PLoS ONE: Mutationer i EPHB6 receptortyrosinkinase Fremkald en Pro-Metastatisk Fænotype i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Ændringer af Eph receptortyrosinkinaser er hyppige begivenheder i menneskelige kræftformer. Genetiske variationer af EPHB6 er blevet beskrevet, men den funktionelle resultatet af disse ændringer er ukendt. Den aktuelle undersøgelse blev udført for at screene for forekomsten og til at identificere funktionelle konsekvenser af EPHB6 mutationer i ikke-småcellet lungekræft. Her har vi sekventeret hele den kodende region af EPHB6 i 80 ikke-småcellet lungekræft patienter og 3 tumorcellelinier. Tre potentielt relevante mutationer blev identificeret i primære patientprøver af NSCLC patienter (3,8%). To punktmutationer førte til ustabile proteiner. En i ramme deletionsmutation (del915-917) viste forbedret migration og accelereret sårheling

in vitro

. Desuden del915-917 mutation øgede metastatiske evne NSCLC celler i en

in vivo

musemodel. Vores resultater tyder på, at EPHB6 mutationer fremmer metastase i en undergruppe af patienter med ikke-småcellet lungekræft

Henvisning:. Bulk E, Yu J, Hascher A, Koschmieder S, Wiewrodt R, Krug U, et al. (2012) Mutationer af EPHB6 receptortyrosinkinase inducere en Pro-Metastatisk fænotype i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (12): e44591. doi: 10,1371 /journal.pone.0044591

Redaktør: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hongkong

Modtaget: 8. maj 2012; Accepteret: August 3, 2012; Udgivet: December 4, 2012 |

Copyright: © 2012 Bulk et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. NSCLC forskning i vores laboratorium er finansieret af Deutsche Krebshilfe og Wilhelm-Sander Stiftung. SOM. blev finansieret af DFG Schw 407 /9-3. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er en førende årsag til cancerrelateret død med de fleste tilfælde tilhører gruppen af ​​ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [1], [2]. Udvikling af fjernmetastaser er den største årsag til NSCLC relaterede dødsfald. Receptor (RTK’er) spiller en vigtig rolle i den metastatiske proces [3], [4]. En af de bedst kendte RTK associeret med en metastase fænotype, er den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) med sin familie ERBB2 /Her2, ErbB3 og ErbB4. RTK såsom EGFR familien er derfor attraktive mål for forbedrede molekylære terapi tilgange i kræft [3], [5]. Til dato Ephrin (EPH) receptor-underfamilien er den største underfamilien af ​​RTK’er bestående af 16 medlemmer i hvirveldyr, nemlig EPHA receptorer 1-10 (EPHA1-A10) og EphB-receptorer 1-6 (EPHB1-B6) [6], [ ,,,0],7]. EphB-receptorer interagerer med Ephrin familien af ​​ligander. Ved interaktion med deres Ephrin ligander, EPH-receptorer modulerer en række biologiske aktiviteter, herunder celle-celle interaktion og cellemigrering [8], [9]. Tab af kinasen-døde EPHB6 er associeret med fremskredne tumor stadier og kræft progression [10] – [16]. Adskillige publikationer rapporterer om høj EPHB6 udtryk være en gunstig prognostisk markør i neuroblastom [10] – [12]. Derudover blev mRNA-ekspression af EPHB6 faldt i metastatisk melanom og i invasiv brystcancer-cellelinier med metastatisk potentiale [14] – [16]. Funktionelt, EPHB6 undertrykker invasiv, vækstrate og kolonidannende effektivitet af dyrkede brystkræftceller [17] – [18]., Regulerer celleadhæsion og påvirker migration [19]

Tidligere identificerede vi flere humane RTK hvis ekspressionsniveau korreleret med udviklingen af ​​metastaser i den tidlige fase NSCLC [20]. Henviser høj mRNA-ekspression af flere RTK’er blev forbundet med en øget frekvens af metastase udvikling, høj mRNA ekspressionsniveauer af de to RTK’er EPHB6 og DKFZ1 viste en reduceret risiko for metastase [20]. For nylig har vi identificeret EPHB6 som en epigenetisk tavshed metastaser suppressor i NSCLC, og udtryk for EPHB6 forhindrede metastase dannelse i en xenograft metastase model [21].

