PLoS ONE: Gener Påvirket af ikke-Muscle isoform af Myosin Light Chain kinase Impact Menneskelig Cancer Prognose

Abstrakte

Det multifunktionelle manglende muskel isoform af myosin let kæde kinase (nmMLCK) er afgørende for den hurtige dynamiske koordinering af involveret i kræft celledeling og migrering cytoskelettet. Vi identificerede 45 nmMLCK-påvirket gener ved bioinformatisk filtrering af genom-dækkende udtryk i vild type og nmMLCK knockout (KO) mus udsat for prækliniske modeller af murine akut inflammatorisk lungeskade, patologier, der er veletablerede at omfatte nmMLCK som en væsentlig deltager. For at bestemme, om disse nmMLCK-påvirket gener var relevante for menneskelige kræftformer, blev 45 mus gener matches til 38 forskellige menneskelige ortologer (M38 signatur) (GeneCards definition) og gennemgik Kaplan-Meier overlevelsesanalyse i uddannelse og validering årgange. Disse undersøgelser viste, at i uddannelse kohorter, den M38 signatur med succes identificeret kræftpatienter med dårlig samlet overlevelse i brystkræft (

0,001), tyktarmskræft (

0,001), gliom (

0,001), og lungekræft (

0,001). I validering kohorter, demonstrerede M38 signatur væsentligt reduceret samlet overlevelse for high-score patienter af brystkræft (

= 0,002), tyktarmskræft (

= 0,035), gliom (

= 0,023), og lungekræft (

= 0,023). Sammenhængen mellem M38 risikoscore og samlet overlevelse blev bekræftet af univariate Cox proportional hazard analyse af den samlede overlevelse i både uddannelse og validering årgange. Denne undersøgelse, der giver en ny prognostisk kræft gen signatur stammer fra en musemodel af nmMLCK-associeret lungebetændelse, støtter kraftigt nmMLCK-involveret veje i tumorvækst og progression i humane kræftformer og nmMLCK som en attraktiv kandidat molekylære mål i både inflammatoriske og neoplastiske processer .

Citation: Zhou T, Wang T, Garcia JGN (2014) Gener påvirket af Non-Muscle isoform af Myosin Light Chain kinase Impact Menneskelig Cancer Prognose. PLoS ONE 9 (4): e94325. doi: 10,1371 /journal.pone.0094325

Redaktør: Patrick A. Singleton, University of Chicago, Institut for Medicin, USA

Modtaget: Februar 11, 2014 Accepteret: 14. marts 2014 Udgivet: April 8, 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Tilskud HL91899 og HL58064 (JGNG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft celleproliferation og migration kræver en hurtig dynamisk regulering af cytoskelettet, som er kontrolleret af serier af cytoskeleton regulatoriske proteiner, hvori myosin let kæde-kinase (MLCK) er en kritisk deltager [1], [2]. Desuden endothelcelle paracellulær ekstravasation og diapedese af tumorceller er et vigtigt skridt for ondartet tumor metastaser og væsentligt påvirket aktiviteten af MLCK [3], [4]. Selv om der stadig undervurderet, MLCK begyndte at blive betragtet som en ny funktionel protein i kræft patogenese (initiering, proliferation, migration, og metastase) [5], [6], [7]. Dette er især tilfældet med den mere udbredte udtrykte ikke-muskel isoform (nmMLCK). Ikke-muskel myosin let kæde-kinase eller nmMLCK er centralt involveret i kørsel omlejring af cytoskelettet, som regulerer vaskulær endotel barrierefunktion, angiogenese, endotelcelle-apoptose, og leukocytisk diapedesis [8].

In vivo

undersøgelser impliceret nmMLCK som et attraktivt mål for forbedring af de negative virkninger af dysreguleret lunge betændelse, herunder ekstravasation af inflammatoriske leukocytter [9], [10], svarende til proceduren i kræftcellen metastaser til lungevæv [ ,,,0],11]. Deletion eller inaktivering af nmMLCK producerede større beskyttelse mod akut lungeskade (ALI) og ventilator-induceret lungeskade (VILI) og signifikant nedsat alveolært og vaskulær permeabilitet og lungebetændelse [9].

