PLoS ONE: TGF-β1 nedregulerer COX-2 Expression Førende til Fald af PGE2 Produktion i Human Lung Cancer A549 Cells, som er involveret i Fibrotiske Reaktion på TGF-β1

Abstrakte

transformerende vækstfaktor-SS1 (TGF-β1) er en multifunktionel cytokin, der er involveret i forskellige patofysiologiske processer, herunder cancer progression og fibrøse lidelser. Her viser vi, at behandling med TGF-β1 (5 ng /ml) inducerede nedregulering af cyclooxygenase-2 (COX-2), hvilket fører til nedsat syntese af prostaglandin E2 (PGE2), i human lunge cancer A549-celler. Behandling af celler med specifikke inhibitorer af COX-2 eller PGE2-receptor resulterede i væksthæmning, hvilket indikerer, at COX-2 /PGE2 pathway bidrager til proliferation på en autokrin måde. TGF-β1 behandling induceret væksthæmning, som blev svækket med exogent PGE2. TGF-β1 er også en potent inducer af epitelial mesenkymale overgang (EMT), en fænotype ændring hvori epitelceller differentierer til fibroblastoidceller. Supplering med PGE2 eller PGE2 receptor EP4 agonist PGE1-alkohol, sammenlignet med EP1 /3 agonist sulproston, inhiberede TGF-β1-inducerede ekspression af fibronectin og collagen I (ekstracellulær matrix komponenter). Exogent PGE2 eller PGE2 receptoragonister også undertrykt actin remodellering induceret af TGF-β1. Disse resultater antyder, at PGE2 har en anti-fibrotisk virkning. Vi konkluderer, at TGF-β1-inducerede nedregulering af COX-2 /PGE2-signalering er involveret i at fremme fibrotisk EMT respons i A549-celler

Henvisning:. Takai E, Tsukimoto M, Kojima S (2013) TGF-β1 nedregulerer COX-2 Expression førende til Fald af PGE2 Produktion i human Lung Cancer A549 Cells, som er involveret i Fibrotiske reaktion på TGF-β1. PLoS ONE 8 (10): e76346. doi: 10,1371 /journal.pone.0076346

Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Center for Bioteknologi, Indien

Modtaget: 23. maj 2013; Accepteret: August 23, 2013; Udgivet: 2 Oktober 2013

Copyright: © 2013 Takai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

transformerende vækstfaktor-SS1 (TGF-β1) blev oprindeligt opdaget som et udskilt protein, der inducerer omdannelse og væksten af ​​normale fibroblaster [1], og det er nu veletableret at være involveret i forskellige fibrotiske lidelser, såsom lunge- og leverfibrose [2-4]. Faktisk TGF-β1 er et multifunktionelt cytokin, der regulerer forskellige fysiologiske processer, herunder cellevækst, differentiering og tumorigenese. Det udskilles i tumor mikromiljøer fra mange kræftceller og fungerer som en tumor promotor ved at inducere angiogenese, immun-escape og metastase [5-7]. Lungefibrose, såsom idiopatisk lungefibrose (IPF), er velkendt for at være forbundet med øget risiko for lungekræft. På den anden side, er det også blevet foreslået, at fibrose i lungetumor er en sekundær fænomen snarere end et forstadium til kræft, og det blev påvist, at graden af ​​fibrose er korreleret med kræft progression og prognose [8,9]. Imidlertid er mekanismerne for udvikling af fibrose i lungetumor ikke godt forstået.

I epitelceller, TGF-β1 inducerer en fænotype ændring kaldes epithelial mesenkymale overgang (EMT), som er den proces, hvorigennem epiteliale celler differentierer i fibroblastlignende mesenchymceller. EMT er en normal fysiologisk proces afgørende for korrekt embryogenese og vævsmorfogenese. På den anden side er EMT også involveret i sårheling og cancer progression i voksent væv [10,11]. Selvom et bidrag på EMT-afledte fibroblastlignende celler til fibrose er blevet foreslået [12,13], signaleringsdata mekanismerne bag TGF-β1-inducerede biologiske begivenheder i cancerceller er ikke fuldt forstået.

