PLoS ONE: Analyse af Epiteliale og mesenchymale Markers i kræft i æggestokkene afslører Fænotypisk heterogenitet og plasticitet

Abstrakt

I vores undersøgelser af æggestokkene kræftceller vi har identificeret subpopulationer af celler, der er i en forbigående E /M hybrid fase, dvs. celler, der samtidig udtrykker epitel og mesenkymale markører. E /M-celler er ikke homogen, men,

in vitro

in vivo

, indeholder delmængder, der kan skelnes på grundlag af en række fænotypiske funktioner, herunder den subcellulære lokalisering af E-cadherin, og ekspressionsniveauerne af Tie2, CD133, og CD44. En cellulær delmængde (E /M-MP) (membran E-cadherin

lav /cytoplasmatisk E-cadherin

høj /CD133

høj, CD44

høj, Tie2

lav) er stærkt beriget for tumor-dannende celler og viser træk, som er generelt forbundet med cancer stamceller. Vore data antyder, at E /M-MP-celler er i stand til at differentiere til forskellige afstamninger under visse betingelser, og har kapacitet til selvfornyelse, dvs. at opretholde en delmængde af udifferentieret E /M-MP-celler under differentiering. Trans-differentiering af E /M-MP celler i mesenkymale eller epitelceller er forbundet med et tab af stamcellemarkører og tumorigenicitet.

In vivo

xenograft tumorvækst er drevet af E /M-MP celler, som giver anledning til epitel æggestokkene cancerceller. I modsætning hertil

in vitro

, fandt vi, at E /M-MP-celler differentierer til mesenkymale celler, i en proces, der involverer pathways associeret med en epitel-til-mesenchymal overgang. Vi har detekteret også fænotypisk plasticitet, der var afhængig af eksterne faktorer såsom stress skabt af sult eller kontakt med enten epitel eller mesenkymale celler i co-kulturer. Vores undersøgelse giver en bedre forståelse af den fænotypiske kompleksitet kræft i æggestokkene og har konsekvenser for kræft i æggestokkene terapi

Henvisning:. Strauss R, Li Z-Y, Liu Y, Beyer I, Persson J, Sova P, et al. (2011) Analyse af Epiteliale og mesenchymale Markers i kræft i æggestokkene afslører Fænotypisk heterogenitet og plasticitet. PLoS ONE 6 (1): e16186. doi: 10,1371 /journal.pone.0016186

Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: August 27, 2010; Accepteret: December 13, 2010; Udgivet: 14 Jan 2011

Copyright: © 2011 Strauss et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af NIH tilskud R01 CA080192, R01 HLA078836, og Stillehavet æggestokkene Cancer Research Consortium /Specialized Program for Forskning Excellence i kræft i æggestokkene Grant P50 CA83636. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det er blevet foreslået, at tumor genvækst, samt kemoterapi modstand og metastase, er afhængige af en lille subpopulation af cancerceller i tumoren, der menes at repræsentere cancerstamceller (CSCS). En definition kendetegnende for stamceller, i både normale og maligne væv, er evnen til at forny sig selv, men samtidig give anledning til datterceller, der er forpligtet til differentiering i fænotyper, der ofte krydser slægter. For at opnå dette, kan stamceller undergå en asymmetrisk celledeling hvorved de segregere celle fate determinanter i kun én af de to datterceller [1]. Hos voksne pattedyr, stamceller er blevet karakteriseret for en række væv, herunder blod systemet, centralnervesystemet, muskler, colon, bryst og ben /brusk.

I cancer stamceller i faste tumorer, meget kan læres fra studier af bloddannende stamceller (HSC), for hvilke det er blevet vist, at transplantation af en enkelt celle i en myeloablated modtager kan rekonstruere hele blod systemet. Denne endelige HSC giver anledning til et hierarki af pluripotente stamceller, der bliver gradvis begrænses i deres differentiering potentiale. Leukæmi menes at stamme enten fra HSC’er der erhvervede genetiske eller epigenetiske ændringer og blev delvist differentieret og tumorigen eller fra stamfædre, der har erhvervet evnen til at forny sig selv [2]. Eksistensen af ​​stamceller til visse typer leukæmi er stærkt understøttet af lentiviral tagging af humane akut myeloid leukæmi celler og observation af de enkelte kloner til stede i NOD-SCID mus efter seriel transplantation af de mærkede celler [3]. Undersøgelser af leukæmi stamceller angivet også stor fænotypisk plasticitet afhængigt af den fase af tumorvækst, tumor mikromiljø, og eksterne faktorer såsom stress skabt af radio-eller kemoterapi [2].

