PLoS ONE: Grape Seed Proanthocyanidiner (annoncer i Gmail) hæmmer væksten af ​​livmoderhalskræft ved at inducere apoptose medieret af mitokondrie Pathway

Abstrakt

vindruekerneolie proanthocyanidins (annoncer i Gmail), en biologisk aktiv komponent af vindruekerner, er blevet rapporteret at have en bred vifte af farmakologiske og biokemiske egenskaber. For nylig er der rapporteret de hæmmende virkninger af annoncer i Gmail på forskellige kræftformer, men deres virkninger på livmoderhalskræft fortsat uklare. Her, vi undersøgt virkningen af ​​annoncer i Gmail på livmoderhalskræft anvendelse af in vitro og in vivo modeller. In vitro behandling af HeLa og SiHa celler med annoncer i Gmail resulterede i en signifikant inhibering af cellelevedygtighed. Yderligere undersøgelse viste, at annoncer i Gmail førte til dosisafhængig induktion af apoptose i cancerceller. Den underliggende mekanisme var forbundet med forøget ekspression af pro-apoptotisk protein Bak-1, nedsat ekspression af det anti-apoptotiske protein Bcl-2, tabet af mitochondriemembranpotential, og aktiveringen af ​​caspase-3, hvilket antyder, at annoncer i Gmail induceret cervikal cancer-apoptose gennem den mitokondriske pathway. Desuden administrationen af ​​annoncer i Gmail (0,1%, 0,2% og 0,4%, vægt /vol) som et supplement i drikkevandet inhiberede tumorvækst af HeLa og SiHa-celler i athymiske nøgne mus, og antallet af apoptotiske celler i betydeligt disse tumorer blev også steget markant. Tilsammen vores studier viste, at annoncer i Gmail kunne hæmme væksten af ​​livmoderhalskræft ved at inducere apoptose gennem mitokondrie vej, som giver bevis for, at annoncer i Gmail kan være en potentiel kemoforebyggende og /eller kemoterapeutisk middel for livmoderhalskræft.

Henvisning : Chen Q, Liu XF, Zheng PS (2014) Grape Seed Proanthocyanidiner (annoncer i Gmail) hæmmer væksten af ​​livmoderhalskræft ved at inducere apoptose medieret af Mitokondriel Pathway. PLoS ONE 9 (9): e107045. doi: 10,1371 /journal.pone.0107045

Redaktør: Burton B. Yang, University of Toronto, Canada

Modtaget: Marts 5, 2014 Accepteret: 4. august, 2014 Udgivet: 4 September, 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af en bevilling fra National Natural Science fond for Distinguished Unge Forskere (nr 30.725.043), en generel tilskud (nr 81.270.715) og en ungdom tilskud (nr 31.201.118) fra National Natural Science Foundation of China. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er den tredje mest almindelige kræftform [1] og den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt kvinder over hele verden [2]. Ca. 80% af tilfældene af livmoderhalskræft opstår i udviklingslande, hvis der konstateres ca. 529.000 nye tilfælde hvert år, med næsten halvdelen af ​​disse patienter dør [3]. I udviklingslandene, på grund af manglende screening og reduceret adgang til passende terapeutiske faciliteter og narkotika, forekomsten og dødeligheden af ​​livmoderhalskræft rang sekunder efter brystkræft [4]. Mange sager har udviklet sig til invasive livmoderhalskræft på tidspunktet for diagnosen, og patienterne er ikke længere kandidater til radikal kirurgisk behandling. Selvom kemoterapi og strålebehandling er stadig de vigtigste behandlinger for invasiv livmoderhalskræft, er de fem-års overlevelse begrænset på grund af den begrænsede effekt og høj toksicitet mange lægemidler mod cancer. Derfor er udforskning og udvikling af mere effektive og mindre giftige, terapeutiske midler kræves.