Cyclooxygenase (COX ) er det hastighedsbegrænsende enzym i prostanoide syntese. Mens COX-1 udtrykkes konstitutivt, COX-2 er inducerbar, og er velkendt for at være involveret i inflammation. Ekspression af COX-2 er forhøjet i mange tumorvæv, herunder lungecancer [14,15]. Prostaglandin E2 (PGE2), som er den dominerende prostaglandin, udøver biologisk via G-protein-koblede receptorer (dvs. EP1-EP4) [16]. Det er blevet rapporteret, at PGE2 er involveret i tumorvækst, immunosuppression, eller angiogenese [17-20]. Det er også blevet rapporteret, at COX-2 overudtrykkes i mange lungecancere, og PGE2 er involveret i proliferation, modstandsdygtighed over for apoptose og induktion af T-regulatoriske celler [21-24]. I ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), overekspression eller aktiverende mutation af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) fører til afvigende proliferation eller migration. Derfor er EGFR etableret som en molekylær markør for NSCLC, og er meget brugt til forudsigelse af prognose eller behandling valg. COX-2, såvel som EGFR, er en mulig molekylær markør for NSCLC [14].

Vi har for nylig rapporteret, at behandling af humane NSCLC A549-celler med TGF-β1 inducerer EMT fører til forøgelse af cellemigrering [ ,,,0],25]. I den foreliggende undersøgelse at afsløre mekanismen for TGF-β1-inducerede lungekræft progression, undersøgte vi virkningen af ​​TGF-β1 på ekspression af COX-2 i A549-celler. Tidligere er det blevet rapporteret, at TGF-β1 inducerer COX-2 ekspression under EMT i mammaepitelceller [26]. I modsætning til tilfældet i mammae epitelceller, fandt vi for første gang, at TGF-β1 nedregulerer COX-2 i humane NSCLC A549-celler. Vi viser her, at denne effekt er relateret til vækstinhibering og lettelse af fibrotisk EMT respons, hvilket antyder, at COX-2 /PGE2 signalering er vigtig for styring af cellulære processer i A549-celler.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

DMEM, human rekombinant TGF-β1, SB431542, cycloheximid og methylacetat blev købt fra Wako Pure Chemical (Osaka, Japan). FBS blev købt fra Biowest (Nuaille, Frankrig). AH6809, L798106, L161982, sulproston, butaprost og PGE1-alkohol blev indkøbt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). Prostaglandin E2, actinomycin D og anti-N-cadherin antistof blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Specifik inhibitor af Smad3 (SIS3) og NS-398 blev indkøbt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Rhodamin phalloidin blev indkøbt fra Cytoskeleton, Inc. (Denver, CO, USA). Kanin polyklonalt anti-COX-2-antistof blev købt hos Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Kanin polyklonale anti-høj mobilitet gruppe kasse 1 (HMGB1) antistof blev købt fra Abcam (Cambridge, UK). Kanin polyklonalt anti-COX-1-antistof og monoklonalt muse-anti-actin-antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Muse monoklonalt anti-E-cadherin antistof (Klon 36B5) blev indkøbt fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Muse monoklonalt anti-fibronectin-antistof blev indkøbt fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA).

Cellekultur Salg

A549 humane adenocarcinoma celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, penicillin (100 enheder /ml) og streptomycin (100 mg /ml) i en fugtig atmosfære af 5% CO2

i luft ved 37 ° C.

immunblotting

Celler blev lyseret i PBS indeholdende 10 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 1% Triton X100, 5 mM EDTA, 30 mM natriumpyrophosphat, 50 mM natriumfluorid, 1 mM natriumorthovanadat, 1,04 mM 4- (2-aminoethyl) benzensulfonylfluorid, 0,8 pM aprotinin, 21 uM leupeptin, 36 pM bestatin, 15 uM pepstatin A og 14 uM E-64, ved 4 ° C i 30 minutter. Lysater blev centrifugeret ved 10.000 x g i 15 minutter. Efter fjernelse af cellulært debris blev proteinindholdet i hver prøve bestemt ved anvendelse af Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Lige store mængder protein lysat blev opløst i 2 x prøvebuffer (50% glycerin, 2% SDS, 125 mM Tris, 10 mM DTT) og kogt i 10 min. Portioner af prøver indeholdende 6 ug protein blev analyseret ved hjælp af 7,5-15% SDS-PAGE og bånd blev overført på en PVDF-membran. Blottene blev blokeret natten over i TBST med 1% BSA, 5% skummetmælk ved 4 ° C, derefter inkuberet med kanin COX-2-antistof (1: 1000), kanin COX-1-antistof (1: 1000), kanin HMGB1 antistof ( 1: 1000), muse actin antistof (1: 1000), muse E-cadherin antistof (1: 1000), muse N-cadherin antistof (1: 1000) eller muse fibronectin-antistof (1: 1000) natten over ved 4 ° C. Efter at være blevet vasket med TBST, blev blots inkuberet med gede HRP-konjugeret anti-kanin IgG-antistof (Cell Signaling Technology, Inc.) eller gede-anti-muse-IgG-antistof-HRP (Santa Cruz Biotechnology) i 90 minutter ved stuetemperatur. Blottene blev igen vasket med TBST, og specifikke proteiner blev visualiseret ved anvendelse af ECL Western blotting-påvisningsreagenser (GE Healthcare) ifølge producentens anvisninger. Bandet intensiteter blev kvantificeret ved densitometrisk analyse ved hjælp ImageJ software (National Institutes of Health).