Tilstedeværelsen af ​​CSCS i solide tumorer er blevet foreslået til humane cancerformer, herunder bryst- [4], hjerne [5], colon [6], hoved og hals [7], pancreas [8], prostata [9], ovarie- [10], [11], [12 ], og hudkræft [13]. Solid tumor stamceller er blevet defineret som “en lille delmængde af cancerceller i en kræft, der udgør et reservoir af selvbærende celler med den eksklusive evne til selv at forny og til at forårsage de heterogene slægter af kræftceller, der omfatter tumor” [ ,,,0],14]. Adskillige celleoverflademarkører, herunder CD24, CD44, CD133, CD166, EpCAM, eller dye efflux assays er blevet anvendt til at sortere populationer af formodede cancer stamceller fra primær tumor kulturer eller cellesuspensioner opnået fra tumorbiopsier. Efter transplantation i immundefekte mus, tumorer dannes fra flere hundrede markør-positive celler, mens der for markør-negative celler er brug størrelsesordener højere tal for at opnå den samme frekvens tumordannelsesmekanisme (for en gennemgang: se [15] For nylig, bruger. en forbedret xenotransplantation teknik, et studie med humane melanomaceller viste tumordannelse efter podning af en tumor celle [16] og dermed et vigtigt skridt i retning af bevis for CSC eksistens blev lavet.

for de fleste karcinomer, progression mod malignitet er ledsaget af tab af epitheldifferentiering og et skift til en mesenchymal fænotype (EMT) [17]. EMT forværrer motilitet og invasivitet af mange celletyper og er ofte betragtes som en forudsætning for tumor infiltration og metastase. EMT er karakteriseret ved forøget ekspression af mesenchymale markører (vimentin, thrombospondin, N-cadherin, vitronectin), forøget ekspression af ekstracellulære matrix-forbindelser (kollagen IV og fibronektin), nedsat ekspression af epiteliale markører (E-cadherin, Occludin, desmoplakin, og Mucin1), ændret placering af transkriptionsfaktorer ( β-catenin, sneglen, Slug, Twist, Sox 10 og NFKB) og aktivering af kinaser (ERK1, ERK2, og PI3K /AKT) [17]. Der er også adskillige eksempler på avancerede carcinomer der viser, at mesenkymale celler kan genvinde karakteristika epitelceller, en proces kaldet mesenchymal til epitel overgang (MET) [18]. Tilsyneladende, epithelial fænotype af cancerceller og evnen til at danne fysiske barrierer udgør en mekanisme, der begrænser adgangen af ​​lægemidler, antistoffer eller immunceller til stederne for tumorer. Det er blevet spekuleret, at både EMT og MET involverer celler i en metastabil hybrid tilstand, for eksempel celler med træk fra begge epitel- og mesenchymale celler [19]. Salg