For nylig har vi beskrevet, at endotel inflammation er en vigtig mediator af tumorvækst og progression [12], der støttes af den kendsgerning, at en molekylær signatur reflekterende af endotel inflammatoriske genekspression er indikerer klinisk resultat i flere typer af human cancer [12]. Som nmMLCK spiller en central rolle i reguleringen af endotel cytoskelet og endotel inflammation, ville vi hypotesen, at nmMLCK-relaterede cellulær signalering deltage aktivt i tumorprogression og metastase, selv om lidt er kendt om effekten af nmMLCK på patogenesen af tumor og dens indflydelse på prognosen af menneskelige kræftformer.

i nærværende undersøgelse, vi gerne vil bruge nmMLCK-associeret gen netværk (nmMLCK-dereguleret gen sæt) for at etablere en ny metode til human cancer prognoser, ved hjælp af en computational biologi tilgang.

formålet med denne undersøgelse er dobbelt. Den første var at identificere de gener potentielt reguleret af nmMLCK. Den anden var at udvikle en prognostisk cancer gen signatur afledt af de nmMLCK-associerede gener. Ved anvendelse af en eksperimentel murin model for lungebeskadigelse induceret af mekanisk ventilation med øgede tidal volumener (den VILI model), vi kendetegnet de bedste differentielt udtrykte gener mellem VILI-udfordrede vildtype (WT) mus og nmMLCK knockout (KO) mus. De musegener medieret af nmMLCK ekspression blev identificeret. Vi matchede nmMLCK-medierede mus gener til deres menneskelige ortologer, som dannede grundlag for en multivariat molekylær indikator for den samlede overlevelse i flere humane kræftformer, herunder lungekræft, brystkræft, tyktarmskræft, og gliom. Denne molekylære signatur forventede resultat uafhængigt af, men samvirkende med, standard kliniske og patologiske prognostiske faktorer, herunder patientens alder, lymfeknudeinvolvering, tumorstørrelse, tumorklassificering, og så videre.

Materialer og metoder

Genekspression data

mikroarraydata af lunge-RNA fra WT kontrol, VILI-eksponerede WT, og VILI-eksponerede nmMLCK KO-mus blev opnået fra NCBI GEO database (GSE14525) [9]. Vi brugte dette datasæt til at filtrere de nmMLCK-medierede mus gener.

genekspression datasæt, der repræsenterer menneskelige kræftformer blev hentet fra offentligt tilgængelige arkiver. Disse datasæt blev valgt baseret på tilgængeligheden af kliniske overlevelsesdata og den store størrelse af prøver. For hver tumortype, blev uddannelse og validering kohorter konstrueret. Datasættet for brystkræft (n = 295) var tilgængelig fra https://bioinformatics.nki.nl/data.php (Holland Cancer Institute, Computational Cancer Biology data Repository) [13]. De brystkræftpatienter blev tilfældigt opdelt i to dele (1/2 til uddannelse og 1/2 til validering). For tyktarmskræft, vi hentet to datasæt fra en enkelt undersøgelse [14]. Et datasæt blev brugt som træning kohorte (n = 177, GSE17536) og den anden blev brugt til validering (n = 55; GSE17537). For gliom blev tydelige datasæt fra to forskellige undersøgelser opnået for uddannelse (n = 77; GSE4271) [15] og validering (n = 50; https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/ca?ncer/datasets. cgi) [16]. Endelig vi fået tre datasæt (n = 359) for lungekræft, der var til rådighed fra en enkelt undersøgelse [17]. To datasæt blev kombineret som uddannelse kohorte (n = 161) og den anden blev anvendt som validering kohorte (n = 178). De CEL-filer til undersøgelsen kan findes på https://caarraydb.nci.nih.gov/caarray/publicExperimentDetailAction.do?expId=1015945236141280.