PGE2 EIA

PGE2 produktion fra cellerne blev bestemt med et enzym immunoassay (EIA) kit (Cayman Chemical) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, PGE2-acetylcholinesterase konjugat, monoklonalt muse-anti-PGE2-antistoffet, og enten standard eller prøve blev tilsat til hver brønd af en VVM plade overtrukket med gede polyklonalt anti-muse-IgG. Efter inkubation i 18 timer ved 4 ° C blev pladen vasket fem gange for at fjerne alle bundne reagenser. Ellmans reagens blev derefter tilsat til hver brønd, og den udviklede Pladen blev aflæst ved 405 nm med en Wallac ARVO SX multilabel counter (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA).

Real-time RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra A549-celler under anvendelse af en Fast Pure RNA kit (Takara Bio). Den første streng cDNA blev syntetiseret fra total RNA med PrimeScript revers transkriptase (Takara Bio). CDNA’et blev anvendt som en skabelon for real-time-PCR-analyse: reaktioner blev udført i en Stratagene Mx3000P

® QPCR systemet (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). Sekvenserne af specifikke primere til human COX-2 var 5′-GAGAAAACTGCTCAACACCGGA-3 ‘(sense) og 5′-CACAACGTTCCAAAATCCCTTG-3′ (antisense), dem, for human COL1A1 var 5’-CACACGTCTCGGTCATGGTA-3 ‘(sense) og 5 »- AAGAGGAAGGCCAAGTCGAG-3 ‘(antisense). Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) mRNA blev bestemt som en positiv kontrol. Hver prøve blev analyseret i en 20 pi amplifikationsreaktionsblanding indeholdende cDNA, primere (5 uM hver af sense- og antisense-primere) og 2x KAPA SYBR

® FAST qPCR Master Mix (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA). Amplifikationen program omfattede 40 cykler af 95 ° C i 3 sek og 60 ° C i 30 sek. Fluorescerende produkter blev påvist på det sidste trin af hver cyklus. De opnåede værdier var inden for det lineære område af standardkurven og blev normaliseret til GAPDH mRNA-ekspression.

Cellecyklusanalyse

cellecyklussen blev analyseret ved propidiumiodid (PI) farvning. A549-celler blev trypsinbehandlet og fikseret med 70% ethanol i 60 minutter på is. RNA blev fjernet ved behandling med RNase A (0,34 mg /ml), hvorefter cellerne blev inkuberet med 50 mg /ml PI i 30 minutter på is. Farvede celler blev analyseret under anvendelse af et FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), og ti tusinde celler blev vurderet. DNA-profil er angivet den relative forekomst af cellepopulationen i G0 /G1, S og G2 /M faser. De procentdele af celler i hver fase af cellecyklussen blev bestemt ved statistisk analyse under anvendelse Cell Quest software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Proliferationsassay

celleproliferation assays blev udført under anvendelse af bromdeoxyuridin (BrdU) (kolorimetrisk) celleproliferation ELISA (Roche, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev A549-celler podet i 96-brønds plader og behandlet med vehikel eller reagenser i et endeligt volumen på 100 pl /brønd. Efterfølgende blev 10 pi af BrdU-mærkning opløsning tilsat til hver brønd, og inkubation blev fortsat i 2 timer. Efter fjernelse af BrdU-mærkning opløsning blev celler tørret og inkuberet med kittets FixDenat-opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter denaturering af DNA’et blev prøver inkuberet med peroxidase-konjugeret anti-BrdU-antistof i 90 min. Ubundne antistoffer blev vasket af og 100 pi af luminescens-substrat blev tilsat. Luminescensen blev kvantificeret under anvendelse af en Wallac ARVO SX multilabel counter.