Vores undersøgelser har fokuseret på ovariecancer. Kræft i æggestokkene er den fjerde mest almindelige kræftform hos kvinder, og har den højeste dødelighed af alle kræfttilfælde i den kvindelige reproduktive system. Ca. 90% af menneskers ovariecancer udspringer af æggestokkene overflade epitel (OSE). Den mesodermalt afledt normale OSE viser epitel- og mesenchymal funktioner, kendetegnet ved ekspression af både keratin og vimentin [20]. Interessant, kun lave niveauer af E-cadherin er fremtrædende i OSE celler [21] og dens udtryk er begrænset til inklusion cyster og dybe kløfter, bemærkelsesværdigt til områder, hvor tidligt maligne begivenheder menes at forekomme [22]. Integriteten af ​​OSE lag primært vedligeholdes af N-cadherin, hvilket yderligere understreger epitel /mesenkymale fænotype i dette væv [23], [24]. Det menes, at OSE celler tilpasse sig ændringer i den cellulære mikromiljø ved overgange mellem epitel og mesenkymale stadier [20]. Sådanne evner er normalt begrænset til umodne, regenerere eller neoplastisk epitel og dermed gør en unik fænotypisk plasticitet. Det menes, at denne plasticitet ligger til grund for kræft i æggestokkene. Især ovariecarcinomer viser en unik funktion i forhold til andre epitelceller afledt cancere. Mens sidstnævnte er karakteriseret ved tab af epitel egenskaber under tumorprogression, observeres forhøjet ekspression af E-cadherin for primær neoplastisk æggestokkene epitel [25]. Imidlertid forekommer dette indledende ændring i retning af en mere differentieret fænotype tidligt i tumorudvikling derefter at blive efterfulgt af en generhvervelse af mesenchymale træk i mere avancerede ovarietumorer, der involverer en sekundær tab af E-cadherin [26], [27], [28] . Interessant er det epitel /mesenkym fænotype tydelig i OSE celler [29] også fundet i den invasive foran kolon [30] og brystkræft [31], og er i normal epidermal væv under sårheling [32].

i denne undersøgelse, giver vi støtte data for et af de vigtigste elementer i CSC, ved at demonstrere pluripotens, dvs. evnen til at give anledning til fænotypisk heterogene datterceller. Vores data tyder på, at i æggestokkene cancerceller disse funktioner er uløseligt forbundet med fænomener EMT og MET.

Resultater

Primære ovariecancer kulturer indeholder formodede CSCS

Vi har etableret 51 kræft i æggestokkene kulturer fra biopsier /ascites af klasse III og IV carcinomer (tabel S1). Efter fordøjelse af tumor biopsier med collagenase og trypsin, cellesuspensioner dyrkedes i brystepitelceller Basal Medium suppleret med EGF, insulin, hydrocortison, ekstrakt fra bovin hypofyse (MEGM) og 1-2% FBS i op til 5 dage. For at bekræfte deres tumorigene potentiale og fjerne fibroblaster og leukocytter, blev primære celler injiceret i brystfedtpuden af ​​immundefekte SCID-beige (C.B-Igh-1b /GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7) mus. Ni primære kulturer dannede xenotransplantattumorer efter transplantation af 1 × 10

6 celler (se tabel S1). Xenotransplantater blev derefter udskåret, fordøjet med proteaser og dyrket i MEGM med 10% FBS. For én kultur, var sekundære og tertiære xenografting udført. Profiler og suspensioner af originale biopsier blev navngivet OVC-biopsi, ovc805-biopsi, etc; primære kulturer afledt af patientens biopsier blev navngivet ovc316-PC, ovc805-PC, osv sektioner eller tumor suspensioner fra xenotransplantattumorer afledt af primære kulturer blev navngivet ovc316-X, ovc805-X osv; kulturer afledt af xenotransplantater blev benævnt ovc316-XC, ovc805-XC, etc. Salg

Kulturer indeholdt forskellige celletyper, klart forskellige delmængder udtrykker forskellige kræft markører (f.eks CA-125 eller CEA), der var minder om den heterogenitet af tumorceller set fra analyse af sektioner af den oprindelige tumor eller tumor xenograft (figur 1A, venstre tre paneler). Især tumorcelle heterogenitet var mindre markant i etablerede æggestokkene cancercellelinier såsom SKOV3-IP1 (figur 1A, højre panel).