Her har vi gennemgået EPHB6 variation ved DNA-sekventering, og karakteriserede funktionelle konsekvenser af EPHB6 mutationer

in vivo

in vitro

med hensyn til deres potentielle rolle i NSCLC metastaser.

A) funktionelle domæner af EPHB6 genet er vist i forhold til deres exoner og identificerede mutationer for EPHB6. Beskrivelsen af ​​mutationerne svarer til deres lokalisering på proteinsekvensen. Den mutationer R52C blev Q498H, og DPG915-917del identificeret i NSCLC patientprøver i aktuelle undersøgelse. B) elektroferogram af EPHB6-vildtype sekvens og deletionsmutanten for EPHB6. C) Ekspressionsniveauer af EPHB6-mutanter i transficerede celler. Bulk transfekterede celler var GFP sorteres og udvidet i udvælgelsen medier. Ekspressionsniveauer er vist for bulk kulturer med 90% GFP-ekspression. Forskelle udtryksformer analyse mellem protein niveauer og mRNA-niveauer er vist. Til kvantitativ realtids-PCR er vist den gennemsnitlige og standardafvigelsen for tre uafhængige forsøg. Den western blot viser et repræsentativt eksempel.

Materialer og metoder

Cell kultur

NSCLC cellelinjer er involveret i aktuelle undersøgelse er blevet beskrevet tidligere [21]. Kort fortalt blev A549 lungeadenocarcinom celler dyrket ved 37 ° C, høj fugtighed og 5% CO

2 i DMEM (Dulbeccos modificerede Eagles medium, Invitrogen, Carlsbad, CA). Mediet blev suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% streptomycin og penicillin. HTB56 og HTB58 lungeadenokarcinom celler blev dyrket ved 37 ° C, høj fugtighed og 5% CO

2 i MEM (Modified Eagles medium, Invitrogen, Carlsbad. CA). Mediet blev suppleret med 10% FCS, 1% streptomycin og penicillin, 1% glutamin, 1% natriumpyruvat og 1% ikke-essentielle amino- acid.Cell line identitet blev bekræftet ved STR-genotypebestemmelse.

patientprøver

Primære tumor prøver og tumor-fri lungevæv blev opnået på tidspunktet for første kirurgi fra 80 patienter med histologi-bevist NSCLC på et Universitetshospital i Tyskland. Prøver blev straks lynfrosset og opbevaret i flydende nitrogen. Tumorprøverne blev kontrolleret for den procentdel af tumorceller ved histologi, og kun tumorbiopsier med mindst 70% cancerceller blev anvendt til efterfølgende analyse. Tilsvarende blev cancer-fri kontrolprøver også bekræftet ved histologisk undersøgelse. Alle patienter forudsat skriftligt samtykke og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité ved universitetet i Münster.

A) Protein udtryk for stabilt transfekterede A549 cellelinjer, der udtrykker vildtype EPHB6 eller EPHB6 deletionsmutanten. Celler blev co-transficeret under anvendelse af en EGFP -pcDNA3.1

+ vektor til identifikation af udvalgte kloner. Multiple kloner blev samlet og yderligere valgt som bulk-kulturer. B) Transwell migration blev udført med tom vektor kontrol celler, EPHB6 mutant og EPHB6 vildtype celler. blev analyseret fem forskellige eksperimenter i tre eksemplarer. *: Signifikant (p 0,05) forskelle ved (ENTEN ANOVA eller t-test) Den angivne p-værdi mellem de tre forskellige cellelinier blev analyseret statistisk fra alle migrerede celler ved hjælp oneway ANOVA-test. Analysen af ​​parvise t-testresultater i en signifikant p-værdi for kontrolcellerne vs. EPHB6-wt celler (p 0,015) og mellem EPHB6-wt celler og EPHB6-mut celler (p 0,005) . C)

In vitro

sårheling ridse assay. Celler blev ridset af en 10 pi pipettespids. De scratch områder blev optaget over en period på 17 timer. Vist er gennemsnit af tre forskellige eksperimenter, beregnet som procent fra et indledende punkt for alle tre cellelinier. ANOVA-test (p 0,002) indikerede statistisk signifikante forskelle mellem de tre cellelinjer. D) Repræsentative billeder af scratch-analyser ved årets begyndelse og afslutning af forsøgene.