Celleproliferation blev også analyseret ved at tælle celler. A549-celler blev podet i 24-brønds plader og behandlet med TGF-β1 og PGE2. Efter inkubering blev cellerne trypsiniseret og talt under anvendelse af en TC10

TM Automatiseret celletæller (Bio-Rad Laboratories).

fluorescensimagografi

I F-actin-farvning blev celler fikseret med 4 % paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur, og permeabiliseret med 0,5% Triton X-100 i 5 min på is. Fikserede celler blev inkuberet med 100 nM rhodamin phalloidin i 30 minutter ved stuetemperatur. Modfarvning med Hoechst 33258 (10 ug /ml) blev anvendt til at verificere placeringen og integritet kernerne. Farvede celler blev analyseret under anvendelse af et konfokalt laserscanningsmikroskop (TCS SP2, Leica, Mannheim, Tyskland) udstyret med en HCX PLApo 63 x 1,32 NA olie objektivlinse. Leica konfokal software (TCS SP2, udgave 2.6.1) blev anvendt til erhvervelse og behandling billede.

cellemigrationsassay

Cellemigrering analyseret ved anvendelse af 24-brønds Transwell-plader (6,5 mm diameter ; 8 um porestørrelse polycarbonatmembran, Corning, Lowell, MA, USA). Det øvre rum blev podet med A549-celler (2 x 10

4 celler) i naeringsoploesning. Efter 24 timer blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende TGF-β1. Det øvre kammer indeholdt 5% FBS i stedet for 10%. Efter inkubation i yderligere 24 timer blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur og inkuberet med 50 ug /ml PI i 30 minutter ved stuetemperatur. Ikke-migrerede celler på den øvre overflade af membranen blev fjernet og celler, der var migreret gennem membranen til den nedre overflade blev talt ved anvendelse af et fluorescens mikroskop (BZ-9000, KEYENCE).

Statistik

Resultater udtrykkes som middel ± SE. Den statistiske signifikans af forskelle mellem kontrol og andre grupper blev beregnet ved anvendelse af Dunnetts test eller uparret t-test med Instat version 3.0 statistisk pakke (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Kriteriet betydning blev sat til P 0.05.

Resultater

TGF-β1 nedregulerer COX-2-ekspression og PGE2-produktion i A549 celler

I mange typer af kræft, TGF-β1 udskilles i tumor mikromiljø og virker som en tumor promotor. For at undersøge TGF-β1-inducerede progression af human lungecancer, vi stimulerede humane lunge cancer A549-celler med TGF-β1. COX-2 konstitutivt overudtrykkes i A549-celler under standard cellekultur betingelser. Overraskende fandt vi, at ekspression af COX-2-protein dramatisk blev formindsket ved behandling med 5 ng /ml TGF-β1 (figur 1A). Faldet af COX-2-protein 24 timer efter stimulering blev TGF-β1 dosisafhængig (figur 1B). På den anden side er ekspressionen af ​​COX-1 i A549-celler var lav, og blev ikke ændret af TGF-β1 behandling (figur 1A, B). TGF-β1 aktiverer TGF-p serin /threonin kinase receptorer. Efter ligandbinding TGF-β type I receptor (TßRI) og type II receptor (TßRII) danner en tetramer receptor heterokompleks, der fører til phosphorylering af Smad proteiner, de vigtigste downstream effektormolekyler for disse receptorer ved kinase aktiviteterne i den cytoplasmatiske domæne af TßRI. Behandling med TßRI inhibitor SB431542 eller Smad3 inhibitoren SIS3 [27] blokeret COX-2 nedregulering af TGF-β1 (Fig 1C). Resultaterne indikerer, at TGF-β1-inducerede nedregulering af COX-2 er associeret med aktivering af TGF-p-receptorer og Smad signalvejen.

