PLoS ONE: Udførelse af Survivin mRNA som biomarkør for blærekræft i den fremadrettede undersøgelse UroScreen

Abstrakt

Baggrund

Urinary biomarkører har potentiale til at forbedre tidlig påvisning af blærekræft. De fleste af de forskellige kendte markører er imidlertid kun blevet vurderet i forsøg med tværsnit design. For korrekt validering en langsgående design ville være at foretrække. Vi brugte den prospektive undersøgelse UroScreen til evaluering survivin, en potentiel biomarkør, der har flere funktioner i carcinogenese.

Metoder /Results

Survivin blev analyseret i 5.716 urinprøver fra 1540 kemiske arbejdstagere tidligere udsat for aromatiske aminer. Arbejderne deltog i et overvågningsprogram med årlige undersøgelser mellem 2003 og 2010. RNA blev ekstraheret fra urin celler og survivin blev bestemt ved Real-Time PCR. Under undersøgelsen blev påvist 19 blæretumorer. Multivariate generaliseret estimering ligning (GEE) modeller viste, at β-actin, der repræsenterer RNA udbytte og kvalitet, havde den stærkeste indflydelse på survivin positivitet. Inflammation, hæmaturi og rygning ikke forvirre resultaterne. Survivin havde en sensitivitet på 21,1% for alle og 36,4% for høj kvalitet tumorer. Specificitet var 97,5%, den positive prædiktive værdi (PPV) 9,5%, og den negative prædiktive værdi (NPV) 99,0%.

Konklusioner

I denne prospektive og hidtil største undersøgelse om survivin, markøren viste en god NPV og specificitet, men en lav PPV og følsomhed. Dette skyldes dels det lave antal sager, der begrænser gyldigheden af ​​resultaterne. Compliance, urin kvalitet, problemer med analysen, og mRNA stabilitet påvirket udførelsen af ​​survivin. Imidlertid kunne de fleste problemer løses med en mere pålidelig analyse i fremtiden. Et vigtigt resultat er, at survivin ikke var påvirket af konfoundere som betændelse og udviste et relativt lavt antal falsk positive. På trods af den lave følsomhed, survivin kan stadig betragtes som en del af en multimarkør panel

Henvisning:. Johnen G, Gawrych K, Bontrup H, Pesch B, Taeger D, Banek S, et al. (2012) Udførelse af Survivin mRNA som biomarkør for blærekræft i den fremadrettede undersøgelse UroScreen. PLoS ONE 7 (4): e35363. doi: 10,1371 /journal.pone.0035363

Redaktør: Olga Y. Gorlova, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Januar 4, 2012; Accepteret: 14. marts 2012; Udgivet 16. april, 2012 |

Copyright: © 2012 Johnen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. FUJIREBIO Diagnostics , Inc. (FDI, Malvern, PA, https://www.fdi.com) har givet survivin reagenser uden omkostninger. En del af undersøgelsen blev støttet af en bevilling (FB093 til AS) i den tyske sociale ulykkesforsikring (DGUV, Sankt Augustin, Tyskland, https://www.dguv.de), af Abbott Laboratories (Abbott Park, IL; http: //www.abbottmolecular.com) der har leveret UroVysion kits, og Matritech /Alere GmbH (Köln, Tyskland, https://www.alere.com), som leverede NMP22 ELISA kits. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: Forfatteren GL er en ansat i Currentâ GmbH Co. OHG. FE og MN er medarbejdere i BASF SE. Som modtaget gratis assay kits fra Abbott Laboratories og Matritech /Alere GmbH. AS også modtaget rejselegater fra Matritech /Alere. GJ modtaget gratis assay reagenser fra FUJIREBIO Diagnostics, Inc. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer. Forfatterne erklærer ingen andre konkurrerende interesser.