A) tumorbiopsier og primære kulturer farvet positive for ovariecancer markører CA-125 ( grøn) og CEA (rød) og viser højere heterogenitet end den etablerede cellelinie SKOV3-IP1. Vist er ovc316-biospy, ovc316-PC, og ovc316-X. Analyse af ovc1208-biopsi, ovc1208-PC, ovc0117-biopsi, ovc0117-PC, ovc100506-biopsi, og ovc100506-PC afslørede samme heterogenitet. B) Let mikroskopi af kræft i æggestokkene kultur ovc316-XC. Kulturen indeholder to forskellige populationer med hensyn til trypsin følsomhed. Venstre panel: en tidlig passage kultur ubehandlet (til venstre), efter 10 min trypsinbehandling (i midten), og efter trypsin-sensitive celler blev fjernet (til højre). Højre panel: Tumor dannelse efter transplantation af trypsin-resistent (TR) og trypsin-sensitive (TS) celler i SCID-beige-mus. Tumordannelse bedømtes 3 måneder efter inokulering. TIC TR: 1/185, TIC TS: 1/109. Chi-square = 0,0524. C) Immunofluorescensanalyse for en human-specifik mitokondrie (Mx) markering, kræft markør CEA, epitel markør E-cadherin, og mesenchymale markør laminin i klonale kulturer afledt fra ovc316-XC. Klonale kulturer indeholder humane cancerceller med enten epitelial (øvre panel), mesenchymale (i midten) eller begge fænotyper (E /M hybrid klon, lavere). D) Tumor-dannende evner efter transplantation af 10

5 E, M, eller E /M-celler i SCID-beige-mus. Tumordannelse bedømtes 4 måneder efter podning. E) xenotransplantattumorer afledt af E /M hybridkloner. Den humane oprindelse af tumorceller er vist ved farvning for en human specifik mitokondrier markør (grøn). Farvning for epitelialantigenet AE1 /3 og tumorantigenet CEA afslører fænotypisk heterogenitet i tumorer, der er afledt af klonal E /M-kulturer. Laminin-udtryk er stort set begrænset til vaskulariserede regioner. F) H 6) i to fraktioner baseret på trypsin modstand, og afprøvet deres tumorigenicitet i SCID-beige-mus, men ingen forskel i tumor dannelse evne blev observeret (figur 1B, højre panel)

som gjort tidligere i en tidligere undersøgelse, der analyserede den cellulære resistens over for onkolytiske adenovirus [33], vi etableret 100 klonale cellekulturer afledt fra tidlig passage ovc316-XC celler. Kloner blev ekspanderet og analyseret for human-specifikke og kræft markører (for at udelukke tilstedeværelsen af ​​muse stromaceller) samt epitel- og mesenchymale markører (figur 1C). I alt 20% af de resulterende kulturer blev begrænset til en epitelial fænotype (E-cadherin positive; “epitel klon”), hvorimod 19% var mesenkymale (laminin positiv, “mesenkymale klon”). De resterende 61% af klonale kulturer indeholdt både epitel- og mesenchymale celler, der ud over celler, som var positive for både epitel- og mesenchymale markører (figur 1C). Vi kaldte disse celler epitelial /mesenkymale (E /M) hybride celler. Klonale epitel og mesenkymale kulturer havde begrænset langsigtet proliferativ potentiale (20-25 passager mesenkymale, 20-40 passager epitel kulturer henholdsvis). Især under passage, celler i en af ​​de 20 epitel kloner mistede membran E-cadherin og claudin 7 og erhvervet mesenkymale transskription variant af p120 catenin [33], hvilket indikerer, at det undergik en EMT (Figur S1).

Det er vigtigt, kun kulturer indeholdende E /M-celler var i stand til at danne tumorer i SCID-beige-mus inden for 4 måneder, når 10

5-celler (passage 6) injiceret (figur 1 D). Tumorer viste fænotypiske heterogenitet, indeholdt tumor stroma og blev vaskulariseret (Fig 1E). Samlet, histologi af tumorer afledt fra transplanterede klonal E /M-celler var den samme som af patienten tumor (figur 1F). Serial transplantation af celler afledt fra disse tumorer gav også anledning til nye tumorer (data ikke vist). Betydeligt, denne undersøgelse viser, at en enkelt celle kan danne en klon, der efterfølgende er i stand til at danne en heterogen tumor. Dette indikerer, at den oprindelige celle var en potentiel cancer stamcelle, med evnen til at differentiere, forny sig selv, og danne en tumor. Taget sammen viser disse data, at primære ovariecancer kulturer er fænotypisk heterogen, og at tumor-initierende celler synes at have træk af mesenchymale og epitel (E /M) -celler.