A) Antal af pulmonale metastaser i evaluerbare NOD /SCID-mus fire uger efter transplantation, hver med 3 × 10

5 stabilt transficerede A549-celler, der udtrykker EPHB6-wt (n = 9), EPHB6-del915-917 (n = 9) eller tom vektor kontrolceller (n = 2). Dots repræsenterer individuelle mus og vandrette linjer medianværdien af ​​metastaser. B) Billeder fra repræsentative hele lunger NOD /SCID-mus, transplanterede med A549 celler, der udtrykker EPHB6-vægt, EPHB6-del915-917 eller tom vektor kontrol. Lungemetastaser er markeret med sorte pile. C) Billeder fra lunge sektioner af NOD /SCID-mus, farvet med hæmatoxylin. Metastaser er markeret med sorte pile. Tre repræsentative eksempler er vist hver for mus transplanteret med A549 celler, der udtrykker EPHB6-wt eller EPHB6-del915-917.

A) proliferative aktivitet af tomme vektor kontrol, EPHB6 vildtype og mutant celler blev analyseret ved hjælp af en kolorimetrisk MTT-assay efter 72 timer. Data er vist som gennemsnitlig +/- standardafvigelse for tre uafhængige forsøg. Forskellene var statistisk ikke-signifikante (ANOVA). B) cellestørrelse på individuelle celler (n = 20) vokser på plastskåle blev analyseret ved live video mikroskopi og registreres. EPHB6 mutant celler viste en signifikant reduceret cellestørrelse i forhold til EPHB6 vildtype og kontrollere celler (p 0,05, t-test).

EPHB6 Sequencing

Genomisk DNA blev ekstraheret hjælp DNAzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Primere blev designet med Primer3 software (forhandler) at opformere polymerase-kæde-reaktion (PCR) -fragmenter dimensioneret mellem 400 og 800 bp og omfatter den komplette kodende region af EPHB6 genet (detaljer om PCR er tilvejebragt i supplerende materiale). Alle Alle fragmenter blev amplificeret ved PCR med Taq DNA Polymerase (totalt reaktionsvolumen 20 pi) suppleret med en hjemmelavet PCR enhancer som beskrevet [22]. Begge strenge blev sekventeret under anvendelse af PCR-primerne. Yderligere interne primere blev anvendt til PCR-produkter længere end 600 bp for at sikre dobbeltstrenget sekvensinformation for hele PCR-fragment. Sekventering blev udført på ABI3730xl automatiseret DNA sequencere med BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Den sekventeret kodende region af

EPHB6

blev sammenlignet med referencen sekvens (GenBank nr NM_004445).

mutagenese

kodende region af det humane EPHB6 cDNA (base 833-3853 NCBI Accession nr NM_004445) blev klonet ind i pcDNA4 til /myc /HISA ekspressionsvektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Mutationer i den kodende sekvens af EPHB6 blev indført med QuickChange XL stedorienteret mutagenese (Stratagene, La Jolla, CA, USA) under anvendelse af primere med sekvenserne: forward (5′- AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG), omvendt (5’CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT) og under anvendelse pcDNA4-EPHB6 vektor som template. Bagefter blev den korrekte sekvens verificeret ved sekventering. Primere til yderligere mutationer vil blive ydet efter anmodning.

Expression Konstruktioner og transfektion

Humane A549 celler cotransficeret hjælp af transfektion reagens Nanofectin (PAA, Østrig) i overensstemmelse med producentens protokol. Co-transfektion blev udført med enten pcDNA4 (tom vektor kontrol), vildtype EPHB6 ekspressionskonstruktion (pcDNA4-EPHB6-wt) eller EPHB6 mutant ekspressionskonstrukter, hver med en EGFP udtrykker vektorkonstruktion (pcDNA3.1-GFP, udtrykker forbedret grøn fluorescerende protein EGFP) til udvælgelse og identifikation af transficerede celler. Transficerede celler blev selekteret med 700 ug /ml G418 (Sigma, St. Louis, MO, USA) og 400 pg /ml Zeocin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Bulk kulturer var FACS sorteret for GFP-udtryk og udvidet. Foruden bulkkulturer, vi samles også multiple høj GFP udtrykkende kloner at opnå tilstrækkelige ekspressionsniveauer. Ekspression blev verificeret ved Western blotting og real-time RT-PCR.

