PLoS ONE: Differential Expression of PRAMEL1, en kræft /Testis Antigen, under Spermatogenese i Mouse

Abstrakt

PRAME tilhører en gruppe af cancer /testis-antigener (CTA’er), der er karakteriseret ved deres begrænsede udtryk i normale gametogenic væv og en række tumorer.

PRAME

familie er en af ​​de mest amplificerede genfamilier i mus og andre mammale genomer. Medlemmer af

PRAME

genfamilien indkode leucin-rige gentagelse (LRR) proteiner fungerer som transskription regulatorer i kræftceller. Imidlertid rolle PRAME i normale gonader er ukendt. Formålet med denne undersøgelse er at karakterisere den tidsmæssige og rumlige udtryk for musen

Pramel1

gen, og at bestemme den cellulære lokalisering af PRAMEL1 protein under musen spermatogenesen. Vores resultater viste, at mus

Pramel1

blev udtrykt i testiklerne kun. MRNA’et og proteinekspression var lavt i nyfødte testiklerne, og gradvist forøget fra 1 til 3 uger gamle testikler, og derefter forblev konstant efter tre ugers alderen. Immunfluorescensfarvning på testis sektioner med musen PRAMEL1 antistof afslørede, at PRAMEL1 blev lokaliseret i cytoplasmaet i spermatocytter og akrosomal region runde, forlængede og aflange spermatider. Yderligere analyser af testiklerne squash forberedelse og spermatozoer på et subcelleniveau viste, at protein lokalisering mønstre af PRAMEL1 blev koordineret med morfologiske ændringer under akrosom dannelse i spermatider, og var signifikant forskellige i studs, midterstykke og hovedstol stykke af flagel mellem testikelkræft og epididymis spermatozoer. Kollektivt tyder vore resultater, at PRAMEL1 kan spille en rolle i acrosom biogenese og spermiemotilitet

Henvisning:. Mistry BV, Zhao Y, Chang T-C, Yasue H, Chiba M, Oatley J, et al. (2013) Differential Angivelse af PRAMEL1, en kræft /Testis Antigen, under Spermatogenese i mus. PLoS ONE 8 (4): e60611. doi: 10,1371 /journal.pone.0060611

Redaktør: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: 18. december 2012; Accepteret: 28 februar 2013; Udgivet: 2 April, 2013

Copyright: © 2013 Mistry et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af USDA-NIFA (bevilge nr. 2010-65205-20362) og opstart midler fra Pennsylvania State University til W-SL. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Spermatogenese er en kompleks biologisk proces, der involverer den mitotiske proliferation af spermatogonier, den meiotiske deling af spermatocytter, og den morfogene differentiering af spermatider til modne spermatozoer. Under sædcelledannelse, de runde spermatider undergå dramatiske morfologiske og cellulære ændringer, herunder dannelse af akrosom, forlængelse og kondensation af kernen, dannelse af flagel, og bortskaffelse af unødvendige cytoplasma, til frembringelse af højt specialiseret og polariseret spermatozoer [1], [2 ]. Den akrosom er en Golgi-afledt vesikel placeret ved den forreste region af sperm head [3]. Det spiller en væsentlig rolle i befrugtning af sit engagement i processen med sæd-ægget binding og trænge ind i ægget [4], [5]. De mammale hanner bærer mutationer, der påvirker acrosom biogenese er ufrugtbar eller subfertile [4] – [7]. Akrosom biogenese begynder på det sene pachytene spermatocyte fase af meiosen og fortsætter gennem den første halvdel af sædcelledannelse [4], [5], [8]. Indledningsvist proacrosomal vesikler dannet ud fra Golgi-apparatet og samles i perinukleære region, nær en af ​​polerne af kernen i pachytene spermatocytter. Efter afslutningen af ​​den meiotiske division, disse vesikler fusionerer med hinanden for at danne en enkelt stor akrosomal vesikel, der tillægger den nukleare kuvert runde spermatider og fortsætter med at udvide ved tilsætning af Golgi-afledt materiale [4], [8]. Under modning af forlængede spermatider, Golgi ophører at bidrage glycoproteiner til akrosom, og acrosom-kerne kompleks undergår omfattende morfologiske ændringer at opnå en form karakteristisk for sædceller de givne arter «[8].