Epidemiologiske undersøgelser har vist, at forbruget af en af ​​vegetabilsk frugt-baserede kost nedsætter risikoen for kræft betydeligt [5], [ ,,,0],6], som tilbyder lovende nye muligheder for udvikling af mere effektiv kemoforebyggende eller kemoterapeutiske strategier for forskellige kræftformer. For nylig har mange fytokemikalier af forskellige kemiske naturer isoleret fra frugt og grønt blevet afsløret for at have potentiel kemoforebyggende og /eller kemoterapeutiske virkninger mod kræft [7], [8], såsom catechiner, bioflavonoider, phyto-østrogener og proanthocyanidins [9], [10]. Drue frø proanthocyanidins (annoncer i Gmail), en polyphenolisk blanding, hovedsageligt indeholde 70% -95% proanthocyanidiner, som udgør dimerer, trimerer tetramerer, og oligomerer /polymerer af monomere catechiner og /eller (-) – epicatechiner [11] – [13] . Annoncer i Gmail er blevet demonstreret at have minimal toksicitet in vivo og effektive anticancer virkninger på forskellige humane cancere [14], såsom human prostatacancer [15], human colorectal cancer [16], [17], human ikke-småcellet lungekræft [ ,,,0],18], [19], pancreascancer [20], og hoved og hals skællede kræft [21]. Ikke desto mindre, på nuværende tidspunkt, har ingen undersøgelser undersøgt virkningerne af annoncer i Gmail på livmoderhalskræft.

I denne undersøgelse blev annoncer i Gmail fundet at være i stand til at hæmme livmoderhalskræft kræft vækst in vitro og in vivo, giver overbevisende evidens for farmakologiske aktivitet af annoncer i Gmail mod livmoderhalskræft.

Materialer og metoder Salg

Antistoffer, reagenser og kemikalier Salg

antistoffer specifikke for Bcl-2, Bak-1 og β-actin blev købt hos Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase blev indkøbt fra Thermo Fisher Scientific, Inc. (New York, NY). Annexin V-konjugeret FITC apoptosis afsløring kit blev opnået fra BD Pharmaceuticals (Franklin Lakes, NJ). Den JC-1 mitokondrie membranpotentiale afsløring kit og caspase-3 aktivitet afsløring kit blev købt fra Nanjing KeyGen Biotech Co, Ltd (Nanjing, Kina), og in situ detektion celledød kit blev købt fra Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, I). MTT (3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid), PI (propidiumiodid) og DAPI (2- (4-amidinophenyl) -6-indolecarbamidine dihydrochlorid) blev opnået fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). De annoncer i Gmail blev købt fra Jianfeng Natural Product R . D Co, Ltd (Tianjin, Kina)

cellelinjer og cellekultur

De humane livmoderhalskræft cellelinjer SiHa og HeLa blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Cellelinierne blev dyrket som monolag i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, USA) ved 37 ° C i 5% CO

2. Annoncer i Gmail blev opløst i en lille mængde dimethylsulfoxid (DMSO, 100 pi) før tilsætning til mediet. Den maksimale koncentration af DMSO i mediet ikke oversteg 0,1% (v /v), og celler behandlet med DMSO alene tjente som vehikelkontrol.

MTT assay for cellelevedygtighed

Virkningen af annoncer i Gmail på cellelevedygtighed bestemtes under anvendelse af et MTT-assay som tidligere [22] beskrevne. Kort beskrevet blev celler udpladet i 96-brønds dyrkningsplader ved 5 × 10

3 celler per brønd og inkuberet natten over. Celler blev behandlet med annoncer i Gmail i forskellige koncentrationer i 24, 48 eller 72 timer. Ved afslutningen af ​​stimuleringen tidsrum blev MTT tilsat til hver brønd. Den resulterende formazan blev derefter opløst i 100 pi dimethylsulfoxid (DMSO), og absorbansen blev registreret ved 540 nm ved anvendelse af et Bio-Rad 3350 mikropladelæser.