(A) Ekspression af COX-2-protein blev detekteret ved immunoblotting som beskrevet i Materialer og Metoder. Behandling med TGF-β1 (5 ng /ml) undertrykt ekspression af COX-2, men ikke COX-1 i A549-celler. HMGB1 blev målt som en loading kontrol. (B) Dosisafhængig nedregulering af COX-2 ved TGF-β1. Fireogtyve timer efter TGF-β1 stimulation (1-10 ng /ml), ekspression af COX-2 og COX-1 blev påvist. (C) SB431542 (10 uM) eller SIS3 (30 uM) blokerede TGF-β1-inducerede COX-2 nedregulering. Celler blev forbehandlet i 60 minutter med inhibitoren, og derefter inkuberet med eller uden TGF-β1 (5 ng /ml) i 24 timer. (D) TGF-β1 undertrykte COX-2-produktion i A549-celler. Celler blev behandlet med TGF-β1 (1-10 ng /ml) eller NS-398 (50 uM) i 24 timer, hvorefter koncentrationen af ​​PGE2 i dyrkningsmedium blev målt ved EIA som beskrevet i Materialer og Metoder. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE (n = 4). Væsentlige forskelle mellem de angivne grupper og kontrolgruppen er angivet med ** (P 0,01).

COX-enzymer omdanne arachidonsyre til prostaglandin H2, som videreforarbejdes i forskellige prostaglandiner, herunder PGE2 , det fremherskende prostaglandin i lungen [28,29]. At evaluere PGE2-produktion i A549-celler, målte vi den ekstracellulære koncentration af PGE2 i dyrkningsmedium ved anvendelse af enzymimmunassay. Som vist i figur 1 D, blev ekstracellulær koncentration af PGE2 faldt ved behandling med TGF-β1 i 24 timer. En selektiv inhibitor af COX-2, NS-398, fuldstændig elimineret PGE2 fra dyrkningsmediet, hvilket indikerer, at produktionen af ​​PGE2 i A549-celler hovedsageligt afhænger af funktionen af ​​COX-2. Disse resultater viser, at TGF-β1 stimulation stærkt undertrykker ekspressionen af ​​COX-2 og resulterer i en reduktion af PGE2-produktion i A549-celler.

Suppression af COX-2-ekspression af TGF-β1 medieres af transkriptionel repression

Derefter undersøgte vi, mekanismen af ​​TGF-β1-inducerede COX-2 nedregulering i A549-celler. COX-2 protein-ekspression kunne blive påvirket af protein nedbrydning, ændret mRNA stabilitet og ændret transskription sats. Brug real-time RT-PCR-analyse, undersøgte vi ekspressionen af ​​COX-2 mRNA på TGF-β1 behandling fra 0,5 til 3 timer. Som vist i figur 2A, blev COX-2-mRNA faldt hurtigt og nåede ca. 50% af kontrollen inden for 30 min efter stimulering. Dette resultat indikerer, at faldet af COX-2-protein efter TGF-β1 stimulation er hovedsagelig et resultat af et fald i COX-2-mRNA. For at undersøge om TGF-β1 påvirker COX-2-mRNA stabilitet blev celler forbehandlet med transskriptionsinhibitor actinomycin D før TGF-β1 stimulation. Derefter blev COX-2-mRNA-niveau undersøgt ved real-time RT-PCR. Kontrolceller behandlet med actinomycin D alene viste et signifikant fald i COX-2-mRNA. Behandling med TGF-β1 påvirkede ikke COX-2-mRNA stabilitet, som nedbrydningshastigheden var identisk med det observeret i kontrolceller (figur 2B). Endvidere undersøgte vi COX-2-protein stabilitet under anvendelse proteinsynteseinhibitoren cycloheximid (CHX). Celler blev behandlet med CHX eller CHX plus TGF-β1, og derefter COX-2-protein-niveauet blev undersøgt ved immunoblotting. Som vist i figur 2C blev COX-2-protein faldt i kontrolceller behandlet med CHX alene og TGF-β1 påvirkede ikke COX-2-protein stabilitet. Disse resultater viser, at TGF-β1 ikke ændrer COX-2 proteinnedbrydning og mRNA-stabilitet, men snarere virker på det transskriptionelle niveau.