flagel af en mammal sædcelle er en vigtig og meget organiseret mikrotubulus-baseret kompleks struktur, der giver motilitet kræves for sædcellerne at nå og befrugte et æg [9]. Strukturelt er delt op i fire hovedkomponenter: forbindelsesstykket, mellemstykket, det vigtigste stykke, og endestykket [10]. Montering af flagel starter i begyndelsen af ​​sædcelledannelse. Under flagellen biogenese, et par centrioler flytter til den modsatte side af det udviklende akrosom i perinukleære rum af runde sædcelleantal, hvor en af ​​de to centrioler danner en flagellar axoneme. Efterfølgende axoneme rager ud fra sædcelleantal, hvilket gav flagel [8]. Mere end 400 proteiner er blevet fundet i flagel, men kun en brøkdel af proteinerne er blevet karakteriseret på molekylært niveau og vist at fungere som strukturelle, metaboliske eller signalproteiner [11], [12].

cancer /testis-antigener (CTA’er) er en gruppe af proteiner, som er stærkt udtrykt i en lang række ondartede tumorer, men deres ekspression i normale væv er for det meste begrænset til testikel og ovarie kimceller [13] – [15]. På grund af deres karakteristiske ekspressionsmønster, der CTA’er anvendes som prognostiske markører for en række tumorer og betragtes også lovende mål for cancerimmunterapi [16] – [18]. Mindst 70 CTA gen familier, der involverer mere end 240 individuelle gener (eller isoformer) er blevet identificeret til dato [19]. Tidligere undersøgelser har antydet, at CTA’er, generelt have en rolle i både tumorigenese og gametogenese [14], [15], [20]. Men oplysninger om funktion og præcise cellulære lokalisering af CTA’er i kimceller og kræft væv er sparsom i forhold til data om deres udtryk og immunogenicitet [13], [15].

fortrinsvis udtrykkes antigen i melanom (PRAME) er et medlem af CTA’er, og blev oprindeligt identificeret som et tumorantigen udtrykt i melanomceller, udløser en autolog cellemedieret immunrespons cytotoksisk T [21].

PRAME

er en multi-kopi-gen, der repræsenterer en af ​​de mest forstærkede gen familier i eutherian pattedyr, med ~ 90 eksemplarer i musen, ~ 50 kopier i den menneskelige og ~ 30 eksemplarer i bovine genom [19] , [22], [23]. Interessant,

PRAME

er gennemført til og forstærkes på Y-kromosomet i bovid afstamning, hvilket tyder på en rolle i mandlig reproduktion [19]. Medlemmer af

PRAME

genfamilien indkode LRR (leucin-rige repeat) proteiner, der folder ind i en hestesko form i deres tertiære struktur. Den primære funktion af LRR proteiner er at tilvejebringe en alsidig strukturel ramme for dannelsen af ​​protein-protein-interaktioner i forskellige molekylær genkendelse processer, herunder signaltransduktion, celleadhæsion, transkriptionel regulering, RNA-bearbejdning, apoptose, immunrespons, og cellepolarisering [24 ] – [28]. Ekspression og funktion af PRAME er blevet grundigt undersøgt i en række cancerceller, og høj PRAME ekspression korrelerer med cancer progression [28] – [30]. I melanomceller, PRAME fungerer som en repressor af retinsyre (RA) signalering gennem interaktionen med RA (RAR’er) og rekruttering af Polycomb proteiner [27], [31]. Nylige undersøgelser har også foreslået, at PRAME fungerer som transskriptionsaktivator-. Costessi

et al.