celler ved periferien af ​​trypsin-resistent delmængder indeholder epitel-mesenkymale hybrid (E /M) celler, der co-pletten med stamcelle markører

Efter at have fundet en potentiel sammenhæng mellem tumorigen cancer stamceller celle-lignende og epitel /mesenkymale træk på klonede kulturer fra ovc316-XC, vi udførte immunofluorescens-analyser af de primære kræft i æggestokkene kulturer (afledt fra biopsier eller xenografter) med en række epitel- og mesenchymale markører (figur 2). Vi fokuserede vores analyse på celler, der var isoleret fra xenotransplantater og havde netop (passage 0/1) eller nylig (passager 6-10) tilpasset vævskultur, og indeholdt store andele af trypsin-resistente delmængder. Disse delmængder farvet positive for epitel markører E-cadherin, claudin7 og EpCAM på laterale cellemembraner (figur 2A, B). Celler, der omgiver epiteliale delmængder var negative for disse markører på deres laterale membraner og farvet for mesenchymale proteiner vimentin og laminin. Yderligere analyse for E-cadherin afslørede fænotypisk mangfoldighed inden ovc316-XC kulturer. blev observeret to typer celler, der lokaliserede E-cadherin til deres membraner, membran E-cadherin

høj og membran E-cadherin

lav (figur 2A, nederste panel, indsætte # 2 og 3 #). En tredje type celler tilstødende til membran E-cadherin

høje celler indeholdt klart påviselig E-cadherin i cytoplasmaet /kernen (figur 2A, nedre panel, indsætte # 2). Cytoplasmatisk E-cadherin

høje celler farvet også positive for mesenkymale cellemarkører, såsom laminin samt caldesmon-1 (a myeloid markør), den endotheliale /endoteliale progenitor markører CD31 og VCAM-1 (figur S2A). E-cadherin

høj E /M-celler udtrykte også høje niveauer af det angiopoietin receptor Tie2 (fig S2A, højre paneler). Især Tie2 er en markør for hæmatopoietiske stamceller, der også findes på en række epiteltumorer [34], [35].

A) Analyse af E-cadherin (grøn) og laminin (rød) i ovariecancer kulturer. Forstørrelse af markerede områder er vist nederst: A1) E-cadherin

negative celler udtrykker laminin. A2) Epiteliale /mesenchymal (E /M) hybridceller: E-cadherin

lave celler udviser hovedsagelig cytoplasmatisk lokalisering af E-cadherin og høj ekspression af laminin. E-cadherin

høje celler indeholder forhøjede membran E-cadherin niveauer og lavere mængder af laminin. A3) E-cadherin

positive celler har en øget cellestørrelse og fastholde lavere niveauer af klart membran-lokaliserede E-cadherin end E-cadherin

høje celler. Laminin udtryk er næsten fraværende i E-cadherin

positive celler (øverste højre panel). B) Analyse for yderligere epitelial (grøn) og mesenkymale (rød) markører bekræfter eksistensen af ​​E /M-hybrid celler i ovc316-XC kulturer. Epiteliale markør

høje celler er i tæt nærhed til mesenkymale markør

høje celler og plet dobbelt positiv i områder, der indeholder kugler. I venstre og midterste panel, opmærksom på, at alle celler er positive for vimentin og CD44. C) CD133 markerer områder, der indeholder E-cadherin

høje og E-cadherin

lave celler. D) E-cadherin

høj og E-cadherin

lave celler viser stærk co-mærkning med EMT-induktorer Snail, Twist, og NGAL. Skalaen bar er 40 um. Vist er billeder fra ovc316-XC. Immunofluorescens analyse af ovc0117-PC, ovc0122-PC, ovc100506-XC, og ovc100728-XC afslørede lignende resultater.