(A) Time-afhængigt fald af COX-2-mRNA-ekspression ved behandling med TGF -β1 (5 ng /ml). COX-2-mRNA-niveau blev målt ved real-time RT-PCR som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) Celler blev forbehandlet med actinomycin D (5 ug /ml) i 1 time og inkuberet med eller uden TGF-β1 (5 ng /ml) i de angivne tidsrum. TGF-β1 påvirkede ikke fald i COX-2-mRNA ved actinomycin D. COX-2-ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH ekspressionsniveauer og udtrykt som en procentdel af det i ikke-behandlede celler (kontrol). Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE (n = 3). (C) Celler blev inkuberet med CHX (50 ug /ml) eller CHX plus TGF-β1 (5 ng /ml) i de angivne tidsrum og COX-2-protein-ekspression blev detekteret ved immunoblotting. TGF-β1 påvirkede ikke fald i COX-2-protein ved CHX. De båndintensiteter blev kvantificeret og COX-2 /actin værdier blev udtrykt som forhold til dem for kontrol. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE (n = 4).

Nedregulering af COX-2 er relateret til TGF-β1-inducerede vækstinhibering af A549-celler

For at klarlægge betydningen af TGF-β1-inducerede COX-2 nedregulering, Derefter undersøgte vi, hvilke roller COX-2 og PGE2 spiller i de biologiske funktioner af A549-celler. PGE2 aktiverer EP-receptorer, der er klassificeret i 4 undertyper; Gq-protein-koblet EP1, Gi-protein-koblet EP3, Gs-protein-koblet EP2 og EP4. Disse EP-receptorer er blevet impliceret i proliferation af forskellige cancerceller [22,30-32]. Det blev også foreslået, at PGE2 og EP-receptorer er involveret i proliferation af NSCLC-celler [33]. Vi undersøgte inddragelse af COX-2 /PGE2 i cellecyklus af A549-celler. Behandling med COX-2-inhibitor NS-398 i 3 dage resulterede i et fald i S-fase og en stigning i G0 /G1-fasen (figur 3A). Som vist i figur 3B, EP1 /2 antagonist AH6809, EP3 antagonist L798106 eller EP4 antagonist L161982 også signifikant reduceret forholdet mellem S-fase celler. Vi undersøgte yderligere celleproliferation ved hjælp BrdU assay; inkorporering af BrdU indikerer DNA-syntese under celleproliferation. Behandling med disse EP-antagonister undertrykt BrdU inkorporering i A549-celler (figur 3C). Vi analyserede også ekspressionen af ​​EP-receptorer i A549-celler ved RT-PCR, og bekræftede ekspression af alle 4 receptorundertyper (data ikke vist). Disse resultater indikerer, at konstitutiv produktion af PGE2, i det mindste i et vist omfang, bidrager til proliferation af A549-celler via EP receptorer under standard dyrkningsbetingelser.

(A) A549-celler blev inkuberet med NS-398 (50 uM) i 3 dage og cellecyklussen blev analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder. Behandling med NS-398 faldt forholdet mellem S-fase celler. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE (n = 3). (B) Celler blev behandlet med AH6809 (30 uM), L798106 (30 uM) eller L161982 (30 pM) i 3 dage, derefter cellecyklussen blev analyseret, og procentdelen af ​​S-fasen blev beregnet. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE (n = 5-7) (C) Behandling med AH6809 (30 uM), L798106 (30 uM) eller L161982 (30 pM) i 3 dage undertrykte proliferation af A549-celler. Celleproliferation blev undersøgt ved BrdU assay som beskrevet i Materialer og Metoder. BrdU-inkorporering niveauer blev udtrykt i forhold til det i ikke-behandlede celler (kontrol). Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE (n = 6). Væsentlige forskelle mellem de angivne grupper og kontrolgruppen er angivet med * (P 0,05) og ** (P 0,01)