(2011, 2012) rapporterede, at PRAME er en del af Cullin2 baserede E3 ubiquitinligase og er forpligtet til at rekruttere Cullin2 ubiquitinligase til EKC /KEOPS kompleks. Dette kompleks er forbundet med de aktive initiativtagere reguleret af

nuklear transkriptionsfaktor Y Hotel (

NFY

) [29], [32]. Vi hypotesen, at PRAME også spiller en rolle i spermatogenese. Som et første skridt til at teste vores hypotese og at dissekere den molekylære rolle PRAME gen familien i reproduktion, vi valgte at arbejde på musen

PRAME-lignende 1 Hotel (

Pramel1

) genet, en repræsentant for den

PRAME

gen familie, som er homolog til den menneskelige

PRAME,

og ligger på musen kromosom (MMU) 4. i dette arbejde, vi karakteriserede

Pramel1

gen med hensyn til dets mRNA og proteinekspression mønster og cellulære lokalisering under testis udvikling og spermatogenese.

Resultater Salg

tid og rum ekspressionsanalyse af musen

Pramel1

i testis

ekspressionsmønstret af muse

Pramel1

genet (acc. no. NM_031377) blev undersøgt i 11 væv af voksne mus ved RT-PCR. Til sammenligning, fem andre paraloger fra musen

PRAME

familie (X-linked

PRAME

,

Pramel3

, og

Pramel

, og MMU4- knyttet

Pramef8

og

Pramef12

) blev også analyseret (tabel 1). Resultaterne indikerede, at alle seks paraloger blev højt udtrykt i testis, med varierende ekspressionsniveauer i de andre væv (fig. 1).

Pramel1

og

PRAME

mRNA blev specifikt udtrykt i testiklerne, mens

Pramel

,

Pramel3

,

Pramef8

, og

Pramef12

mRNA’er blev hovedsageligt udtrykkes i testis med en lav ekspression i ovarie, lever, milt, nyre, hjerne, lunge, muskel og thymus (fig. 1a). For yderligere at undersøge tidsmæssige og rumlige udtryk for

Pramel1,

vi udførte et tidsforløb undersøgelse under testis udvikling. Vores RT-PCR resultater viser, at mens et lavere niveau

Pramel1

mRNA blev udtrykt i den nyfødte testis, blev påvist et højere konstant udtryk i 1-uge-til 8 uger gamle testikler (fig . 1b).

a. Rumlig udtryk analyse af seks

PRAME

paraloger blandt 11 forskellige væv af voksne mus.

PRAME

og

Pramel1

blev udtrykt specifikt i testiklerne, mens

Pramel, Pramel3, Pramef8

Pramef12

blev overvejende udtrykt i gametogenic væv med en lav ekspressionsniveau i lever, nyre, hjerne, tyndtarm, lunge, muskler og thymus. b. Temporal udtryk analyse af

Pramel1

under testis udvikling. Lav ekspression blev observeret i den nyfødte testis, mens konstant høj ekspression blev observeret i testiklerne fra 1- til 8 uger gamle mus.

ACTB

blev anvendt som en positiv kontrol. M: markør; Ov: æggestok; Te: testis; Li: lever; H: milt; Ki: nyre; Br: hjerne; Si: tyndtarmen; Ly: lymfekirtel; Lu: lunge; Mu: muskler; Th: thymus; -:. Negativ kontrol