Kulturer ved passage 0/1 viste generelt højere samlet udtryk for epitel og mesenkymale markører end kulturer i passager 6-10 og dannede 3 dimensionelle celle konglomerater /kugler indeholder E /M hybride celler i stærkt proliferative områder (Figur 2B). E /M hybrid fase af celler (inden kugler) blev bekræftet ved dobbelt farvning med andre epiteliale markører (EpCAM, claudin7) og mesenchymale markører (N-cadherin, vimentin). Endvidere kugler farvet for EpCAM og mesenkymale stamcelle markør CD44. Især fleste celler farvet for EpCAM, CD44, og vimentin (figur 2B), hvilket antyder at EpCAM /CD44 signaler undervurdere den fænotypiske mangfoldighed i tidlig passage ovariecancerceller. Den bedste diskrimination mellem forskellige undergrupper blev opnået med E-cadherin i kombination med en mesenchymal markør eller CD44. Efterfølgende brugte vi denne markør kombination for at karakterisere de fleste af de efterfølgende eksperimenter. Når analyseret for E-cadherin og den formodede kræft stamceller markør CD133, to subfraktioner af CD133 positive celler blive synlige CD133

+ /E-cadherin

høj og CD133

+ /E-cadherin

lave celler (Figur 2C). Denne observation støtter yderligere rollen som E-cadherin som en potentiel diskriminerende markør for kræft celle delmængder. Celler i E /M-celle population (især E-cadherin

lave celler), udtrykte også andre markører, der er karakteristiske for stamceller, herunder Nanog, 4. okt og Sox2 (figur S2B). E /M celler, især celler i kugler, var også meget positivt for EMT induktorer Snail, Twist og NGAL (figur 2D). Endvidere har vi også fundet, at celler, der var lav i membran-claudin 7 overvejende lokalisere beta-catenin til cytoplasmaet /nucleus (Fig S2C). Overgang af beta-catenin fra cellemembranen til kernen er en tidlig begivenhed i EMT

Samlet set immunofluorescens undersøgelser viser, at der findes to CD133

+ fraktioner.; i) membran E-cadherin

høj og ii) cytoplasmatisk E-cadherin

høj /membran E-cadherin

lave celler. Cytoplasmatisk E-cadherin

høj /membran E-cadherin

lave celler bærer træk af andre cellelinier, og derfor, mest sandsynligt, repræsenterer primitive stamceller eller stamceller.

Skift af fænotype, EMT og differentiering

in vitro

: flowcytometri undersøgelser

for at kvantificere antallet af celler med epitel og mesenkymale fænotyper i dyrkede celler, vi ansat flowcytometri og begyndte ved at overvåge celler for epitelial markør EpCAM samt overvågning af vimentin eller CD44 mærkning celler med mesenkymale attributter. Endvidere at afgrænse fænotypiske forandringer overtid såsom initiering af EMT analyserede vi forskellige passager af ovc316-XC-celler (figur 3). Disse undersøgelser afslørede en række interessante observationer. i) I tumor cellesuspensioner, der var frisk isoleret fra xenotransplantater, at størstedelen af ​​cellerne enten E /M-celler (EpCAM

høj /vimentin

høj, EpCAM

høj /CD44

høj) eller E -celler (EpCAM

høj /vimentin

lav, EpCAM

høj /CD44

lav) imidlertid ved passage kunne detekteres 1 kun E /M-celler, hvilket indikerer, at størstedelen af ​​celler opnået fra xenografter, der tilpasser sig vævskultur er E /M (figur 3A). Dette indebærer, at selv ved tidlig passage, kulturer ikke i tilstrækkelig grad afspejler den cellulære sammensætning af tumoren

in situ

. Passage 1 indeholdt EpCAM

høje /CD44

høje /Vimentin

høje og EpCAM

høje /CD44

lave /Vimentin

lave celler. ii) Vigtigere under dyrkning af celler i MEGM indeholdende vækstfaktorer /FBS (se passager 1, 5, 7, 20), både EpCAM

høj /CD44

høj /vimentin

høj eller EpCAM

høje /CD44

lave /vimentin

lave typer celle forsvandt og blev erstattet af EpCAM

lave /CD44

høje /vimentin

høje celler. Dette viser, at E /M-celler differentierer til mesenkymale celler

in vitro

i en EMT-lignende måde. iii) De fleste af CD133

+ -celler er E /M hybridceller. Efter passage i kultur ovc316-XC celler hurtigt miste CD133 udtryk samtidig med tab af epitel funktioner.