Flowcytometrisk påvisning af apoptose

virkningerne af annoncer i Gmail på apoptose af cervicale cancerceller blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af Annexin V-konjugeret FITC apoptose detektion kit (BD, Franklin Lakes, NJ). Kort fortalt, efter behandling med annoncer i Gmail i 48 timer blev cellerne høstet, vasket med PBS og inkuberet med Annexin V-FITC og PI i 10 minutter i mørke. Derefter blev påvist de farvede celler under anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson Franklin Lakes, NJ).

Cellecyklusanalyse

Celler blev behandlet med angivne koncentrationer af annoncer i Gmail i 48 timer, derefter høstet , vasket med kold PBS, og efterfulgt af fiksering med iskold 70% ethanol natten over ved 4 ° C. Efter vasket to gange med PBS, blev cellerne farvet med fluorescerende probe opløsning indeholdende 50 pg /ml PI og 1 mg /ml RNaseA på is i mørke i 30 min. Cellecyklussen blev analyseret ved FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, USA) under anvendelse af CellQuest software.

Western blot-analyse

Efter behandling med annoncer i Gmail, HeLa og SiHa-celler blev høstet, vasket med kold PBS og lyseret med iskold lysepuffer suppleret med proteaseinhibitorer som tidligere beskrevet [23]. Til Western blot-analyse blev proteiner separeret ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner ved våd overførsel. Efter blokering med 5% fedtfri mælk blev membranen inkuberet med det primære antistof ved 4 ° C natten over. Efter vask blev membranen inkuberet med det passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time, og proteinbåndene blev visualiseret under anvendelse forøget kemiluminescens reagenser (Millipore, Billerica, USA) på røntgenfilm.

Assay for mitokondrie membranpotentiale

Ændringer i den mitokondriske membranpotentiale af livmoderhalskræft celler behandlet med annoncer i Gmail blev målt ved flowcytometri under anvendelse af fluorescerende lipofile kationiske probe JC-1 detektion kit ifølge producentens protokol. JC-1 akkumulerer selektivt inden for normale mitokondrier at danne multimeren J-aggregater, der udsender rød fluorescens. JC-1 ikke kan aggregat i mitokondrier med ændret mitokondrielle membranpotentiale og forbliver i cytoplasmaet i monomer form, fluorescerende grøn. Således kan farven af ​​farvestoffet skifter fra orange til grøn, afhængigt af mitochondriemembranpotential, og analyseres ved flowcytometri ved FITC-kanalen.

Påvisningen af ​​caspase-3-aktivitet

aktiviteten af ​​caspase-3 blev bestemt under anvendelse af apo target kit ifølge producentens protokol. Kort beskrevet blev cellerne behandlet med annoncer i Gmail i 48 timer og derefter høstet. Cellelysater blev fremstillet som tidligere [23] beskrevne. Prøver af cellelysaterne (150 ug protein per prøve) blev blandet med reaktionsbuffer og substrat og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Absorbansen blev derefter målt ved 405 nm, og prøven aflæsninger blev beregnet ved at trække absorbansen af ​​blindprøver.

Dyr og tumor xenograft model

BALB /C nøgne mus (6-7 uger gamle) blev opnået fra SLAC Laboratory Animal Co., Ltd (Shanghai, Kina) og har til huse i Animal Resource Facility på Medical College of Xi’an Jiaotong Universitet, der blev opretholdt ved en konstant temperatur (22 ° C-25 ° C ) og fugtighed (40-50%). Alle dyr havde fri adgang til drikkevand og fødevarer, og modtog human behandling i overensstemmelse med de internationalt anerkendte principper for forsøgsdyr brug og pleje (europæiske retningslinjer EU, EØF direktiv af 1986, 86/609 /EØF). Dyret, der bruges i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg Medical College of Xi’an Jiaotong Universitet.