RNA Isolation og Reverse Transcription

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Et samlet beløb på 1 ug RNA fra hver prøve blev revers-transskriberet under anvendelse af tilfældige primere og MMLV revers transkriptase ifølge fabrikantens protokol (Promega, Madison, Wisconsin, USA).

Gene Expression Analyser ved kvantitative Real- time RT-PCR

i kvantitativ real-time RT-PCR, cDNA blev amplificeret i en ABI Prism 7700-sekvens detektor (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). EPHB6 blev påvist med de følgende primere og probe: fremad (5′-TGGACTATCAGCTCCGCTACTATG), omvendt (5’GTGGCAGTGTTGGTCTCGC) og probe (5′-FAM CCAGGCAGAAGACGAATCCCACTCCTT-TAMRA). De relative mængder af genekspression blev beregnet ved hjælp af ekspressionen af ​​GAPDH som en intern standard

Western blot-analyse

Proteiner blev påvist ved anvendelse af følgende antistoffer:. Anti-human EPHB6 (1 ug /ml, Abnova Corporation, Neihu, Taipei, Taiwan, eller ABGENT, San Diego, CA, USA) og β-actin (40 ng /ml, Sigma, USA) som primære antistoffer, gede-anti-muse og gede-anti-kanin (begge fra Dianova, Hamburg, Tyskland) som sekundære antistoffer. Western blot-analyse blev udført som beskrevet [23].

Se Blå Plus2

protein markør (Invitrogen) blev anvendt som en størrelse indikator.

Boyden Chamber Assay

I alt 5 × 10

5 A549 celler ( i 100 pi DMEM med 5% FCS) blev podet i den øvre del af en Transwell® kammer (Transwell filterindsatse i 6,5 mm diameter med en porestørrelse på 5 um, Corning Inc., Corning, NY), som var 30 min præcoatede med 50 ug fibronektin. I den nederste del af kammeret 600 pi DMEM medium med 20% FCS (a serum gradient blev anvendt som kemoattraktant) blev tilsat, og assayet blev udført i 16 timer ved 37 ° C og 5% CO

2 før migrerede celler blev analyseret ved flowcytometri. Alle assays blev gentaget fire gange, og individuelt gennemført in triplo

In vitro Wound Healing -. Scratch Assay

A549-celler blev podet i en 25-ml vævskulturkolbe ved en densitet på 350.000 celler pr kolbe og blev dyrket over en periode på tre dage. Sammenflydende cellemonolag blev derpå ridset anvendelse af en 10 pi-pipettespids. Mediet blev udskiftet og sårhelingen blev registreret af live video mikroskopi. Billeder blev fanget i 10 × minutters intervaller i 17 timer under anvendelse af en ZEISS (lys) mikroskop Axiovert 40C, forbundet med et CCD videokamera (Hamamatsu). Billede overtagelse blev kontrolleret af Hipic 32 (High Performance Image Control System) eller Wasabi (Hamamatsu Imaging Software). Analysen af ​​sårheling blev udført under anvendelse af Java-baserede billedbehandling program ImageJ. Analyser blev udført uafhængigt for tre gange.

Analyse af Cell Size

A549 celler, der udtrykker EPHB6-vild type, EPHB6-mutant eller lav EPHB6 (kontrol /tom vektor transduceret) blev podet i celle kultur flasker, som blev belagt med en collagenmatrix. Cellerne fik lov at adhærere i fem timer og derefter overvåges under anvendelse af et ZEISS (lys) mikroskop Axiovert 40C, forbundet med et CCD videokamera (Hamamatsu). Billede overtagelse blev kontrolleret af Hipic 32 (High Performance Image Control System) eller Wasabi (Hamamatsu Imaging Software). Analysen af ​​cellestørrelse af enkeltceller blev udført som tidligere beskrevet [24], under anvendelse visualiseringssoftwaren Amira og Java-baserede billedbehandling program ImageJ. Softwaren analyserer parametre for cellulære funktioner fra enkelte celler, herunder fastlæggelse af cellen område (i um

2).