A) Triple-farve flowcytometri analyse af xenograft /biopsi-suspensioner og dyrkede celler

in vitro

ved forskellige passager. Venstre panel: EpCAM /CD44 /CD133. Højre panel: EpCAM /vimentin /CD133. B) Passage 1 og 5-celler blev udsat for 14 dage vækstfaktor /FCS sult og derefter analyseret ved flowcytometri. Vist er data fra ovc316-X og ovc316-XC. Resultaterne blev bekræftet på cellesuspensioner fra biopsier og primære kulturer (ovc100506-biopsi, ovc100506-pc, ovc100728-biopsi, og 100914). C) Immunofluorescensanalyse af passagen 3 og 18 kulturer af ovc316-XC. Celler i tidlige passager (passage 3) har forhøjede niveauer af E-cadherin og laminin sammenlignet med passage 18. Celler størrelser er større og kugle-vækst i høje celledensiteter er markant reduceret i høje passager. Procentdel af side population (SP) positive celler er vist nedenfor. Skalaen bar er 40 um. D) Tumordannelse efter transplantation af ovc316-XC passage 3 og 18 celler i SCID-beige-mus (evalueret 4 måneder efter podning). TIC p3: 1/110, TIC p18: 1/744. Chi-square:. 0,245

Vi fandt også, at der for en række passager sult kan stall differentiering og tabet af epitelial fænotype, mens niveauer af CD133 falde en smule i løbet af denne proces (figur 3B). Samlet set fandt vi, at primære kræft i æggestokkene kulturer viser mere sfære dannelse, når de dyrkes uden vækstfaktorer (Figur S3).

have identificeret E-cadherin som markør stand til at differentiere cellulære delmængder, vi gentog flowcytometri analyser med E -cadherin (fig S3). Differentiering afspejlede sig også ved et fald i niveauet af E-cadherin og laminin efter passage. Ud fra følgende betragtninger lave passage kulturer indeholdt et stort antal kugler, E-cadherin

høje celler og store mængder af laminin, viste høj passage celler markant reduceret sfære vækst og lave niveauer af disse proteiner, mens cellestørrelse steget (figur 3C). Dette blev også bekræftet i flowcytometri studier af passagerne 1, 3 og 7 (figurerne S3A-C). Disse undersøgelser viser, at mesenkymale (E-cadherin

negative /lav) sub-fraktion stiger under passage og samtidig EMT. CD133

+ -celler var stærkt positive for CD44 (figur S3A). Vi analyserede også membran Tie2 i korrelation til E-cadherin (Figur S3B). Ved immunofluorescens-analyse, TIE2 celler har en epitelial fænotype og er lavere i CD44 end CD133

+ -celler. Især er en sammenhæng mellem E /M fænotype, CD133 /CD44-positivitet, og tumorgenicitet understøttes også af flowcytometri analyse af klonale kulturer (Figur S3C). Kun E /M-kloner indeholdt betydelige mængder CD133

+ celler med forhøjet udtryk for CD44 (og som vist tidligere, kun E /M-kloner dannede tumorer). Tabet af “stamcelle” funktioner under passage afspejles også ved reduktion af den del af siden befolkning (SP) celler fra 7,8 ± 0,5% ved passage 3) til 2,1 ± 0,3% ved passage 18 (figur 3C). SP cellefænotype er blevet associeret med cancer stamceller i tidligere undersøgelser af ovariecancer [36]. Endelig tabet af CD133

+ og E /M-celler korrelerede med en nedsat evne til at danne tumorer (Figur 3D).

Samlet set observerede vi en slående forskel på fænotyper mellem celler

in vivo

og

in vitro

. Celler, som er tilpasset vævskultur var CD133

+ E /M-celler. Efter passage E /M-celler differentierer til mesenkymale celler i en EMT lignende måde. Denne proces er ledsaget af en reduktion af tumorgenicitet.

