilstedeværelse af HGF. (D) Kvantificering af invasionen af ​​HCT116 celler, der stabilt udtrykker EGFP-PIPKIγ eller -PIPKIγ

K188,200R. n = 3, fejl bar = gennemsnit ± sem; WT vs K188,200R, P 0,01; WT HGF vs K188,200R HGF, P. 0,005

PIPKIγ regulerer omdrejningspunkt vedhæftning dannelse gennem aktivering vinculin af PI (4,5) P

2

For at dissekere den mekanisme, hvormed PIPKIγ regulerer omdrejningspunkt vedhæftning dannelse, vi satte os for at analysere niveauet af polyphosphoinositides i HCT116 celler, der udtrykker PIPKIγ shRNA eller en shRNA kontrol ved hjælp af massespektrometri. Udtømning af PIPKIγ i HCT116 celler havde ingen signifikant virkning på størrelsen af ​​PIP, men forårsagede signifikant reduktion i PIP

2-niveau (bemærk, at disse metoder ikke kan skelne positionelle enantiomerer af disse lipider, så det er muligt, at PI (3,4) P

2 kan bidrage væsentligt til resterende niveauer af PIP

2 i disse celler). Interessant, til støtte for denne idé knockdown af PIPKIγ reducerede PIP

3 niveauer under detektionsgrænsen i vores analyse (fig. 8). Disse resultater indikerer, at PIPKIγ er et vigtigt enzym ansvarlig for produktionen af ​​PI (4,5) P

2 og PI (3,4,5) P

3 i HCT116-celler.

Polyphosphoinositides fra celler, der stabilt udtrykker shRNA kontrol eller PIPKIγ shRNA blev ekstraheret og derivatiseret ved anvendelse af trimethylsilyldiazomethan, og derefter blev målt under anvendelse af massespektrometri. N = 4, fejl bar = gennemsnit ± sem; PIP, P 0,05; PIP2, P = 0,0034; PIP3, P = 0,001.

For at se, om PI (3,4,5) P er afgørende for fokal vedhæftning dannelse i colon cancerceller

3 blev HCT116 celler behandlet med LY294002, en specifik inhibitor af phosphatidylinositol 3-kinase, og fokal adhæsionsdannelse i disse celler blev undersøgt efter paxillin farvning. LY294002 (20 uM) havde ingen signifikant effekt på fokal adhæsionsdannelse (data ikke vist). Taget sammen med de ovennævnte observationer, dette fund indikerer, at PI (4,5) P

2, men ikke PI (3,4,5) P

3, er påkrævet for fokal adhæsionsdannelse.

PI (4,5) P

2 binder og aktiverer vinculin og er impliceret i reguleringen af ​​fokal adhæsionsdannelse [32]. Hvis PIPKIγ-medieret produktion af PI (4,5) P

2 er væsentlig for fokal adhæsionsdannelse i HCT116-celler, ville udtømning af PIPKIγ reducere PI (4,5) P

2 plan og forhindre vinculin fra lokalisering til fokale sammenvoksninger. For at teste denne hypotese blev endogene PIPKIγ-udtømte celler inficeret med retrovira, der udtrykker en codon-modificeret PIPKIγ (rescue) (fig. 9A), og cellerne blev farvet for vinculin. Vinculin blev sjældent lokaliseret til fokale sammenvoksninger i PIPKIγ-udtømte HCT116 celler, mens re-ekspressionen af ​​PIPKIγ i PIPKIγ-udtømte celler resulterede i en dramatisk stigning i fokal vedhæftning-lokaliserede vinculin (fig. 9B). Kvantitativ analyse viste, at PIPKIγ redning gendannet fokal adhæsionsdannelse i PIPKIγ-udtømte celler (Fig 9C . D), sammenlignet med dataene i fig. 5. Disse data antyder, at PIPKIγ kan regulere fokal adhæsionsdannelse gennem PI (4,5) P

2-medieret vinculin aktivering.

(A) Ad-ekspression af rednings ZZ-mærket PIPKIγ i celler, PIPKIγ er blevet slået ned (KD) ved stabilt udtrykker PIPKIγ shRNA. De PIPKIγ-KD-celler blev inficeret med retrovirale partikler, der bærer redning ZZ-mærket PIPKIγ udvalgt med neomycin. ZZ-PIPKI blev detekteret ved Western blotting med et anti-PIPKIγ polyklonalt antistof. (B) TIRF billeder af PIPKIγ-KD-celler og KD celler, der udtrykker rednings PIPKIγ Celler blev udpladet på glas-bund skåle præ-coatet med fibronectin (5 pg /ml), fikseret og farvet for vinculin. Scale bar, 20 pm. (C) PIPKIγ redning restaureret omdrejningspunkt vedhæftning dannelse i PIPKIγ-KD-celler. (N = 11, fejl bar = middelværdi ± sem, parret t-test, P 0,0001). (D) Område fordeling af fokale sammenvoksninger i PIPKIγ-KD celler og KD celler, der udtrykker redning PIPKIγ