Statistical analyse

SAM (Betydning Analyse af Microarrays) [18], implementeret i

SAMR

bibliotek R Statistisk pakke [19], blev brugt til at sammenligne log

2-transformerede gen ekspressionsniveauer mellem WT kontrol, VILI-eksponerede WT, og VILI-eksponerede nmMLCK KO-mus. Falsk opdagelse sats (FDR) blev kontrolleret ved hjælp af q-værdi metoden [20]. Transkripter med en fold-change større end 2 og FDR mindre end 10% blev anset for differentielt udtrykte. Vi søgte for enhver beriget Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) [21] fysiologiske veje blandt de differentierede gener i forhold til den endelige analyse indstillet med NIH /DAVID [22], [23]. Hierarkisk klyngedannelse via komplet kobling regel med euklidiske afstand metriske blev anvendt til at visualisere genekspression forskelle, ved hjælp af

gplots

bibliotek af R Statistisk pakke [19].

For hver kræft træning /validering datasæt, vi normaliseret genekspression niveau i omfanget af [-1, 1] af POE (sandsynligheden for udtryk) algoritme [24], [25] implementeret i

metaArray

bibliotek R Statistisk pakke [19]. Baseret på genekspression og kliniske outcome data fra træning datasæt, kan vi tildele en Wald statistik genereret af univariate Cox proportional-hazard regression til hvert gen som en vægt. En risiko score blev beregnet for hver patient ved hjælp af en lineær kombination af vægtet genekspression som nedenfor: Her

er risikoscore af patienten;

er antallet af differentielt udtrykte gener;

Jeg

betegner vægten af genet

jeg

;

Jeg

betegner ekspressionsniveauet af gen

jeg

; og

Jeg

jeg

er middelværdien og standardafvigelsen af genekspression værdier for gen

tværs af alle prøver, hhv. Patienterne blev derefter inddelt i høj score og lav score grupper med medianen af partituret risiko som tærskelværdien. En høj score indikerer en dårligt resultat. Vægten af hvert gen blev fastsat, baseret på uddannelsesmæssige grupper, og derefter testet i validerings- grupper [12]. Samlet overlevelse blev analyseret af Kaplan-Meier-metoden. Forskelle i overlevelse blev testet for statistisk signifikans ved log-rank test.

-værdier på mindre end 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.

overlevelse

bibliotek R Statistisk pakke [19] blev brugt til at foretage overlevelse analyse af risikoscore.

Resultater

nmMLCK-medierede musegener

på det specificerede signifikansniveauet (fold-change 2 og FDR 10%), blev der fundet 365 gener udtrykkes differentielt mellem VILI-eksponerede WT og nmMLCK KO-mus, hvoraf 117 gener opreguleret mens 248 gener var nedreguleret i nmMLCK KO mus (tabel S1). Adskillige veje var signifikant beriget blandt disse differentielt udtrykte gener (

0,05), såsom vaskulær glat muskulatur kontraktion, kemokin-signalvejen, calcium signalvejen, ErbB signalvejen, fokal adhæsion og så videre (figur 1A ).

(A) Beriget veje blandt de differentielt udtrykte gener mellem WT VILI-eksponerede og VILI-eksponerede nmMLCK KO mus. Den røde linje angiver cutoff betydning (

0,05). (B) Berigede veje blandt de 45 nmMLCK-medierede gener. Den røde linje angiver cutoff betydning (

0,05). (C) Heatmap udtryksform for WT kontrol, WT VILI-eksponerede, og VILI-eksponerede nmMLCK KO mus. Rød repræsenterer øget genekspression; Blå repræsenterer nedregulering.

For at bortfiltrere toppen gener potentielt forbundet med nmMLCK, vi sammenlignet også genekspression mellem WT kontrol og VILI-eksponerede WT mus. 981 gener fandtes at være differentielt udtrykte (fold-change 2 og FDR 10%) mellem disse to grupper (Tabel S2). Blandt disse gener, vi beholdt generne med modsat differentiel ekspression sammenligne Tabel S1 og S2. Med andre ord blev kun de gener med svækket VILI-medieret genekspression i nmMLCK KO-mus behandles her. Dette trin gav 53 musegener. Endelig er vi udelukket generne udtrykkes differentielt mellem WT kontrol og VILI-eksponerede nmMLCK KO-mus. I alt vi beholdt 45 musegener til yderligere undersøgelse. Pathway analyse viste en signifikant binding af dette gen indstillet til ErbB signalvejen, gliom, døgnrytmen (figur 1B), hvilket antyder, at nmMLCK signalering bidrager til udvikling og malignitet af tumorer. Expression Heatmap indikerer, at ekspressionen profilen af de 45 muse-gener blev udvundet ved omtrent normale niveauer af ekspression i nmMLCK KO mus udsat for VILI (figur 1C). Vi anså disse 45 mus gener som nmMLCK-medieret gen sæt (tabel 1).