Tilstedeværelse af E /M celle delmængder

in situ

Under hensyntagen til, at kræft i æggestokkene kulturer, især ved slutningen af ​​passager, kun dårligt afspejle fænotypen af ​​tumorer

in situ

, fokuserede vi vores immunofluorescens og flowcytometri analyser på de dele af tumorbiopsier eller xenotransplantater, eller cellesuspensioner opnået ved collagenase fordøjelse af tumorer (figur 4). Immunofluorescens analyser af snit fra xenotransplantater høstet i uge 10 efter tumorcelle transplantation (figur 4) eller dele af patientens biopsier (tabel S1, fig S4) viste at tumorer

in situ

har klynger af E /M-celler (EpCAM

+ /vimentin

+) såvel som klynger af epithelceller (E-cadherin

+ /vimentin

-) (figur 4A). I xenotransplantater blev reder af E /M og epitelceller omgivet af lag af laminin. Vi observerede også costaining af E-cadherin og Tie2 (figur 4B). CD133

høje celler (blå) er Tie2

lav og E-cadherin

lav (figur 4B, nederste panel). En interessant mønster blev observeret ved dobbelt farvning med E-cadherin og CD133 som CD133-positive celler blev fundet ved tumoren periferi, i områder med aktiv tumorvækst (Figur S5A). Navnlig ikke alle CD133

+ -celler var E /M-celler. Inden CD133

+ celler, fandt vi to delmængder af E /M-celler som beskrevet tidligere for de in vitro-undersøgelser (figur 4C, større forstørrelse i figur S5B). Interessant CD133

høj /membran E-cadherin

lav delmængde

in situ

viste tilstedeværelsen af ​​E-cadherin inden cytoplasmatiske vesikler mere tilsyneladende end

in vitro

. De opnåede ved hjælp xenotransplantattumorer resultater var repræsentative for farvning af tumor sektioner fra ni forskellige patienter (tabel S1, figur S4).

A) Eksistensen af ​​E /M hybride celler

in situ

. E-cadherin

+ /vimentin

+ celler er til stede biopsier og tumorxenoplantater. Vist er billeder af ovc316-biopsi og ovc316-X. Lignende farvning blev fundet for ovc100506-biopsi /ovc100506-X, ovc100728-biopsi /ovc100728-X, og ovc100914-biopsi /ovc100914-X. B) Korrelation af E-cadherin (grøn) og Tie2 (rød) positivitet i kræft i æggestokkene biopsier. CD133

høje celler (blå) er Tie2

lav og E-cadherin

mellemprodukt. Vist er billeder af ovc316-biopsi og ovc316-X. Lignende farvning blev fundet for ovc100506-biopsi /ovc100506-X, ovc100728-biopsi /ovc100728-X, og ovc100914-biopsi /ovc100914-X. C) CD133

høje celler har lave niveauer af membran E-cadherin. E-cadherin

høje celler viser punctated membran CD133-farvning. Vist er billeder af ovc316-biopsi og ovc316-X. Lignende farvning blev fundet for ovc100506-biopsi /ovc100506-X, ovc100728-biopsi /ovc100728-X, og ovc100914-biopsi /ovc100914-X. Skalaen bar er 40 um. D-F) Triple-farve flowcytometrianalyse af ovc316-X til epiteliale markører (x-akse), mesenchymale funktioner (y-akse), og for cancer stamcellemarkør CD133 (histogram plots). D) Xenografter indeholder epitelceller, epitel /mesenkym (E /M) hybride celler og celler, der er negative for alle markører. CD133

+ celler er næsten udelukkende i en E /M hybrid fase baseret på EpCAM /CD44-analyse. CD133

høje celler er EpCAM

høj, CD44

høj og vimentin

lav. E) Udskiftning af EpCAM med E-cadherin afslører højere mangfoldighed i xenografter. CD44

høje celler er E-cadherin

lav /mellemprodukt. CD133

+ -celler er opdelt i to klare sub-fraktioner. Fraktion 1: E-cadherin

lav /mellemliggende /CD44

høj og fraktion 2: E-cadherin

høj /CD44

mellemprodukt.