Discussion

Udover at tjene som en forløber for andre sekundære budbringere, PI (4,5) P

2 selv binder mange cytoskeletale og fokal adhæsionsproteiner og menes at være en vigtig regulator af fokale vedhæftning dynamik [ ,,,0],34]. PI (4,5) P

2 binder vinculin at afsløre de Tallinn-bindende steder på vinculin [32]; det binder også Tallinn dermed stabiliserende Tallinn-integrin interaktioner [35]. PIPKIγ menes at være det enzym, der genererer PI (4,5) P

2 rumligt og tidsligt for fokal adhæsion dannelse under cellemigrering [27], [34]. På den anden side, PI (4,5) P

2 ikke er blevet påvist ved fokale adhæsioner og den rolle PIPKIγ i reguleringen fokale vedhæftning dynamik er kontroversiel [36]. PIPKIγ har vist sig at være nødvendig for fokal vedhæftning dannelse under EGF-stimuleret celle migration [30], mens det også er blevet rapporteret, at ekspressionen af ​​PIPKIγ forårsagede celleafrunding og fokal vedhæftning demontering [26].

Vi viser her, at ekspressionen af ​​PIPKIγ på et lavt niveau i CHO-K1 celler stimuleret omdrejningspunkt vedhæftning dannelse (fig. 1), hvorimod kinase-døde mutanter, PIPKIγ

K188,200R og PIPKIγ

D316K undladt at fremme fokal vedhæftning dannelse (fig . 2, fig. 4 og fig. S1). Desuden PIPKIγ knockdown næsten helt afskaffet omdrejningspunkt vedhæftning dannelse i HCT116 tyktarmskræft celler (Fig. 5). Hertil kommer, udtryk for PIPKIγ forfremmet omdrejningspunkt vedhæftning samling og også adskillelse satser, mens PIPKIγ

K188,200R ikke var i stand til at gøre det (fig. 3). Disse resultater identificerer en væsentlig rolle PIPKIγ i reguleringen fokale vedhæftning dynamik.

Selvom der mangler direkte bevis, PI (4,5) P

2 er blevet godt impliceret i reguleringen integrin aktivering. PI (4,5) P

2 binder Tallinn og blokerer dens selv-hæmning (hoved-hale interaktion) således fremme dens interaktion med β integrin hale [35]. Det stimulerer også integrin clustering [31]. Stigningen i både Tallinn-integrin interaktion og integrin klyngedannelse bør stimulere integrin aktivering. Vi fandt, at HCT116 celler, der udtrykker PIPKIγ

K188,200R har signifikant lavere adhæsionsstyrke sammenlignet med dem der udtrykker WT, og udtømningen af ​​PIPKIγ af shRNA også forårsaget et signifikant fald i celleadhæsion styrke i HCT116-celler (fig. 6), hvilket antyder, at PIPKIγ kan modulere integrin aktivering i colon cancerceller.

Det er blevet rapporteret, at PIPKIγ er påkrævet for EGF-stimuleret migrering af MDA-MB-231 humane brystcancerceller og HeLa humane ovariecancerceller [30] , [37]. Men vores resultater her viser, at hverken udtrykker PIPKIγ

K188,200R, en kinase-død mutant eller udtømning af PIPKIγ hæmme migration af HCT116 celler (fig. S2). De MDA-MB-231 og HeLa-celler migrerer meget hurtigere end HCT116 celler, hvilket antyder, at PIPKIγ er afgørende for hurtig bevægelse celler, men ikke for langsomt migrerende celler som HCT116 celler. Dette understøttes af vores ikke offentliggjorte resultat, at PIPKIγ

K188,200R dramatisk inhiberer migreringen af ​​Klon A-celler, en hurtig bevægelse coloncancercellelinie.

På den anden side, PIPKIγ synes at være nødvendig for invasionen af ​​både hurtigtvirkende (såsom MDA-MB-231) og langsom-invaderende (såsom HCT116) kræftceller. Udtømning af PIPKIγ har vist sig at inhibere EGF-stimuleret invasion af MDA-MB-231-celler [37], og der enten udtrykker PIPKIγ

K188,200R eller udtømningen af ​​PIPKIγ inhiberer invasion af HCT116 celler (fig. 7). Disse resultater indikerer en væsentlig rolle PIPKIγ i at kontrollere cancer invasion.