Prognostisk molekylær signatur

nmMLCK er potentielt involveret i patogenesen af kræft [3], [4 ], [26]. For at bestemme om nmMLCK-medierede gener stammer fra nmMLCK KO musemodel var relevante for menneskelige kræftformer, vi matchede de 45 nmMLCK-medieret mus gener til 38 forskellige menneskelige ortologer (M38 signatur) i henhold til definitionen af GeneCards [27], [28] (tabel 2). Vi antager, at den M38 signatur ville være prædiktiv for tumor udfald hos kræftpatienter.

Vi konstruerede en risiko pointsystem, at kombineret genekspression af M38 med risiko for død i uddannelsen datasættet. Høj score patienter blev defineret som dem, der har en risiko score større end eller lig med gruppen median score. I uafhængige validering kohorter, testede vi evnen af risikoscore at stratificere patienterne i prognostiske grupper. Vi udførte Kaplan-Meier overlevelsesanalyse sammenligne high-score og lav score grupper og bestemt statistisk signifikans ved log-rank test. Som forventet, at M38 signaturen var i stand til at identificere patienter med dårlig samlet overlevelse i brystkræft (

0,001), tyktarmskræft (

0,001), gliom (

0,001), og lungekræft (

0,001) i de uddannelsesaktiviteter kohorter (Figur S1). I validering kohorter, Kaplan-Meier overlevelsesanalyse sammenligne patientgrupper viste en signifikant reduceret samlet overlevelse for high-score patienter af brystkræft (

= 0,002), tyktarmskræft (

= 0,035), gliom (

= 0,023), og lungekræft (

= 0,023) (figur 2). Sammenhængen mellem M38 risikoscore og samlet overlevelse blev også bekræftet af univariate Cox proportional hazard analyse af den samlede overlevelse i både træning og validering kohorter (tabel 3). I validering kohorter, high-score patienter havde en øget risiko for død på 3,10 gange i brystkræft, 2,96 gange i tyktarmskræft, 2,23 gange i gliom, og 1,60 gange i lungekræft.

Kaplan-Meier overlevelse kurverne for patientgrupper identificeret af M38 risikoscore. Røde kurver er for high-score patienter, mens blå kurver er for de lave score patienter. Høj score patienter defineres som materialer med et M38 risiko score større end eller lig med gruppen median score.

-værdier indikerer betydelige forskelle i den samlede overlevelse som målt ved log-rank test.

Uafhængighed af M38 fra andre clinicopathologic faktorer

Vi undersøgte udførelsen af M38 signatur i sammenligning med clinicopathologic variabler forbundet med prognosen hos humane cancere. En multivariat Cox-analyse af den samlede overlevelse viste, at M38 status forblev en betydelig kovariat i forhold til standard clinicopathologic faktorer i de fire typer af humane kræftformer, såsom patientens alder, lymfeknude status, tumorstørrelse, tumor klasse, og så videre (tabel 4). Vi næste stratificeret patienterne i henhold til de faktorer væsentlige på multivariate analyse.

For brystkræft, blev patienterne stratificeret efter alder, tumor klasse, og østrogen receptor (ER) status hhv. For patienter med alder 40 og ≥40, high-score dem havde en signifikant øget risiko for død af 6,36 gange (

0,001) og 2,80 gange (

= 0,001), hhv. For patienter med tumor kvalitet 2 og ≥2, high-score patienter havde en øget risiko for død af 2,63 gange (

= 0,410) og 2,65 gange (

0,001) henholdsvis. For patienter med negativ og positiv ER status, high-score patienter havde en signifikant øget risiko for død på 2,25 gange (

= 0,025) og 4,00 gange (

0,001), hhv.