Derfor TGF-β1-induceret nedregulering af COX-2. kunne påvirke proliferation af A549-celler. Stimulering med TGF-β1 også faldet S fase og forøget G0 /G1-fasen af ​​A549-celler (figur 4A). Denne cellecyklusstandsning iagttoges fra 3 dage efter behandling, når A549-celler kan udtrykke mindre COX-2. Faktisk TGF-β1-inducerede reduktion af S-fase celler havde tendens til at blive ophævet med exogent PGE2 på en dosis-afhængig måde (figur 4B). For yderligere at undersøge virkningen af ​​TGF-β1 på proliferation af A549-celler, målte vi celleproliferation ved hjælp af BrdU assay. Vi bekræftede, at BrdU-inkorporering blev reduceret med TGF-β1 stimulation i 3 dage, og dette TGF-β1-inducerede suppression af BrdU-inkorporering blev delvist svækket i nærvær af PGE2 (figur 4C). Vi fandt også, at TGF-β1 ikke påvirkede ekspressionsmønsteret for EP receptorsubtyper i A549-celler (data ikke vist). Disse resultater understøtter idéen om, at TGF-β1-inducerede COX-2 nedregulering er forbundet med suppression af proliferation af A549-celler. Faktisk blev celletallet i prøver behandlet med TGF-β1 i 3 dage faldt, sammenlignet med tilfældet af ikke-behandlede celler, og tilsætning af PGE2 øgede celletallet af TGF-β1-behandlede celler (figur 4D). Således er vores resultater antyder, at TGF-β1-inducerede vækstinhibering af A549-celler delvist medieres af nedregulering af COX-2. Da celle vækststandsning ved G0 /1 fase er afgørende for celledifferentiering, kan TGF-β1-inducerede vækstinhibering af A549-celler være forbundet med EMT induceret af TGF-β1 i A549-celler. Salg

(A) A549-celler blev behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) i de angivne tider og cellecyklussen blev analyseret. Behandling med TGF-β1 faldt forholdet mellem S-fase celler. (B-D) Fireogtyve timer efter inkubation med eller uden TGF-β1 (5 ng /ml) blev celler tilsat PGE2 (10, 25 uM) og yderligere inkuberet i 2 dage. Proliferation blev undersøgt ved cellecyklus-analyse (B), BrdU assay (C) og celletælling (D) som beskrevet i Materialer og Metoder. PGE2 ophævet TGF-β1-inducerede vækstinhibering. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE (n = 3-5). Væsentlige forskelle mellem de angivne grupper og kontrolgruppen er angivet med * (P 0,05) og ** (P 0,01)

nedregulering af COX-2 accelererer TGF-β1-induceret fibrotisk. EMT respons

TGF-β1 er velkendt for at være en potent inducer af EMT, som er en fænotype ændring, der involverer differentiering af epitelceller i fibroblastoid-lignende celler. I processen med EMT, epiteliale markørproteiner, såsom E-cadherin, er tabt, og mesenkyme proteiner, herunder N-cadherin og fibronectin, opreguleres. Vi bekræftede fald i E-cadherin og forøgelse af N-cadherin ved 48 timer efter TGF-β1 stimulation. Samtidig blev ekspression af fibronektin forhøjet (figur 5A). For at undersøge involveringen af ​​COX-2 nedregulering i disse TGF-p1-induceret EMT responser blev celler costimulated med TGF-β1 og PGE2. Som vist i figur 5B, PGE2 (25 pM) påvirkede ikke tabet af E-cadherin eller opregulering af N-cadherin induceret af TGF-β1. På den anden side blev TGF-β1-inducerede opregulering af fibronectin markant inhiberet af exogent PGE2. PGE2 undertrykt TGF-β1-inducerede fibronectin ekspression ved doser så lave som 5-10 uM (figur 5C). Dernæst undersøgte vi også effekten af ​​EP receptoragonister på fibronektin udtryk. Behandling med EP2-receptoragonist butaprost eller EP4 receptor agonist PGE1-OH inhiberede stigningen af ​​fibronectin induceret af TGF-β1, hvorimod EP1 /3 receptoragonist sulproston havde nogen virkning (figur 5D). Disse resultater antyder, EP2 og EP4 receptorer medierer den undertrykkende virkning af PGE2 på TGF-β1-inducerede fibronectin ekspression.

(A) A549-celler blev behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) i de angivne tidsrum og ekspression af E-cadherin, N-cadherin og fibronectin blev påvist ved immunoblotting. (B) Otteogfyrre timer efter inkubation med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (25 pM), ekspressionen af ​​E-cadherin, N-cadherin og fibronectin evalueret. (C) Celler blev inkuberet med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (5-25 uM) i 48 timer, og ekspressionen af ​​fibronectin blev undersøgt. PGE2 undertrykt fibronectin induktion med TGF-β1. (D) Celler blev behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) og køretøjet (methylacetat), sulproston, butaprost eller PGE1-OH (20 uM) i 48 timer og ekspressionen af ​​fibronectin blev vurderet. Behandling med butaprost eller PGE1-OH inhiberede TGF-β1-inducerede stigning af fibronectin ekspression. HMGB1 blev detekteret som en loading kontrol. De båndintensiteter blev kvantificeret ved densitometri og udtrykt som forhold til dem for hver kontrol.