For at afgøre, om PRAMEL1 proteinet udtrykkes i testis blev en western blot analyse udført på hele testis lysat fra modne mus ved hjælp af en PRAMEL1-specifikt antistof. Som vist i figur 2a, den PRAMEL1 antistof identificeret et specifikt bånd med en molekylvægt på ~ 57 kDa, som er den forudsagte molekylvægt for muse PRAMEL1 protein (acc. No. NP_113554). Desuden blev en meget mindre bånd (~ 42 kDa) observeret (fig. 2a). For at teste specificiteten af ​​antistoffet, udførte vi en præ-absorption kontrol med peptidet anvendt til at generere PRAMEL1 antistof, hvor der ikke blev påvist (fig. 2a), hvilket antyder, at antistoffet er PRAMEL1-specifik og mindre bånd kræver yderligere undersøgelser. En tidsforløb analyse af PRAMEL1 protein yderligere oplyst, at dets udtryk i testiklerne var aldersafhængig (fig. 2b). Proteinet ekspressionsniveauet var meget lav ved det nyfødte stadie (fig. 2b), i overensstemmelse med det lave niveau af transkription detekteret ved RT-PCR (fig. 1b). Ekspressionen blev øget gradvist fra 1- til 3 uger gamle testikler, og derefter forblev konstant efter tre ugers alderen (fig. 2b). Som en positiv kontrol blev en monoklonale β-actin (ACTB) antistof anvendes til at detektere ACTB, og en forventet protein på 42 kDa blev identificeret (fig. 2a, 2b).

a. Western blot analyse af PRAMEL1. Proteinekstrakter fra voksne mus testikel blev underkastet western blot-analyse under anvendelse af et muse PRAMEL1 antistof. En immun-reaktivt protein med en forventet molekylvægt på ~ 57 kDa blev detekteret i testis, og en meget mindre bånd på ~ 42 kDa blev også observeret. Som en positiv og ladningskontrol anvendtes et monoklonalt ACTB antistof, og blev observeret en forventet immun-reaktivt protein på 42 kDa. Som en negativ kontrol, udførte vi en præ-absorption kontrol af peptidet anvendt til at generere PRAMEL1 antistof, og ingen bånd blev detekteret. b. Tidsforløb analyse af PRAMEL1 proteinekspression under testis udvikling. Protein ekstrakter fra nyfødte (Nb), 1-uges (1W), 2-uger (2w), 3-ugers (3w), 4-uger (4w) og 8-uger (8W)-gamle testikler blev udsat for western blotting med musen PRAMEL1 antistof. Ekspressionsniveauet af PRAMEL1 blev gradvist forøget fra Nb til 3W og derefter forblev konstant efter 3-ugers alderen. Tal til venstre angiver molekylvægten af ​​standard proteiner.

Lokalisering af PRAMEL1 protein under spermatogenesen

Vi undersøgte den cellulære, rumlige og tidsmæssige udtryk for PRAMEL1 protein under kønsceller udvikling ved indirekte immunofluorescens-mikroskopi. I første omgang undersøgte vi PRAMEL1 protein lokalisering på tværsnit af testikler hos unge mus, fra nyfødte til 3-ugers alderen. Som vist i fig. 3, var der ingen specifik farvning mønster observeret for PRAMEL1 antistof hen over sektionen i 1 uger gamle testis (Fig. 3a, c), selvom svagt uspecifik baggrundsfarvning blev observeret for både PRAMEL1 antistof (fig. 3a, c) og præ-absorberet peptid kontrol (fig. 3d). Dette kan være en konsekvens af relativt lav ekspression af transkriptet og protein på dette stadium (fig. 1b og 2b). Sammenlignet med præ-absorberede peptid kontrol, hvor nogle ikke-specifik farvning blev observeret (fig. 3i), blev specifik farvning ses for PRAMEL1 antistof hovedsageligt i cytoplasmaet i spermatocytter i 2 uger gamle testis (Fig. 3f, h) . Når musene nåede 3 ugers alderen blev en meget unik og stærk farvning detekteres af PRAMEL1 antistof i perinukleære region runde spermatider (fig. 3k, m), hvor en hætte-lignende struktur på det nukleare overflade blev observeret (Fig . 3m).