Introduktion

Blærekræft er en af ​​de førende kræftformer i USA og i Europa. I Tyskland, forekomsten er omkring 29.000 tilfælde om året [1]. På grund af den høje tumortilbagevenden tæt overvågning og gentagen brug af behandlinger er nødvendige. Som følge heraf, blærecancer er den dyreste kræftsygdom [2]. Tumorer i urinblæren kan skyldes erhvervsmæssig udsættelse for aromatiske aminer, men tobaksrygning anses for at være den stærkeste bidragsyder til udviklingen af ​​disse maligniteter [3].

Tilgængeligheden af ​​effektive behandlinger, adgang til målorgan via urinen, og den relativt gode samlede overlevelse gør blærekræft en kandidat til screeningsprogrammer i højrisiko populationer [4]. Desværre, cystoskopi, som er det nuværende guldstandarden til påvisning blærekræft, er en invasiv og temmelig smertefuld metode. I nogle lande kan høje omkostninger også spille en vigtig rolle [4]. Disse kendsgerninger er til hinder cystoskopi i at blive brugt i screening kohorter. I modsætning hertil urin tumormarkører er ikke-invasive redskaber til at spore blærekræft. Typiske markører er proteiner, RNA, DNA, metabolitter eller cellulære funktioner, som har den fordel, at de kan bestemmes i urinprøver [5], [6]. Af de mange kendte markører dog kun få er blevet testet i prospektive undersøgelser eller forsøg, og var en succes at blive godkendt af FDA. Derfor er det nødvendigt at bevise værdien af ​​disse markører for screening og kræft mere longitudinelle studier klinisk beslutningstagning [7].

Survivin er en forholdsvis lille protein på 16,4 kDa kodet af genet

BIRC5

[8], [9]. Dens tredimensionelle struktur blev løst, og foreslog en adapter eller docking funktion [10], [11]. Binding til en række andre makromolekyler er faktisk blevet påvist, og survivin opstod som et centralt knudepunkt i multiple mobilnetværk [9], [12] – [14]. Mens survivin tilhører inhibitor af apoptose (IAP) genfamilien sine funktioner ikke er begrænset til en regulerende rolle i apoptose. Andre funktioner er kontrol af celledeling og kromosom segregering, fremme af spredning, stress respons og angiogenese, og det spiller en rolle i metastase [9], [15] – [19]. Dysregulering af survivin vil derfor påvirke fire af de seks såkaldte kendetegnende for kræft “i modellen for tumorigenese beskrevet af Hanahan og Weinberg, hvilket tyder på en central funktion af survivin i carcinogenese og tumor progression [20].

de mange mekanistiske roller survivin afspejles også i den udbredte forekomst i alle faser af tumor udvikling, dog med præference til senere faser i flere kræftformer [21] – [25]. Survivin overudtrykkes i de fleste humane cancere, men sjældent påvises hos raske voksne væv [8], [26]. Det har derfor været foreslået som et potentielt tumormarkør og mål for terapi [8], [27]. På grund af det faktum, at ikke-indtrængende påvisning i urinprøver er muligt, kunne survivin specifik anvendelse til screening af urogenitale maligniteter. Flere undersøgelser, for det meste af tværsnit design og med et relativt begrænset antal tilfælde, har vist, at survivin er en lovende kandidat til yderligere validering i longitudinelle studier [28] – [34]. Shariat

et al.

Udført en større prospektiv undersøgelse på tilbagevendende blærekræft, der var baseret på immunhistokemisk farvning af tumor prøver. Heri survivin forbedret forudsigelse af tilbagefald og overlevelse i en undergruppe af patienter [21]

I den foreliggende undersøgelse, vi bestemt survivin i den kommende screening kohorte UroScreen [35] – [37]. Ved hjælp af en mRNA- baseret assay for at validere sin funktion som en tumor markør for tidlig påvisning af blærekræft.