Metastase Eksperimenter in vivo

For alle mus eksperimenter, vi brugte 8 til 10 uger gamle NOD.CB17-Prkdc SCID /J (NOD /SCID) mus opnået fra Charles River. For at analysere metastase udvikling ved intravenøs tumorcelle injektion blev 22 NOD /SCID-mus bestrålet med en enkelt dosis på 3,5 Gy fra en cobalt-60 enhed 1 dag før transplantation. I alt 3 × 10

5 stabilt transficerede celler (opløst i 200 pi PBS) blev injiceret intravenøst ​​i halevenen. Fire uger efter transplantation blev musene aflivet, og udviklingen af ​​lunge metastase blev analyseret. I to tilfælde, mus døde inden for en uge efter transplantationen: en mus transplanteret med EPHB6-vægt, der udtrykker A549 celler og en mus transplanteret med EPHB6-mutant, der udtrykker A549 celler. Metastase udvikling blev vurderet ved at tælle individuelle metastatiske knuder. For histologiske analyser blev lungerne fikseret i 4% paraformaldehyd. I alle eksperimenter blev behandlingsgrupper randomiseret til at forhindre bur virkninger.

Statistical Analysis

Alle eksperimentelle data er vist som middelværdi plus standardafvigelse hvis ikke andet er angivet. Middelværdierne for tre grupper blev sammenlignet med OneWay ANOVA fra Rådata eller i tilfælde af to grupper af studerende t-test. En to-sidet p. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

EPHB6 Varianter i NSCLC

Alle exons af hele det kodende område af EPHB6 blev sekventeret ved Sanger baseret sekventering i en kohorte af NSCLC patienter. Blandt 80 NSCLC-patienter, blev tre (3,8%) tilfælde vist sig at have ikke-synonyme mutationer af EPHB6 (R52C, n = 1; Q498H, n = 1; og DPG915-917del, n = 1). Ingen EPHB6 mutationer blev identificeret i cellelinjer A549, HTB56 eller HTB58. En bioinformatik analyse ved SIFT og Polyphen indikerede punktmutationer R52C og Q498H som sandsynligvis skade (tabel 1). En database søgen efter seneste storskala sekventering indsats afslørede yderligere mutationer, som hidtil ikke er blevet yderligere undersøgt (fig. 1A).

EPHB6 mutationer blev identificeret i forskellige exons og funktionelle domæner af genet. Interessant nok blev sletningen del915-917 (fig. 1B), der ligger ved siden af ​​to mutationer (D915G og G914V) nyligt identificerede patienter med kolorektal cancer [25], [26]. Klyngen af ​​mutationer i denne region mellem tyrosinkinase katalytisk (Tyrkc) domæne og sterilt alpha motiv (SAM) tyder yderligere funktionel relevans. Denne mutation blev identificeret i en patient med lungeadenocarcinom. Mutationen var heterozygot og blev også påvist i tilsvarende normale lungevæv indikerer en kimcellelinje mutation. De andre mutationer blev udelukkende påvist i tumoren og ikke i matchede sundt væv inficating en somatisk mutation.

For funktionelle assays, EPHB6-vildtype og flere mutanter (R52C, Q498H, del915-917 og P728S mutationen beskrevet tidligere i ovariecancer [LIT]) blev stabilt cotransficeret med en EGFP-udtrykkende plasmider ind i NSCLC-cellelinje A549, der udtrykker meget lave niveauer af EPHB6. EGFP positive kloner blev plukket og ekspression blev udført ved Western blotting under anvendelse EPHB6 antistof på enkelte kloner og på bulk-kulturer (Fig. 2A). Trods vellykket transfektion med forøgede mRNA-niveauer, protein ekspression af de fleste af de EPHB6 mutanter steg ikke ud over niveauet fra tom vektor transficerede celler (Fig. 1C). Kun for del915-917 mutation, blev proteinekspression ved koncentrationer svarende til EPHB6 vildtype opnået (fig. 2A). På grund af den utilstrækkelige tilstrækkelig protein-ekspression af R52C og G498H mutanter og den tidligere beskrevne P728S mutant, vi funktionelt fokuseret på del915-917 mutation i NSCLC i efterfølgende eksperimenter.