For at fastlægge effekten af ​​annoncer i Gmail mod livmoderhalskræft kræft vækst in vivo, to tumor xenograftmodeller blev anvendt. Model 1: Musene blev tilfældigt opdelt i fire grupper med seks mus pr gruppe, Gruppe 1, kontrol; Gruppe 2, annoncer i Gmail (0,1%, vægt /volumen); Gruppe 3, annoncer i Gmail (0,2%, vægt /volumen); Gruppe 4, annoncer i Gmail (0,4%, vægt /volumen), og modtog musene annoncer i Gmail i mindst 10 dage før implantation af tumorceller. Model 2: Musene blev tilfældigt opdelt i to grupper med seks mus per gruppe, Gruppe 1, kontrol; Gruppe 2, annoncer i Gmail (0,4%, vægt /volumen), og musene begyndte at modtage annoncer i Gmail på 12. dag efter implantationen af ​​tumorceller. Eksponentielt voksende HeLa og SiHa-celler (2 x 10

6 i 100 pi PBS) blev injiceret subkutant i den højre flanke af hver mus hhv. Annoncer i Gmail blev opløst i destilleret vand, og modtog musene annoncer i Gmail ved at drikke vand frit. Kontrolmusene modtog destilleret vand. Den tumorvækst blev overvåget regelmæssigt med skydelære hele eksperimentet, og i produktionen af ​​tumorer blev beregnet ved hjælp af følgende formel: Volumen = (længde × bredde

2) /2. Ved afslutningen af ​​forsøget blev musene aflivet ved halshugning under 25% urethan anæstesi, og tumormassen blev høstet og vejet. En portion af tumorvævet blev paraffin-indlejret, og den anden portion blev nedfrosset i flydende nitrogen for den videre analyse.

histopatologisk undersøgelse

paraffinsnit af tumorxenografter blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret gennem faldende koncentrationer af ethanol ifølge rutinemæssige fremgangsmåder og blev farvet med hematoxylin og eosin (H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

annoncer i Gmail hæmmede levedygtigheden af ​​livmoderhalskræft celler in vitro

effekten af ​​annoncer i Gmail på levedygtigheden af ​​livmoderhalskræft celler blev først opgøres ud en MTT assay. De cervikale cancercellelinier, herunder HeLa og SiHa-celler, blev behandlet med forskellige doser af annoncer i Gmail (0, 20, 40, 60, 80 og 100 ug /ml) i 24, 48 eller 72 timer. Som vist i fig. 1A, behandling af HeLa-celler med annoncer i Gmail resulterede i en signifikant reduktion i cellernes levedygtighed på en dosis-afhængig måde (

s Restaurant 0,05). Især blev en signifikant hæmmende effekt observeret ved 48 timer efter GSP behandling (5-85% reduktion,

s

0,05). Endvidere er virkningen var også tidsafhængig (60 pg /ml annoncer i Gmail, 25-90% reduktion,

s

0,05). Lignende inhibitoriske effekter blev observeret på SiHa celler behandlet med annoncer i Gmail (fig. 1B). Alle disse resultater viste, at annoncer i Gmail effektivt kunne inhibere levedygtighed cervicale cancerceller.

(A) HeLa og (B) SiHa-celler blev behandlet med varierende doser af annoncer i Gmail, og den relative levedygtigheden af ​​cellerne blev vurderet ved MTT-assay efter 24 timer, 48 timer og 72 timer. Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af ​​kontrolceller som middelværdi ± SD opnået fra 3 adskilte eksperimenter. (C) væksthæmmende og morfologiske forandringer i HeLa og SiHa celler behandlet med annoncer i Gmail i 48 timer i forhold til kontrol-celler (ikke-annoncer i Gmail-behandlet). Celler blev fotograferet med omvendt kontrast mikroskopi (forstørrelse, 40 ×).