Resultater

deltagerne i UroScreen kohorten var aktive eller pensionerede kemiske arbejdere med tidligere eksponering for aromatiske aminer som tidligere beskrevet [35] – [37]. De blev undersøgt mellem september 2003 og juni 2010. Urinprøver blev indsamlet for urin status, cytologi, bestemmelse af NMP22®, kromosomafvigelser (UroVysion ™), og – hvis der er tilstrækkelig materiale var til rådighed – til survivin [36], [37] . For survivin målinger kunne opnås 5,716 urinprøver fra 1.540 deltagere (tabel 1 og 2). Median alder af kohorten var 62 år (spændvidde 27-90 år). Af de 1.540 personer, 18 udviklede tumorer, herunder en person, der udviklet to tumorer i løbet af undersøgelsen resulterer i 19 tumorer i alt for undersøgelse af survivin. For yderligere to sager var til rådighed for survivin bestemmelse ikke egnet urinprøve. Af de 19 tumorer, tre var papillomer, elleve høj kvalitet, og fem lav kvalitet tumorer (tabel 3). Cytologi detekteret otte tumorer. Den survivin assay detekterede fire tumorer, som alle var af høj kvalitet. Tre af dem blev også opdaget af cytologi og andre markører; en blev opdaget af survivin og NMP22 kun (figur 1).

blev fundet i alt 19 tumorer i 18 tilfælde. Survivin, cytologi, NMP22, og UroVysion opdaget 13 af de tumorer. * For yderligere to tumorer (nummer 1 og 12) var tilgængelig ingen prøve for survivin bestemmelse. Vejviser

tumor markør survivin blev bestemt ved en mRNA-baseret assay, som var ikke kommercielt tilgængelige. I løbet af de syv år af dette langsgående studie, uforudsete hændelser vedrørende pålideligheden og tilgængeligheden af ​​assay komponenter (RNA isolation kit fra Qiagen og Invitek, survivin reagenser fra FDI og IPA) fik os til at ændre analysen design to gange, der fører til tre forskellige assay varianter (Qiagen /FDI, Invitek /FDI, Invitek /IPA). Vi standardiseret survivin kopiere numre og kunne påvise ved hjælp af en multivariat generaliseret estimering ligning (GEE) model, at assay varianter ikke forvirre testresultaterne når de gennemfører de standardiserede survivin kopi numre (tabel 4). Alle andre resultater blev derfor udledes af de standardiserede værdier.

Potentielle prædiktorer for et positivt survivin resultat blev udforsket som vist i tabel 4. Indikatorer på infektion og inflammation (leukocytter), hæmaturi, eller faktorer som alder, rygning, eller forrige blærecancer viste ikke en signifikant effekt på survivin niveauer. Den “koncentration” (vægtfylde) af urinprøven, afspejles i den urin kreatinin koncentration, tendens i retning af en omvendt korrelation med survivin, men denne indflydelse var ikke signifikant. Som forventet, blærekræft observeret under UroScreen var en prædiktor af positive survivin tests (OR 2,54, 95% CI 1,02-6,33). β-actin (OR 3,11, 95% CI 2,51-3,85) var en effekt modifikator, hvilket indikerer en stærk indflydelse af mængden og kvaliteten af ​​det genvundne mRNA på PCR ydeevne. En tifold stigning i kopi antal β-actin var forbundet med en tredobbelt større sandsynlighed for en positiv survivin test. Vi testede, om β-actin blev korreleret med urin tæthed ved at beregne Spearman rang korrelationskoefficient. Der var en signifikant, men kun svag sammenhæng af p-actin kopi numre med urin kreatinin som en proxy af urin densitet (r

s 0,17, 95% CI 0,12 til 0,23).

De kræft-prædiktiv værdier for survivin er anført i tabel 5. Beregninger var baseret på de opnåede testresultater i urinprøver fra den sidste screeningsrunde før diagnosen. Survivin nået en følsomhed på 21,1% for alle tumor enheder, 25,0% for alle tumorer, men uden papillomer, og 36,4% for kun høj kvalitet tumorer. Det gjorde ikke afsløre nogen af ​​de fem lav kvalitet tumorer. Specificiteten var 97,5% i alle (under) grupper (alle tumorer, tumorer uden papillomer, høj kvalitet og lav kvalitet tumorer). Den positive prædiktive værdi (PPV) nåede 9,5% i alle grupper, mens den negative prædiktive værdi (NPV) varierede mellem 99,0 og 99,7%.