Tidligere undersøgelser har fokuseret på rollen af ​​fokal adhæsion demontering i reguleringen cancer invasion. Katastrofeforebyggelse fremmer gliom invasion ved at fremme fokal vedhæftning demontering [6]. Filamin A undertrykker brystcancer celleinvasion ved at inhibere fokal adhæsion demontering [7]. FAK fremmer også fokal adhæsion afmontering og cancer invasion [9]. vores resultater viser dog, at begge udtryk for PIPKIγ

K188,200R, kinase-død mutant, og udtømning af PIPKIγ forringe fokal vedhæftning dannelse, der ledsager hæmning af invasionen af ​​HCT116 (Fig. 4, 5 og 7). Desuden PIPKIγ stimulerer både fokal adhæsion samling og adskillelse (fig. 3), hvilket antyder, at fokal adhæsion omsætning, hvilket kræver fokal adhæsion samling og adskillelse rumligt og midlertidigt, regulerer invasion af cancerceller.

PIPKIγ er en større enzym der styrer polyphosphoinositide metabolisme i HCT116-celler. PIPKIγ Knockdown resulterer i signifikant reduktion i niveauet af PI (4,5) P

2 og nedsætter PI (3,4,5) P

3 niveauer endnu mere væsentligt (fig. 8). PI (3,4,5) P

3 spiller en vigtig rolle i tumorgenese og cancermetastase. Imidlertid PIPKIγ knockdown ikke påvirker aktiveringen af ​​Akt, et vigtigt mål for PI (3,4,5) P

3, i HCT116-celler (data ikke vist), sandsynligvis fordi Akt kan aktiveres af PI (3, 4) P

2, som ikke direkte påvirkes af PIPKIγ.

Inhibering af PI 3-kinase under anvendelse af LY294002 påvirker ikke fokal adhæsionsdannelse i HCT116-celler, hvilket antyder, at PI (4,5) P

2 i stedet for PI (3,4,5) P

3 er ansvarlig for PIPKIγ-medieret fokal adhæsionsdannelse. PI (4,5) P

2 fremmer vinculin binding til talin og actin og har vist sig at være afgørende for fokal adhæsionsdannelse [32]. Vores resultat viser, at PIPKIγ regulerer vinculin lokalisering til fokale sammenvoksninger i HCT116-celler (Fig. 9). Tilsammen er det mest sandsynligt, at PIPKIγ regulerer fokal adhæsionsdannelse gennem PI (4,5) P

2-medieret vinculin aktivering.

Cancer invasion er en kompliceret proces, der kræver fysisk og midlertidig regulering af celle -matrix sammenvoksninger, celle fremspring og matrix-nedbrydning [38]. PI (4,5) P

2 genereret af PIPKIγ regulerer cancer invasion gennem modulerende celleadhæsion dynamik. Selvom PI (3,4,5) P ikke er essentiel for fokal adhæsionsdannelse

3, kan den også spille en rolle i andre aspekter af cancer invasion, sandsynligvis gennem aktivering Rac [39].

Materialer og metoder

Reagenser

Anti-paxillin antistof (klon 5H11) var fra Millipore; Anti-PIPKIγ polyklonale antistof var fra Cell Signaling Technology; Anti-tubulin antistof og pLKO1 lentivirus PIPKIγ shRNA (sekvens: CCG GGC AGT FTT ACA GGT TCA TCA ACT CGA GTT GAT GAA FTT GTA GGA CTG CTT TTT G) var fra Sigma; DyLight 549 konjugeret ged anti-mus IgG (H + L) var fra Thermo Scientific; Fibronectin og rekombinant HGF var fra Akron Biotech; Vækst faktor reduceret Matrigel var fra BD Bioscience; Plasmidet pEGFP-PIPKIγ var en gave fra Dr. Mark Ginsberg (University of California-San Diego); Pfu Ultra var fra Agilent Technologies; DNA-primere blev syntetiseret af Integrated DNA Technologies.

Plasmidkonstruktion

Plasmidet pEGFP-PIPKIγ

W647F blev genereret af pfu Ultra-baserede PCR ved hjælp pEGFP-PIPKIγ som skabelon og 5′ GAT GAG AGG AGC TTT GTG TAC TCC CCG CTC-3 ‘/5′-GAG CGG GGA GTA CAC AAA GCT CCT CTC ATC-3’ som primere. pEGFP-PIPKIγ

K188,200R og pZZ-PIPKIγ

K188,200R blev skabt ved PCR ved hjælp af pEGFP-PIPKIγ og pZZ-PIPKIγ [40] som skabeloner, henholdsvis og sekventielt 5′-GAC GAG TTC ATC ATC AGG ACC GTC ATG CAC-3 ‘/5′-GTG CAT GAC GGT FTT GAT GAT GAA CTC GTC-3′ og 5’-GTT CCT GCA GAG GCT GCT CCC TGG CTA C-3 ‘/5’-GTA GCC AGG GAG CAG CCT CTG CAG GAA C-3 ‘som primere.