Effekter af EPHB6 Mutationer om migration og Metastase af NSCLC celler

Som rapporteret, EPHB6 vildtype hæmmede migration af stabilt transficerede A549 celler i en transwell kammer (Boyden kammer) assay. I modsætning hertil celler transficeret med del915-917 mutant EPHB6 migrerede signifikant hurtigere i dette assay (fig. 2B). Derudover udførte vi scratch assays med gentagen video mikroskopi at følge ridse lukning over tid. Vildtype EPHB6 hæmmede

in vitro

sårheling sammenlignet med den tomme vektor, mens EPHB6 mutant celler lukket hullet meget hurtigere end vildtype (tre uafhængige forsøg, s 0,002, ANOVA; p 0,0004, t-test ) (fig. 2C, D). Det fremgik, at EPHB6 mutanten ikke bare hæmmer EPHB6 vildtype aktivitet, men fremskyndet lukning af såret i forhold til tomme vektor og vildtype. Efter otte timers vedhæftning, det åbne område af de EPHB6 mutant celler begynder at falde to gange (3%) hurtigere som det kunne blive anerkendt for de EPHB6 vildtype celler (1,6%). Selv kontrol- celler viste mindre acceleration af sårlukning (2%) på dette tidspunkt.

For at analysere

in vivo

effekter af EPHB6 mutationer på den metastatiske kapacitet NSCLC celler, vi udførte

in vivo

metastase analyser. NOD /SCID-mus blev injiceret intravenøst ​​med EPHB6-wt celler (n = 10), EPHB6-del915-917 celler (n = 10) og tomme vektor kontrolceller (n = 2). Fire uger efter transplantation blev musene aflivet og analyseret. Én mus i hver gruppe mus transplanteret med EPHB6-wt og EPHB6-mut udtrykkende celler døde inden for en uge efter transplantation. Mus injiceret med EPHB6 vildtype overudtrykker celler viste lavere antal lungemetastaser sammenlignet med mus injiceret med enten tomme vektor kontrol celler eller EPHB6-mutant celler (Fig. 3): en mus blev fundet uden metastase, 2 mus med hver 1 eller 3 metastase og en mus med hver 4, 5 eller 8 metastase. En mus transplanteret med EPHB6 vildtypeceller blev fundet med et stort antal lunge metastase. Interessant nok i alle mus injiceret med EPHB6 mutantceller lunge metastase var detekterbare (fig 3;. P = 0,011, t-test af data fra mus transplanteret med EPHB6-wt sammenlignet med EPHB6-mut celler). En

in vitro

proliferation assay efter 72 timer (fig. 4A) viste, at EPHB6 mutantceller ikke adskilte sig fra EPHB6 vildtype udtrykkende celler i form af proliferativ aktivitet. Lignende resultater blev opnået i proliferationsassays analyseret efter 48 timer (data ikke vist). Eksperimenterne snarere foreslået, at øget metastatisk aktivitet

in vivo

var forbundet med ændringen af ​​iboende vandrende egenskaber. EPHB6 vildtype receptor-ekspression ikke signifikant ændre formen af ​​celler (selvom variationen af ​​form størrelse øges), mens størrelsen af ​​EPHB6 mutant celler, der voksede på almindelige plast retter var signifikant formindsket (figur 4B; p. 0,05, t-test af data fra 20 celler af EPHB6-wt og EPHB6-mut udtrykkende celler). I overensstemmelse med disse resultater, at kemotaksi af EPHB6 celler på plast retter syntes at blive reduceret, sandsynligvis på grund af en mindre god friktion egenskaber. Men forskellene var statistisk ikke signifikant (data ikke vist)

Diskussion

Ephrin -. Eph-receptor interaktioner er ofte dereguleret i kræft (reference). I aktuelle undersøgelse identificerede vi mutationer af EPHB6 som en pro-metastatisk funktion i ikke-småcellet lungekræft. En mutation, del915-917, var også til stede i matchet normalt væv, hvilket kraftigt antyder en kimcellelinje ændring. Germline ændringer er tidligere blevet beskrevet for EPHB6 i familiær kolorektal cancer Til dato de funktionelle konsekvenser af disse genetiske ændringer på et cellulært niveau er ukendte [25].