For tyktarmskræft blev patienterne inddelt efter alder og klinisk fase hhv. For patienter med alder 60 og ≥60, high-score dem havde en signifikant øget risiko for død af 2,29 gange (

= 0,025) og 2,88 gange (

0,001) henholdsvis. For patienter med stadie 3og ≥3, high-score dem havde en signifikant øget risiko for død på 3,50 gange (

= 0,015) og 1,71 gange (

= 0,024), hhv.

Patienter med gliom blev grupperet efter alder. For patienter med alder 45 og ≥45, high-score dem havde en signifikant øget risiko for død af 3,46 gange (

= 0,004) og 2,00 gange (

= 0,045) henholdsvis.

lungekræftpatienter blev stratificeret efter alder, lymfeknude status, og tumorstørrelse hhv. For patienter med alder 65 og ≥65, high-score dem havde en signifikant øget risiko for død på 2,35 gange (

0,001) og 1,97 gange (

0,001) henholdsvis. For patienter med og uden lymfeknude involvering, high-score patienter havde en signifikant øget risiko for død på 1,62 gange (

= 0,012) og 1,73 gange (

= 0,014 ), henholdsvis. For patienter med tumor størrelse T3 og ≥T3, high-score patienter havde en øget risiko for død på 2,20 gange (

0,001) og 1,63 gange (

= 0,180) henholdsvis.

Kaplan-Meier overlevelsesanalyse også påvist en signifikant reduceret samlet overlevelse for high-score patienter i hver delmængde grupperet efter hver clinicopathologic faktor (Figur S2-S5). Tilsammen disse resultater tyder på, at ekspressionen af M38 signatur er forbundet med kliniske resultater og er en uafhængig prognostisk faktor.

Diskussion

Denne aktuelle undersøgelse bekræfter en intern forbindelse mellem nmMLCK-mægle signalering og klinisk cancer dødeligheden med nye beviser: først, vi definerede en gruppe nmMLCK-drevne gener med en musemodel af lunge inflammatorisk skade under hvilken virkningerne af nmMLCK forstærkes. Anden. Dette nmMLCK-centraliseret molekylær signatur afspejler lunge inflammatorisk genekspression er yderst prædiktive af dårlig klinisk resultat i fire typer af human cancer

MLCK (gen-kode:

MYLK

). Er en Ca

2 + /calmodulin-afhængig kinase, der phosphorylerer myosin lette kæder (MLC) at fremme myosin interaktion med cytoskelet actinfilamenter [29]. Det spiller en central rolle i cytoskeleton omlejring og kontraktile aktiviteter af både ikke-muskelvæv [30] og glat muskelvæv [31]. Den ikke-muskel isoform, nmMLCK, har vist sig at være en nøgleperson i det inflammatoriske respons baseret sin evne til at regulere vaskulær endotel integritet og leukocyt tilstrømning fra omsætning i lungerne broncoalveolar plads [9]. Svarende til patogenese i endotelceller i ALI, cancercelleproliferation og migration kræver en hurtig dynamisk regulering af cytoskelettet, som kontrolleres af en gruppe af cytoskeleton regulatoriske proteiner, hvori nmMLCK tjener som en kritisk og central deltager [1], [2] . Desuden er trans-cellulær ekstravasation, den afgørende skridt for malignt tumormetastase, velkontrolleret med aktiviteten af MLCK [3], [4]. Selv om der stadig undervurderet, MLCK begyndte at blive betragtet som en ny funktionel protein i kræft patogenese (initiering, proliferation, migration, og metastase) [5], [6], [7]. Dette er især tilfældet med den mere bredt udtrykt ikke-muskel isoform (nmMLCK).