Receiver Operating karakteristik (ROC) analyser blev udført med standardiserede survivin niveauer fra den sidste screening runde før diagnose og korrigeret for log

10 (β-actin) og alder i 10-årige klasser. De resulterede i arealet under kurven (AUC) værdierne af 0,74 (95% CI 0,61-0,86) for alle tumor enheder (figur 2), 0,75 (95% CI 0,60-0,89) for alle tumorer uden papillomer, 0,80 (95% CI 0,66 -0,94) for high-grade tumorer, og 0,66 (95% CI 0,36-0,96) for kun lav kvalitet tumorer. At dømme udførelsen af ​​assay varianter, vi beregnede korrigerede ROC kurver for hver variant. De resulterende AUC var 0,70 (95% CI 0,34-1,00) for Qiagen /FDI, 0,80 (95% CI 0,54-1,00) for Invitek /FDI, og 0,79 (95% CI 0,67-0,91) for analysen variant Invitek /IPA.

Analyse blev udført for alle tumorer enheder. Den resulterende areal under kurven (AUC) var 0,74 med en 95% CI (konfidensinterval) af 0,61-0,86.

Mulige årsager til negative testresultater i tilfælde udarbejdet i tabel 6. De sidste prøver af tilfældene 5 og 10 blev opnået 26 og 18 måneder før tumor diagnose hhv. Case 8 viste et positivt testresultat 14 måneder før diagnosen, men prøven kort før diagnosen var negativ. Alle andre falsk negative resultater var i tilfælde med papillomer og lav kvalitet tumorer; 31% var forbundet med en lav densitet af den opsamlede urin angivet med lav kreatinin ( 0,50 g /l), og yderligere 20% blev ligeledes forbundet med lav RNA integritet som angivet ved p-actin niveauer 2.500 eksemplarer. Til sammenligning blev 15% og 11% af alle sande-negative prøver i sidste screeningsrunde forbundet med lav kreatinin og lav β-actin, henholdsvis.

Diskussion

Mens talrige potentielle markører er blevet beskrevet for tidlig påvisning af blærekræft, ingen hidtil er blevet gennemført i kliniske retningslinjer for screening eller klinisk opfølgning på tilbagefald. Ideelt set bør markør-assays er egnede til klinisk praksis være robust og billig samt hurtig og i en let-at-bruge format, fx en point-of-care test [38]. Men før assayformatet kan optimeres, udførelsen af ​​markøren selv skal vurderes. For molekylære markører som survivin udviklingen af ​​stabile og enkle analyser kan være lovende, hvis deres præstationer med aktuelt tilgængelige analyser i screening blærekræft er blevet påvist at være sammenlignelig med eller bedre end godkendte prøver. I UroScreen, vi bestemt survivin med en relativt kompliceret assay hvor positive testresultater ikke blev fulgt op med cystoskopi. Samlet, survivin påvistes især i high-grade blærecancer og dens resultater var sammenlignelige med de andre testede markører. Men mRNA integritet var en vigtig modifier af positive testresultater, og derfor bør der udvikles et mere robust test.

For at bevise værdien af ​​nye markører for klinisk beslutningstagning, deres præstationer skal vurderes i længderetningen undersøgelser og kliniske forsøg [7]. UroScreen var et prospektivt kohorte studie med mere end 1.500 kemiske arbejdere havde til formål at vurdere NMP22, UroVysion, og survivin som tumormarkører [36], [37]. Det var den første prospektive undersøgelse, der undersøgte ydeevne survivin i tidlig påvisning af blærekræft. For 19 af de blæretumorer, der blev detekteret under udførelsen af ​​undersøgelsen tilstrækkelig prøvemateriale blev overladt til survivin bestemmelse. Den lave forekomst af blærecancer i UroScreen samt i den almindelige befolkning er et kritisk problem for screening blærecancer [4]. UroScreen blev etableret som en forlængelse af et allerede etableret overvågningsprogram i kemiske arbejdstagere [35]. De første el-beregninger baseret på tidligere data, der viser på det tidspunkt en højere tumorincidensen i undersøgelsen befolkningen [39]. I øjeblikket er forekomsten i denne originale højrisiko-kohorte nået et niveau tættere på den almindelige befolkning som følge af forbud mod kræftfremkaldende aromatiske aminer fra anvendelse i den kemiske industri årtier siden. Det er endvidere sandsynligt, at teknologiske fremskridt og foranstaltninger til forbedring arbejdssikkerheden bidraget til at sænke blærekræft forekomsten i denne kohorte af arbejdstagere fra to store kemiske virksomheder. Hertil kommer, at median alder af UroScreen kohorten i 2010 var 62 år, mens medianalderen for blærekræft for mænd i Tyskland var 72 år [1].