Tværsnit fra 1-uges (a-e), 2-ugers (f-j) og 3-ugers (k-o)-gamle musetestiklerne blev farvet med musen PRAMEL1 antistof. Selv om der var nogen specifik signal observeret på tværs sædkanalerne i en uger gammel testis, specifik farvning (grøn) blev observeret i cytoplasma af spermatocytter (f, h) i 2 uger gamle testis og perinukleære region runde spermatider ( k, m) i 3 uger gamle testis. Paneler a, f, k er den PRAMEL1 antistoffarvning. Panel b, g og l er modfarvet med DAPI at visualisere cellekerner. Paneler c, h og m er flettede billeder til PRAMEL1 og DAPI farvning. Pilene peger på et område med beskrevne signaler. Paneler D, I og n er peptid-præabsorberet antistoffarvning som negativ kontrol. Paneler e, j og o er H .. Figur 5a, b). Især mønstret af PRAMEL1 lokalisering ændret i overensstemmelse med morfologiske ændringer, der forekommer i akrosom og kernen under sædcelledannelse (Fig 4a, e, i;.. Figur 5a-g). Når de runde spermatider begynder at aflang og flagel begynder at udvikle sig, blev tubb set ved den modsatte side af PRAMEL1 farvning i perinukleære region, markering af placeringen af ​​læbetætningsring udvikling og flagel-dannelse (figur 4e, i;.. Fig 5c- g). Med udviklingen af ​​sædcelleantal morfogenese, den PRAMEL1 protein farvning udvidet i løbet af ca. 1/3 af den nukleare overflade, efterligne akrosom udvikling (fig. 5a-g). Derfor er vores resultater viser tydeligt, at PRAMEL1 protein er forbundet med akrosom i spermatider. Som negative kontroller blev snit farvet enten med det primære antistof forhånd absorberet med det respektive peptid eller med kun det sekundære antistof. Ingen fluorescens signal blev påvist i kontrol sektioner, hvilket indikerer, at ikke-specifik farvning var minimal. (Fig 4m-p;.. Figur 5h)

Tværsnit fra voksne (≥ 2 måneder gammel) mus testikler var dobbelt-farvet med musen PRAMEL1 (grøn) og tuba (rød) antistoffer. Den PRAMEL1 farvning blev observeret i runde (a), forlængede (e) og langstrakte (i) spermatider under sædcelledannelse. Tuba farvning blev observeret i forlængede (f) og aflange (j) spermatider, men ikke i runde spermatider (b). Alle snit blev modfarvet med DAPI (Paneler c, g, k og o) at visualisere cellekerner. Paneler d, h, l og p er fusioneret billeder til PRAMEL1, TUBA og DAPI farvning. Pilene peger på et område med beskrevne signaler. De mellemværker i d, h, og jeg er forstørret billede til pilespids-mærket områder (se også fig. 5a, C, E og G). Paneler m og n er sekundært antistof styringer til FITC-mærket æsel-anti-gede-IgG og TRITC-mærket æsel-anti-mus IgG, hhv. Forstørrelse er × 400. Scale bar = 20 um.

testis sektioner (A, C, E og G) og squash præparater af sædkanaler (b, d, f og h) blev farvet med anti-PRAMEL1 (grøn) , anti-tubb (rød) og DAPI (blå). Flettede billeder for triple-farvning i runde spermatider (a og b), forlængede spermatider (c, d, e og f) og aflange spermatider (g) er vist. Den PRAMEL1 farvning blev observeret i akrosomal vesikel-regionen af ​​alle udviklingslande spermatider og Tubb farvning blev observeret i læbetætningsring af forlængede og aflange spermatider. Som et sekundært antistof kontrol testis squash forberedelse (h) blev farvet med FITC-mærket æsel-anti-gede-IgG og TRITC-mærket æsel-anti-mus IgG. Forstørrelse er × 1000. Scale bar = 10 um.