Ændringer i Eph-receptorer forekommer hyppigt i lungekræft. En stor skala sekventering undersøgelse viste mutationer i 10 ud af 13 Eph-receptor gener i lunge adenocarcinom [27]. På grund af den mangfoldighed af Eph-receptor associeret signaleringshændelser og komplekse netværk med receptorer, den funktionelle resultat af Eph-receptor aberrationer fortsat uklare [28]. For de fleste af Eph receptor ændringer identificeret til dato har funktionelle konsekvenser ikke blevet undersøgt.

Flere somatiske mutationer af EPHB6 gen tidligere er blevet identificeret i lungekræft [27], kolorektal cancer [25], [26 ], ovariecancer [29] og gliom [26].

i denne undersøgelse, screening af 80 NSCLC patientprøver og 3 NSCLC cellelinjer identificeret 3 hidtil ukendte mutationer for EPHB6 genet. En af dette mutationer, del915-917, bosat i domænet mellem tyrosinkinasen og sterile alpha motiv (SAM) domæne, hvor 2 somatiske mutationer blev for nylig identificeret i kolorektal cancer [25], [26]. Funktionen af ​​dette domæne er foreslået at være relateret til kræft, og vores resultater i dette arbejde gøre støtte dette forslag.

in vivo

eksperimenter viser tydeligt, at ekspressionen af ​​det muterede EPHB6 forbedret metastaser. Desuden EPHB6-mutant udtrykkende celler viste en tredobbelt forstærket transwell overgangen til en serum-gradient (kemotaxi). Disse resultater er i overensstemmelse med vores

in vivo

resultater. Mus transplanteret med EPHB6-mut celler udviklede signifikant (p = 0,011) flere lungemetastaser mus transplanteret med EPHB6-wt celler. Udover de ændrede funktioner EPHB6 del (915-917) mutant, et par aspekter kan også foreslå en gevinst på funktion. For eksempel er de mønstre af sårheling afveg mellem EPHB6 wildytpe og mutant. Det er muligt, at der findes signaling forskelle mellem vildtype og mutant receptor. På den anden side kan det også være interessant at spekulere i, at den mutante receptor kan virke dominant negativ retning af andre inhibitoriske EPH receptorer. Denne dominerende negative aktivitet kan føre til observation af potentielle gevinst på funktion potens. Det er klart, kan fremtidige undersøgelser afsløre de underliggende forskelle i signalering og påvirkning fra andet medlem af EPH og EPH-receptor-netværk. Fremtidige undersøgelser kan også afsløre de funktionelle virkninger af ikke-del915-917 mutationer. Det er sandsynligt, at disse også inaktivere EPHB6 men dette skal bekræftes i fremtiden.

For nylig kunne vi vise, at EPHB6 ofte bragt til tavshed af epigenetiske mekanismer i lungekræft [21], og andre kunne vise det samme inaktivering mekanisme i brystcancer [14]. Vores undersøgelser viste også, at tab af EPHB6 inducerer en yderst metastatisk fænotype. I tråd, EPHB6 er receptortyrosinkinase, for hvilken lav ekspression blev tættest beslægtet med dårlig prognose i tidligt stadium non-småcellet lungecancer [20]. EPHB6 kan spille en vigtig rolle i lungekræft metastase da det ofte er epigenetisk tavs og /eller muteret i en signifikant del af patienterne. Dette gør det muligt, at EPHB6 er en relevant modifikator af metastatisk kapacitet i lungekræft.

Taget sammen mutationer i EPHB6 forekommer i ikke-småcellet lungekræft kan føre til en pro-metastatisk fænotype. Tab af EPHB6 funktion ved nedsat udtryk eller mutations inaktivering kan derfor bidrage til lungekræft metastaser.

Tak

Vi er taknemmelige for Dr. Jianping Wu (University of Montreal, Quebec, Canada) for at give EPHB6 cDNA.