Det er vist før, at survivin udtryk er højere og hyppigere i high-grade tumorer eller senere stadier af kræft udvikling [21], [23] – [25]. I overensstemmelse med denne observation, har survivin ikke registrere sager med papilloma eller low-grade blærekræft hos UroScreen, mens følsomheden var bedre for high-grade tumorer. Hvis dette kunne bekræftes, kan survivin være et nyttigt supplement til opfølgning af patienter med hurtigere voksende tumorer, hvor detektion bør være så tidligt som muligt. Her ville en ikke-invasiv markør panel være en lovende måde at afsløre tilbagefald hurtigere og reducere antallet af cystoscopies [40]. Ikke desto mindre er individuelle molekylære markører øjeblikket mangler tilstrækkelig følsomhed til at erstatte cystoskopi [38].

Det lave antal hændelsen sager begrænsede magt undersøgelse for at vurdere resultaterne af de tumormarkører og bidrog til deres lave PPVs. Tidligere publicerede undersøgelser viste specificiteter mellem 88% og 100% og følsomheder mellem 53% og 100% [28] – [30], [32] – [34]. Mens vores resultater viste en lignende specificitet (98%) følsomhed (21%) var markant lavere i denne kohorte studie. I del, kan dette skyldes, at de forskellige assays anvendte. Den væsentligste årsag til forskellene mest sandsynlige er dog den tværsnitsundersøgelse konstruktion af de øvrige undersøgelser [41]. Større mangler er den manglende hensyntagen til dimensionen tid for at beregne prædiktive værdier, og en potentiel selektionsbias fordi sager og kontroller er blevet rekrutteret fra forskellige populationer. Den langsgående og dermed potentielle design af UroScreen undersøgelsen undgår denne skævhed. Det repræsenterer også en indstilling, der er tættere på klinisk praksis.

Vi observerede forskellige grunde, der kan være ansvarlig for, at sager ikke blev påvist i vores kohorte studie. En manglende overholdelse i en frivillig undersøgelse screening er et typisk problem, der påvirker tidlig påvisning af sager. For de fleste af deltagerne i undersøgelsen, prøver var ikke til rådighed for hver år i træk. I flere tilfælde er forskellen mellem erhvervelsen prøve og tumor diagnose var mere end tolv måneder, i et tilfælde endda 26 måneder. Det kan forventes, at en stigning af markør niveauer er mindre sandsynligt med en stigende tidsintervallet mellem prøveudtagning og diagnose. Et andet problem var, at deltagerne ofte udtømt urin kort før de ankom til en aftale, og derfor urin indsamlet på stedet var utilstrækkeligt i kvalitet og /eller mængde for nogle af markør tests. Denne form for urin blev typisk forbundet med lav kreatinin, et lavt antal sedimenterede celler, og lav β-actin.