Selv om lidt er kendt om de mekanismer nmMLCK i patogenesen af tumoren og dens indflydelse på prognosen af humane cancere, inflammatorisk respons, reguleret af nmMLCK i lungerne spiller en aktiv rolle i tumorogenesis og mange succesfulde behandlinger rettet mod kronisk inflammation direkte ændre endotel genekspression [32]. Murine VILI model forstærker nmMLCK-medieret genekspression og fungerer som en tilfredsstillende platform til at dissekere nmMLCK molekylær signatur i lunge inflammatorisk skade.

I forhold til en tidligere undersøgelse [12], vi brugte en ikke-konventionel betændelse markør nmMLCK (sammenlignet med TNFa), som er mere relateret til endotel inflammation, som nmMLCK er selektiv udtrykt i ikke-muskelvæv, såsom endotel [29]. Kombineret sammen, disse to undersøgelser yderligere at vurdere den centrale rolle, “endotel-specifikke” betændelse i kræft progression. Da nmMLCK også udtrykkes i andre vævstyper, herunder epitel og inflammatoriske leukocytter (samme som TNF), forstærkede molekylær underskrift nmMLCK ved lungebetændelse (M38 underskrift) kan også involvere andre typer væv i lungerne, dvs. epitel og infiltrerede neutrofiler. Potentielle bidrag M38 signatur i patogenese i disse væv til kræft prognosen kan også være vigtigt.

Vores næste undersøgelse vil fokusere på validering af disse kandidatgener filtreret ud i både nmMLCK og TNFa- undersøgelser og generere en mere nøjagtig kræft prognose platform med en raffineret gen sæt, hvilket vil føre til udvikling af kræftrisiko forudsigelse /prognose gen array i kliniske forsøg.

MYLK

er ikke i M38-gen listen, selv om 38 gener blev baseret på nmMLCK knockout-mus. Den mulige komplekse årsag kan være, at nmMLCK (210 Kd) er en isotype af

MYLK

gen-produkt, mens

MYLK

også producerer smMLCK (108 Kd), som består af 80% af

MYLK

genprodukter i lungerne. nmMLCK knockout ikke interfererer med smMLCK udtryk, men det microarray platformen skelner ikke nmMLCK fra smMLCK. Dette faktum driver vellykket filtrering af de 38 nmMLCK-medierede gener, men

MYLK

var ikke i stand til at overleve i M38 genet listen. For at løse effekten af

MYLK

i kræft overlevelse forudsigelse, vi re-analyseret vores datasæt med de 39 gener (M38 gener plus

MYLK

), men ingen indlysende forbedring blev fundet (tabel S3) . Ikke desto mindre er flere nylige undersøgelser viser, at nmMLCK udtryk faktisk ændres i humane kræftformer, såsom kolorektal cancer [33] og prostatakræft [34].

Vi brugte et pointsystem for at tildele et M38-baseret risikoscore til hver enkelt patient. Dette score-system kan også påføres direkte på andre offentliggjorte cancer gen signaturer. Sammenligningen mellem kræft gen signaturer kan simpelthen udføres ved at sammenligne den prognostiske effekt af de risikofaktorer snesevis af enkelte gen underskrifter. I denne undersøgelse, brugte vi medianen af M38 score at opdele patenterne i to dele (høj score og lav score patienter) at gøre kategoriseret analyser (såsom Kaplan-Meier analyse og log-rank test). Klinisk, kan vi bruge nul som en absolut cutoff at stratificere patienterne i høj-risiko og lav risiko grupper, fordi medianen af M38 score er omtrent lig med nul i hvert datasæt.

Denne undersøgelse giver den første prognostisk cancer gen signatur afledt af en murin model af nmMLCK-associeret lungebetændelse. Aktivering af nmMLCK-involverede veje bidrager til tumorvækst og progression i humane kræftformer. Disse resultater støtter den opfattelse, at nmMLCK er en attraktiv kandidat molekylære mål i lungesygdomme.

Støtte Information

Figur S1.

Anvendelse af M38 signatur til uddannelse datasæt, der repræsenterer fire menneskelige kræftformer. Kaplan-Meier overlevelse kurverne for patientgrupper identificeret af M38 risikoscore. Røde kurver er for high-score patienter, mens blå kurver er for de lave score patienter. Høj score patienter defineres som materialer med et M38 risiko score større end eller lig med gruppen median score.