Lokalisering af PRAMEL1 i testikelkræft og epididymis spermatozoer

Vi yderligere undersøgt den subcellulære fordeling af PRAMEL1 i testikel /epididymal spermatozoer ved at udføre indirekte immunfluorescensfarvning, ved hjælp af PRAMEL1- og α-tubulin (TUBA) -specifikke antistoffer. Den spermatozoer blev indsamlet fra knust sædkanaler af modne testikler og caput, corpus og cauda regioner epididymis. Resultaterne viste, at i lighed med farvning i spermatider, er PRAMEL1 hovedsagelig lokaliseret til den forreste acrosom region af spermatozoer (Fig 6a, b, d, e,. Tabel 2). Som blev observeret forskellige farvningsmønstre mellem testikelkræft og epididymis spermatozoer, over 200 spermatozoer fra hver gruppe (tabel 2) blev undersøgt for at studere den detaljerede lokalisering af PRAMEL1 proteinet i sædceller. Vi fandt, at alle testikulær spermatozoer (100%) viste akrosomal lokalisering af PRAMEL1, mens kun 86,5% af epididymis spermatozoer var positive for PRAMEL1 i akrosomal region (tabel 2). Endvidere PRAMEL1 blev observeret på det primære stykke af flagel (41%) i testikulær spermatozoer (fig. 6a, tabel 2), hvorimod det blev observeret i forbindelsesstykket (96%) og midterstykke (87,9%) i epididymis spermatozoer (caput, corpus og cauda) (fig 6a, b, d, e,. tabel 2). PRAMEL1 farvning blev også set i cytoplasmatiske dråber af epididymal spermatozoer (fig. 6d). Vi fandt, at 55% af epididymis spermatozoer havde cytoplasmatiske dråber placeret ved den distale ende af midterstykket. Omkring 73% af dem cytoplasmatisk dråbe-bærende spermatozoer viste PRAMEL1 signal i den cytoplasmatiske dråbe (figur 6d;. Tabel 2). Vi observerede også, at procentdelen af ​​cytoplasmiske dråbe-bærende spermatozoer varierede blandt de tre mus undersøgt. For både testikulær og epididymis spermatozoer blev ingen PRAMEL1 farvning observeret i annulus region af flagel. TUBA blev lokaliseret i den forreste akrosomal region spermahoveder, og midterstykket og vigtigste stykke sperm flagel af epididymis spermatozoer (fig. 6a, b, d, og e). Intet signal blev observeret, når primære antistoffer blev udeladt under farvningen, hvilket antyder minimale ikke-specifik binding af fluorescens-mærkede sekundære antistoffer (fig. 6c, f).

Mus spermatozoer indsamlet fra squash præparater af sædkanaler (a , b og c) og epididymis (d, e og f) blev farvet med PRAMEL1 (grøn), tuba (rød) antistoffer og DAPI (blå). Den PRAMEL1 farvning blev observeret i acrosom region testikel- og epididymis spermatozoer (a, b, d og e). I testikelkræft spermatozoer (a) PRAMEL1 blev også påvist i det primære stykke af sperm flagel, hvorimod i epididymis spermatozoer (d og e) blev observeret PRAMEL1 farvning, overvejende forbindelsesstykke, midterstykke og cytoplasmatisk dråbe. Som et sekundært antistof kontrol testikel (c) og epididymis (f) spermatozoer blev farvet med FITC-mærket æsel-anti-gede-IgG og TRITC-mærket æsel-anti-mus IgG. Forstørrelse × 1000. Scale bar = 10 um.

Diskussion

Selvom PRAME er blevet grundigt undersøgt i tumorigenese og kræft biologi, og bliver brugt som biomarkør for kræftdiagnose og antigen specifik cancer immunterapi [28] – [32], [34], funktionen af ​​PRAME genfamilien i gametogenese og reproduktion er ikke blevet karakteriseret. I den foreliggende undersøgelse, kendetegnet vi mRNA og protein ekspression af muse

Pramel1

gen, et medlem af

PRAME

genfamilie, under testis udvikling og spermatogenese. Vores resultater klart angivet, at PRAMEL1 udtrykkes i cytoplasmaet af spermatocytter og akrosom og flagel af spermatider og spermatozoer, som giver det første indblik i den potentielle funktion af

PRAME

gen familie i spermatogenesen. For at forstå den biologiske rolle (r) i denne hele genet familien og forholdet mellem