Med hensyn til confounding, survivin blev mindre påvirket end NMP22 og UroVysion af urin status [36], [37]. Ifølge GEE model, kreatinin og leukocytter påvirkede ikke testresultaterne for survivin. Som blære infektioner ofte observeres hos ældre, er det vigtigt, at inflammatoriske processer ikke påvirker en tumor test. Dette er en fordel for survivin analyse har især i NMP22, som er kendt for at være ofte falsk positiv, når deltagerne lider infektioner. Det blev afspejlet i lavere antal falsk positive resultater af survivin analysen i forhold til den NMP22 assay [37]. Trods den begrænsede følsomhed den relativt høje specificitet kan tillade survivin, hvormed en markør panel. Det er vigtigt at bemærke, at positive survivin tests ikke resulterede i en anbefaling til cystoskopi. Som et resultat heraf er der en mulighed for, at et par tumorer måske være forblevet uopdaget, og at vi undervurderede ydeevne survivin. Dette svækker sammenligning med udførelsen af ​​FDA-godkendte prøver, dvs. NMP22 og UroVysion. Den survivin assay var positiv for ét tilfælde (4b), som ikke blev registreret af cytologi eller UroVysion. Survivin var også positive for sagsnummer 8, som ikke blev påvist ved de cellebaserede assays 14 måneder før diagnosen. Begge sager blev desuden testet positivt af NMP22. Dog vil flere tilfælde være forpligtet til at bevise det punkt, at udtryk-baserede markører som survivin kunne supplere cellebaserede assays UroVysion og cytologi.

Et særligt problem med kvantificering af survivin var vanskeligheden at opretholde kvaliteten af en stadig eksperimentel analyse over en periode på flere år. Dette kan være et design-specifikt problem prospektive kohorteundersøgelser i sammenligning med tværsnitsundersøgelser. Problemer som følge af ændringer i den oprindelige RNA isolation kit og ophør af produktionen af ​​assay reagenser fra den oprindelige leverandør resulterede i tre assay varianter, der førte til forskellige afskæringsværdier for survivin positivitet. De afbrydelser forhindrede bestemmelsen af ​​en optimeret samlet cut-off for det komplette datasæt. Vi normaliseret de kopiantal og implementeret analysen i GEE modellen som potentiel confounder for at teste, om resterende confounding kunne findes med de standardiserede survivin data. Assayet havde ingen indflydelse testresultaterne men β-actin viste sig at være en betydelig modifikator af testresultaterne. Det ser muligt, at specificitet survivin blev reduceret, hvis flere af de urinprøver havde været højere koncentreret. Koncentrationen af ​​β-actin var ikke blot en funktion af urin massefylde fordi korrelationen med creatinin var svag, hvilket indikerer, at andre faktorer som mRNA integritet kan have bidraget til udførelsen af ​​β-actin i PCR reaktioner.

Ud over disse uforudsete metodiske faktorer, der påvirkede analysen, den udbredte mRNA format til at opdage survivin bidrog også til de samlede resultater af analysen. RNA integritet vurderet af kopier af β-actin blev vurderet som den stærkeste indflydelse på testresultaterne. Rationalet bag anvendelsen af ​​et mRNA-baseret assay for survivin var at kunne detektere selv svage signaler af survivin der er til stede i det lille antal eksfolierede urothelial celler. PCR og RT-PCR er elegante og veletablerede metoder til at forstærke og kvantificere meget små mængder af nukleinsyrer. Ikke desto mindre lave stabilitet af mRNA generelt, selv med tilsætning af RNase-inhibitorer, begrænser anvendeligheden af ​​sådanne assays for prøver indsamlet uden for de kontrollerede betingelser i laboratoriet. Der er bedre RNase-hæmmere til rådighed i dag, der ville endda afkald nødvendigheden af ​​prøven frysning [42]. Men tilføjelsen af ​​disse konserveringsstoffer og prøven skal omgående. En mulig måde at undgå forsinkelser ville være en særlig samling rør, der ligner dem, der anvendes til opsamling af blod, som allerede indeholder konserveringsmidlet. Et andet problem uløseligt forbundet med survivin assay vi brugte var den ikke-linearitet forårsaget af to PCR-baserede forstærkning trin, der begrænsede nøjagtigheden af ​​kvantificering og strategier for normalisering. Selv anvender β-actin, der tjente som en intern kontrol, til korrektion var ikke altid tilstrækkelig til at kompensere for de store variationer i mRNA indholdet i prøverne, sandsynligvis på grund af den ekstra preamplification trin i survivin analysen. Af denne grund, til kliniske indstillinger under reelle driftsforhold, måske mere stabile molekyler lignende proteiner være bedre mål. Mens en PCR-lignende amplifikation af proteiner ikke er muligt, kan ELISA-baserede assays opnå meget gode følsomheder og er nu tilgængelige for survivin i bedre kvalitet end ved begyndelsen af ​​den UroScreen undersøgelsen.