Desuden blev cellen levedygtighed SiHa og HeLa celler efter annoncer i Gmail behandling også observeret under et fasekontrastmikroskop. Som vist i fig. 1C, efter 48 timers annoncer i Gmail behandling, densiteten af ​​begge cellelinier blev signifikant reduceret i en dosis-afhængig måde. Annoncer i Gmail behandling også bemærkelsesværdigt ændret morfologi livmoderhalskræft celler. Efter annoncer i Gmail behandling, HeLa og SiHa celler faldt i størrelse, tilbagetrukket fra deres naboer, mistede deres flade og polygonal form, og i sidste ende løsrevet fra kultur fad, tyder på, at annoncer i Gmail hæmmede livmoderhalskræft cellelevedygtighed ved at inducere celledød.

annoncer i Gmail induceret cellecyklus anholdelse i livmoderhalskræft celler

for at rydde, om livmoderhalskræft cellelevedygtighed hæmning af annoncer i Gmail er involveret i ændringen i cellecyklusprogression, cellecyklus analyse blev udført. HeLa og SiHa-celler blev behandlet med forskellige doser af annoncer i Gmail i 48 timer blev fordelingen af ​​celler i forskellige faser af cellecyklus analyseret ved flowcytometer. Som vist i fig. 2A og B, behandling af HeLa-celler med annoncer i Gmail resulterede i en signifikant akkumulering af celler i G2 /M-fase ved højere koncentrationer (40 ug /ml og 80 pg /ml,

s Restaurant 0,01). Svarende til HeLa celle resulterer en betydelig standsning af cellerne i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus blev også observeret i SiHa-celler ved 40 og 80 ug /ml koncentration af annoncer i Gmail (fig. 2C og D,

s

0,01). Sammen disse resultater foreslog, at annoncer i Gmail kunne fremkalde anholdelsen af ​​cellecyklus i G

2 /M fase, som kan være forbundet med den hæmmende effekt af annoncer i Gmail på livmoderhalskræft celle.

HeLa og SiHa celler behandlet med forskellige doser af annoncer i Gmail i 48 timer og høstes. Fordelingen cellecyklus blev analyseret ved flowcytometri. (A, C) De repræsentative cellecyklus histogrammer af HeLa og SiHa. (B) Behandling af HeLa-celler med annoncer i Gmail resulterede i akkumulering af celler i G

2 /M-fasen. (D) Behandlingen af ​​SiHa celler med annoncer i Gmail ført til akkumulering af celler i G

2 /M-fasen. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SD, *

s

0,05

vs

kontrol.; **

s

. . 0.01

vs

kontrol

annoncer i Gmail inducerede apoptose af livmoderhalskræft celler

For at bestemme om annoncer i Gmail induceret den apoptose af cervicale cancerceller, vi observerede morfologisk ændring af cellekernen ved hjælp DAPI farvning (fig. 3A). En række HeLa og SiHa celler behandlet med forskellige doser af annoncer i Gmail i 48 timer viste sig at vise klassiske apoptotiske ændringer, såsom chromatinkondensering, karyopyknosis og apoptotisk organ formation. Men den ubehandlede kontrol SiHa og HeLa-celler sjældent vises disse funktioner, hvilket tyder på, at GSP behandling kan inducere apoptose af cervicale cancerceller.

HeLa og SiHa-celler blev behandlet med varierende doser af annoncer i Gmail i 48 timer og derefter høstet til analyse af apoptose. (A) De morfologiske ændringer af kerner blev undersøgt ved fluorescensmikroskopi under anvendelse af DAPI-farvning. Pilen angiver cellekernekondensation og en apoptotisk legeme (forstørrelse, 40 ×). Flowcytometrianalyse af Annexin V-FITC /PI double-farvet HeLa (B) og SiHa (C) celler. Den lave højre (LR) kvadrant af histogrammerne viser de tidlige apoptotiske celler, og den øvre højre (UR) kvadrant viser de sene apoptotiske celler. Behandlingen af ​​HeLa (B) og SiHa (C) celler med annoncer i Gmail resulterer i betydelige stigninger i procentdele af apoptotiske celler (herunder tidlig fase og sene stadie). Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD af tre forsøg i to eksemplarer, *

s

0,05

vs

kontrol.; **

s

. . 0.01

vs

kontrol

For yderligere kvantitativ analyse af apoptose induceret af annoncer i Gmail, celler behandlet med forskellige doser af annoncer i Gmail var analyseret ved flowcytometri under anvendelse Annexin V-FITC /PI dobbelt farvning. Apoptotiske celler kunne tastes i den tidlige fase apoptose (Annexin V