Fibronectin er en bestanddel af ECM og ændrede fibronectin ekspression er forbundet med fibrotiske sygdomme. Vi yderligere undersøgt, om TGF-β1 inducerer ekspression af kollagen I, som er en væsentlig ECM komponent i fibrotiske væv [34-36]. COL1A1 (kodende kollagen I) transkript niveau var forhøjet ved stimulering med TGF-β1 (5 ng /ml) i en tidsafhængig måde (Figur 6A). Denne TGF-β1-inducerede ekspression af COL1A1 blev svækket ved supplering med exogen PGE2 (figur 6B). Samt PGE2, PGE1-OH stærkt undertrykt COL1A1 induktion af TGF-β1, mens butaprost og sulproston udstillet kun beskedne undertrykkende virkninger (figur 6C). Tilsammen viser disse resultater, at nedregulering af COX-2 og PGE2-produktion af TGF-β1 er involveret i produktionen ECM komponent i A549-celler.

(A) Celler blev stimuleret med TGF-β1 (5 ng /ml) i de angivne tidsrum; derefter total RNA blev ekstraheret og COL1A1 genekspression blev undersøgt ved real-time RT-PCR. (B) Fireogtyve timer efter behandling med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (5-25 uM), blev COL1A1 genekspression undersøgt. PGE2 ophævet TGF-β1-inducerede COL1A1 genekspression. (C) Celler blev behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) og køretøjet (methylacetat), sulproston, butaprost eller PGE1-OH (20 uM) i 24 timer, og COL1A1 mRNA-niveauet blev målt. PGE1-OH undertrykt COL1A1 induktion med TGF-β1. COL1A1 genekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH-ekspression og er vist som en procentdel af det i TGF-p1-behandlede celler. Hver værdi repræsenterer middelværdien ± SE (n = 3). Væsentlige forskelle mellem de angivne grupper og kontrolgruppen er angivet med ** (P 0,01).

TGF-β1-induceret undertrykkelse af PGE2 produktion er involveret i actin remodeling i A549 celler

Vi undersøgte også stress fiber dannelse actin, som er blevet betragtet som et kendetegn for fibroblastoidceller, samt en del af EMT. Som vist i figur 7A, TGF-β1 (5 ng /ml) påfaldende induceret actinpolymerisation, hvorimod actin stress fibre næppe blev påvist i PGE2-behandlede celler. Behandling med butaprost eller PGE1-OH inhiberede også TGF-β1-inducerede actin stress fiberdannelse. På den anden side, sulproston lidt undertrykt actinpolymerisation af TGF-β1. Da aktin stress fibre er relateret til celle motilitet, vi undersøgte også celle migration ved Transwell assay. Som vist i figur 7B, stimulation med TGF-β1 forøgede cellemigration inden for 24 timer, mens antallet af migrerede celler blev reduceret i nærvær af PGE2. Disse resultater antyder, at TGF-β1-inducerede suppression af PGE2 produktion er relateret til actin stress fiber dannelse og vandring af A549-celler.

(A) A549-celler blev inkuberet med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (10 pM), vehikel (methylacetat), sulproston, butaprost eller PGE1-OH (20 uM) i 12 timer. Derefter F-actin blev farvet ved anvendelse rhodamin phalloidin (rød) og farvede celler blev analyseret ved anvendelse af en konfokal laser-scanning-mikroskop ved x63 forstørrelse. TGF-β1-inducerede actin stress fiberdannelse blev undertrykt af PGE2, butaprost eller PGE1-OH. For at verificere placeringen af ​​kerner blev celler farvet med Hoechst33258 (blå). (B) Cell migration blev undersøgt ved Transwell assay som beskrevet i Materialer og Metoder. A549-celler blev behandlet med TGF-β1 (5 ng /ml) og PGE2 (10 pM) i 24 timer;