Til dato UroScreen er den største prospektive undersøgelse til evaluering survivin for tidlig påvisning af blærekræft i en kohorte af asymptomatiske deltagere. Trods det lave antal hændelsen sager, har værdifulde oplysninger opnået om udførelsen af ​​mRNA-baserede assay af survivin, tekniske udfordringer, indflydelse af konfoundere, og kræft prædiktive værdier. En mere robust assay ville i høj grad gavne markør og dens anvendelse i klinisk praksis. Survivin kan have potentiale til at forbedre afsløring, især af high-grade tumorer; dens følsomhed, men hviler på kun fire tumorer (af 19), der blev detekteret med tre forskellige assay varianter. Den høje specificitet indebærer, at survivin kan anses for at fungere som en del af en multimarkør panel til at supplere andre markører, men yderligere validering i et prospektivt studie med flere tilfælde er berettiget. Test survivin inden for en kohorte af patienter med en høj risiko for tilbagevendende tumorer ville være en lovende tilgang.

Materialer og metoder

Undersøgelse befolkning og diagnosticering af tumorer

Deltagerne blev rekrutteret fra ODIN (Organisationsdienst für nachgehende Untersuchungen) kohorte inden for rammerne af et program for overvågning af den lovpligtige ulykkesforsikring for den kemiske industri, der tilbyder årlige undersøgelser af aktive og pensionerede arbejdstagere, der har været udsat for aromatiske aminer. Fra september 2003 juni 2010 1.609 mandlige arbejdstagere på to store kemiske anlæg i Tyskland (subcohort A: BASF, Ludwigshafen, subcohort B: Bayer, Leverkusen) deltog i UroScreen undersøgelsen. 1540 af dem, der tilstrækkeligt prøvemateriale til survivin målinger. Et spørgeskema blev anvendt til at dokumentere rygevaner og relevante sygdomme. Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité ved universitetet i Tübingen (No. 1 /2003V).

Som de andre tumor test (cytologi, NMP22®, UroVysion ™) anvendes i UroScreen blev godkendt i modsætning til survivin , det havde lavere prioritet, når prøvematerialet var begrænset. Derfor kun 5716 af de 7091 urinprøver var tilgængelige for survivin målinger. Karakteristik af kohorten er opsummeret i tabel 1-2 og er beskrevet mere detaljeret andetsteds (Pesch et al., Indsendt og [37]). Positive testresultater for cytologi, NMP22® eller UroVysion ™ resulterede i en henstilling til en cystoskopisk undersøgelse, mens positive resultater for den ikke-godkendte survivin assay ikke gjorde.

Fra november 2011, 21 tumorer i 20 personer blev påvist ved cystoskopi og bekræftet ved hjælp patologi. For 18 af tilfældene (19 tumorer) var tilgængelige for survivin bestemmelse urinprøver. Et tilfælde havde to tumorer (4a og 4b i tabel 3). Histopatologiske fund af alle 21 tumorer og parametre for de tilsvarende urinprøver (sidste screeningsrunde før diagnose af en tumor) er afbildet i tabel 3 og i [37].

Urin samling

Urinprøver blev indsamlet på stedet på de kemiske fabrikker i Ludwigshafen og Leverkusen. For survivin bestemmelse, ml prøver af 40-50 spontant udtømt urin blev centrifugeret i en svingende spand rotor ved 500 x g i 10 minutter ved 10 ° C. Supernatant blev forsigtigt fjernet og cellepellets blev blandet med 500 pi Lysis Solution R (Invitek, Berlin, Tyskland), der indeholder RNase-inhibitorer. Endelig blev celleprøven frosset ved -20 ° C og sendes til laboratoriet i Bochum, hvor de blev opbevaret indtil RNA-isolering. Håndtering af prøver til bestemmelse af urin status og andre markører er beskrevet nedenfor.