Pramel1

andre familiemedlemmer, vi hentede udtryksmæssige data for i alt 10

PRAME

paraloger fra Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/geo) (tabel 3) [35] – [40]. Kombineret med RT-PCR-data fra dette arbejde, var vi i stand til at klynge disse paraloger i tre hovedgrupper baseret på deres rumlige og tidsmæssige udtryk profiler: gruppe I, udtrykt kun i mandlige gonadedosis og kønsceller (

PRAME

og

Pramel1

); gruppe II, kun udtrykkes i kvindelig gonadedosis og kønsceller (

Oog1-3

); og gruppe III, overvejende udtrykt i både mandlige og kvindelige gonader (

Pramel, Praeml3, Pramef8, Pramef12

og

Oog4

) (tabel 3). Kollektivt, de divergerende ekspressionsmønstre af

PRAME

paraloger under gametogenese i både mandlige og kvindelige indikerer, at forskellige medlemmer af

PRAME

gen familie kan være involveret i forskellige udviklingsstadier i gametogenese og embryogenese.

Det er blevet rapporteret i tidligere undersøgelser, at forskellige CTA’er er involveret i forskellige stadier af spermatogenesen. Nogle af dem er udelukkende udtryk i en etape, såsom SYCP1 (

synaptonemal kompleks protein 1

, også kendt som HOM-TES-14), som er begrænset til meiotisk profase af spermatocytter, og SP17 (

sperm protein 17

), som udtrykkes i den modne spermatozoer kun [41], [42]. Andre CTA’er såsom CTAG1 (

kræft /testis antigen 1

, også kendt som NY-ESO-1) og TRO (

trophinin

, også kendt som

magphinin

eller MAGE -D3), er udtrykt i flere stadier af spermatogenesen. CTAG1 udtrykkes i spermatogonier gennem pachytene spermatocytter [43], [44], mens TRO udtrykkes i næsten alle typer af kønsceller fra spermatogonier til modne spermatozoer [45]. I den foreliggende undersøgelse, viste vi, at ligesom

Tro

gen, musen

Pramel1

udtrykkes bredt i forskellige typer af kønsceller under spermatogenesen. Den PRAMEL1 protein blev først opdaget, men på et relativt lavt niveau, i de nyfødte testiklerne ved Western blotting, hvilket tyder på ekspression af PRAMEL1 i spermatogonier. Et gradvist øget niveau af PRAMEL1 blev påvist i testikler på 1-, 2-, 3-ugers alderen og vedligeholdes på det højere niveau i modne testikler. Denne stigning i proteinekspression falder sammen med stigningen i RNA-ekspression fra nyfødte til 1 uger gamle testikler, og kunne forklares ved en opregulering af genekspression, eller alternativt ved en stigning i antallet af kimceller, som der er dramatisk kim celleproliferation før den første bølge af spermatogenesen.

modsætning cancercellerne hvor PRAME protein blev lokaliseret i kernen blev musen PRAMEL1 først set i cytoplasmaet af spermatocytter i 2 uger gamle testikler i denne undersøgelse. En dominerende udtryk for PRAMEL1 protein blev derefter observeret i den forreste region (runde, forlængede og aflang) spermatider, koordinere med de morfologiske ændringer af akrosom, hvilket tyder på, at den

Pramel1

spiller en rolle i akrosom udvikling . Endvidere observerede vi, at PRAMEL1 differentielt blev fordelt langs forskellige dele af sperm flagel mellem testikelkræft og epididymis spermatozoer. Som sædcellerne gain motilitet under overgangen fra testis til den kaudale område af epididymis, kan differentialet lokalisering af PRAMEL1 langs forskellige dele af flagel under sperm overgang et tegn på, PRAMEL1 er involveret i sædmodning og motilitet (se diskussionen nedenfor ).