Urin status og vurdering af hæmaturi

I alle prøver urinen status blev bestemt i frisk urin (før centrifugering) som beskrevet tidligere [36]. Urinary creatinin blev bestemt med CREA plus® test (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Erythrocytter, hæmoglobin (Hb), leukocytter, albumin og andre parametre blev bestemt med Combur 10 Test® strimler (Roche). Desuden blev erythrocytter og leukocytter også bestemt semikvantitativt i urin sediment. Kreatinin målinger var tilgængelige for subcohort En kun (4806 prøver). For 4546 prøver af disse, fuldstændige oplysninger om alle parametre (erytrocytter, leukocytter, etc.) var til rådighed.

NMP22®, UroVysion ™, og cytologi

Nuklear matrix protein 22 (NMP22) blev bestemt kvantitativt med NMP22® ELISA-kit (Matritech /Alere GmbH, Köln, Tyskland) ifølge producentens protokol. Cut-off for et positivt resultat blev fastsat til 10 enheder /ml. Kromosomal ustabilitet i sedimenterede urothelial celler blev vurderet ved hjælp af UroVysion ™ blærekræft Kit (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Testen blev anset for positiv, hvis mindst fire kerner havde tre signaler af to eller tre kromosomer (3, 7, og 17), eller mindst 12 kerner viste et signal for 9p21 locus. Urinary cytologi blev udført som beskrevet tidligere [36], [43].

RNA isolation og survivin analyser

Kvantificering af survivin var baseret på Real-Time PCR med mRNA isoleret fra afstødes urothelial celler i urin. Til bestemmelse af survivin tre varianter af mRNA-baserede assay blev anvendt. Variationerne var en konsekvens af ændringer ved producenterne af RNA isolation kit og RT-PCR-reagenser, hhv. Oprindeligt blev protokollen og reagenser til survivin analysen fra FUJIREBIO Diagnostics, Inc. (FDI, Malvern, PA). Den FDI-protokollen anbefales RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i RNA isolation. Dette kit er imidlertid ikke optimeret til den meget lille mængde RNA, der normalt hentes fra det lave antal celler opnået fra 40-50 ml urin, hvilket fører til overvejende lave udbytter. En mindre ændring i en af ​​bestanddelene i kittet i 2005 førte til et yderligere fald i RNA udbytte. Derfor blev det erstattet af en alternativ isolering kit (InviTrap® Spin Cell RNA Mini Kit), der produceres bedre og mere konsekvente udbytter.

I 2007 FDI indstillet produktionen af ​​reagenser til Real-Time PCR assay. Det fik en anden ændring i analysen procedure i 2008. Fordi ingen anden kilde var tilgængelig, vi havde til at designe og producere nogle af de assay komponenter os selv (i det følgende kaldet “IPA analysen”). Små forskelle i primerne og proberne ifølge den Real-Time PCR analyse konsekvent medført højere kopiantal af survivin forhold til den oprindelige FDI assay. De tre assay varianter er som følger:

Variant 1 (Qiagen kit /FDI assay)

Denne variant blev brugt i september 2003 til oktober 2005. RNA isolation blev udført med RNeasy Mini Kits (Qiagen ) ifølge fabrikantens protokol. Revers transkription af mRNA, forforstærkning, og kvantitativ realtids-PCR blev udført som beskrevet af Kenney et al., Dog reaktionstiden volumener af hvert trin blev skåret i halve til 25 pi [33]. Primere, reagenser og positive kontroller blev leveret af FDI uden beregning. I modsætning til den offentliggjorte assay, i stedet for et ABI PRISM Sequence Detection System anvendtes en LightCycler II-system (Roche). For at kunne bruge kapillærer LightCycler systemet var det nødvendigt at tilføje bovint serumalbumin (BSA, AppliChem, Darmstadt, Tyskland) til TaqMan reaktion, med en slutkoncentration på 0,16 pg /pl.