Tidligere undersøgelser i cancerceller viste, at PRAME fungerer enten som en transskription undertrykker af RA signalering [27], eller som transskriptionsaktivator- på promotorområder bundet af NFY [29], [32]. vores data tyder dog, at

Pramel1

kan ikke deltage i transskription regulering gennem RA- og NFY-medierede mekanismer, fordi (1) PRAMEL1 er lokaliseret til cytoplasmaet i kønsceller under spermatogenesen, og (2) vigtigst, transskription er lukket ned i midten af ​​sædcelledannelse [27], [29], [31] og spermatozoer er terminalt differentierede celler væsentlige blottet for transkriptionel og translationel aktivitet [46].

Det er værd at bemærke, at to LRR- indeholdende, testis-udtrykte proteiner er blevet impliceret i sædcelledannelse, nemlig LRRC67 (

leucin-rige repeat indeholdende 67

, også kendt som testis LRR eller TLRR) og PPP1R7 (

proteinphosphatase 1, regulerende (inhibitor) underenhed 7

, også kendt som Sds22) [47], [48]. Begge proteiner interagerer med en central fosfatase,

protein fosfatase 1 Hotel (PP1), der tjener som en hub gen i flere lovgivningsprocesser [46] – [48]. Den LRRC67 proteinet interagerer med PP1 at danne et kompleks involveret i cytoskeleton omlejring hos mandlige kimceller [49]. Den LRRC67 protein interagerer også med en kinesin-relaterede molekylære motor, KIFC1 (

kinesin familiemedlem C1

), til at transportere molekyler langs mikrotubuli i læbetætningsring [33], [50]. Tilsvarende har interaktionen af ​​PP1 og PPP1R7 også været impliceret i udviklingen af ​​sæd. Den dimerisering af PPP1R7 og PP1γ2 fører til et fald på fosfatase aktivitet PP1γ2 og efterfølgende inducerer motilitet caudale spermatozoer [51], [52]. På grund af lignende strukturelle og ekspressionsmønstre, forudser vi, at PRAMEL1 kan interagere med PP1γ2 at transportere molekyler langs mikrotubuli i sperm flagel. Det er endnu ikke fastslået, om PRAMEL1 udfører den tilsvarende funktion i akrosom dannelse og sperm motilitet.

Materialer og metoder

Dyr

C57BL /6J mus blev avlet i vores koloni på Pennsylvania State University mus facilitet, og i alt seks par af opdrættere blev sat op. Testikler blev fjernet fra mus ved 0 dag (nyfødte), 1 uge, 2 uger, 3 uger, 4 uger og 8 uger gamle. Mindst tre dyr (biologiske gentagelser) blev anvendt til hver alder. Testes, epididymis og andre væv fra voksne mandlige opdrættere og æggestokke fra de kvindelige opdrættere blev opsamlet efter yngleperioden. Alle dyreforsøg blev godkendt af Pennsylvania State University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

Udarbejdelse af testikel væv

For testis histologi, hele testikler blev dissekeret ud af voksne mus og fast ved inkubation natten over i Bouin-opløsning (Sigma-Adrich, St. Louis, MO) ved 4 ° C. Væv blev derefter vasket i 70% ethanol, dehydreret, og indlejret i paraffinblokke. De paraffinindlejrede væv blev snittet ved 4 um under anvendelse af en mikrotom og monteret på objektglas.

mast testesprøver blev fremstillet som tidligere [53] beskrevne. Kort fortalt blev voksne testikler udskåret og overført til et glas petriskål indeholdende iskold PBS (140 mM NaCl, 2,6 mM KCI, 6,4 mM Na

2HPO

4, og 1,4 mM KH

2PO

4, pH 7,4). Efter fjernelse af tunica albuginea blev sædkanaler overført til en ny petriskål indeholdende PBS. Brug af fine tænger blev tubuli forsigtigt trukket fra hinanden og et lille stykke af enkelt tubulus blev skåret. Stykket af sædkanalerne blev overført til en ny petriskål og 15-30 pi 0,1 M saccharoseopløsning fremstillet i PBS blev tilsat. Cellerne blev frigjort fra tubulus ved tweezing hinanden tubulus og re-suspendere det i saccharoseopløsningen ved pipettering op og ned.