+ og PI

-) og sene apoptose (Annexin V

+ og PI

+), som er vist henholdsvis i nederste højre (LR) og øverste højre (UR) kvadranter af FACS histogrammer (fig. 3B og D, venstre panel). De apoptose resultater (herunder den tidlige fase og sene) i begge cellelinier er yderligere opsummeret i figur 3 C og E. Den procentdel af totale apoptotiske celler i HeLa-celler var 1,5% i kontrol- celler (tidlige fase: 0,69% og sene: 0,81%), 3,1% i celler behandlet med 20 mg /ml annoncer i Gmail (tidlige fase: 0,95% og sene: 2,15%), 17,51% i celler behandlet med 40 mg /ml (den tidlige fase: 4,21% og sene: 13,30%) og 25,6% i celler behandlet med 80 pg /ml (den tidlige fase: 8,33% og sene: 17,27%). Ligeledes dem i SiHa celler 1,37% i kontrol- celler (tidlige fase: 0,63% og sen-fase: 0,74%), 3,08% i celler behandlet med 20 mg /ml annoncer i Gmail (tidlige fase: 1,43% og sene : 1,65%), 3,56% i celler behandlet med 40 pg /ml (den tidlige fase: 1,62% og sene: 1,94%) og 9,56% i celler behandlet med 80 mg /ml (den tidlige fase: 3,25% og sent -stage: 6,31%). Alle disse resultater viste, at annoncer i Gmail betydeligt inducerede apoptose (herunder tidlig og sen-fase apoptose,

s

0,01) af livmoderhalskræft celler

annoncer i Gmail inducerede apoptose af livmoderhalskræft celler igennem. nedregulering af Bel-2 og den opregulering af Bak-1

Både Bcl-2 og Bak-1 proteiner spiller afgørende roller i reguleringen af ​​apoptose [25], [26]. Således blev ekspressionen af ​​Bcl-2 og Bak-1 undersøgt ved western blotting for at fastslå, om disse to proteiner er involveret i induktionen af ​​livmoderhalskræft celle apoptose ved annoncer i Gmail. De repræsentative blots for HeLa og SiHa-celler er vist i fig. 4A og C og den relative ekspression af disse proteiner blev yderligere beregnet ved normalisering til p-actin ekspression og er sammenfattet i figur 4 B og D, henholdsvis. Resultaterne viste, at ekspressionen af ​​Bcl-2 i HeLa-celler behandlet med annoncer i Gmail i 48 timer blev signifikant reduceret i en dosis-afhængig måde (figur 4B,

s

. 0,05). Omvendt blev ekspression af Bak-1 signifikant forøget (figur 4B,

s

. 0,05). Lignende resultater blev også fundet med SiHa celler (Fig 4D,

s

. 0,05). Derfor annoncer i Gmail inducerede apoptose af cervicale cancerceller gennem nedregulering af Bcl-2 og den opregulering af Bak-1.

Cellerne blev behandlet med varierende doser af annoncer i Gmail i 48 timer og derefter høstet . Cellelysater blev fremstillet og underkastet western blot-analyse. (A) Behandling af HeLa-celler med annoncer i Gmail resulterede i en dosisafhængig reduktion af Bcl-2-ekspression og en stigning i Bak-1-ekspression. (B) Den relative ekspression af Bcl-2 og Bak-1-proteiner i HeLa-celler blev beregnet på grundlag af β-actin-ekspression, der blev anvendt som indlæsning kontrol. (C) annoncer i Gmail faldt betydeligt ekspressionen af ​​Bcl-2 og forøgede ekspressionen af ​​Bak-1 i SiHa-celler. (D) Den relative af ekspressionsniveauer af Bcl-2 og Bak-1 i SiHa celler samlet. Repræsentative blots er vist fra tre uafhængige forsøg, og værdierne er udtrykt som middelværdi ± SD. *

s

0,05

vs

kontrol.; **

s

. . 0.01

vs

kontrol

annoncer i Gmail fremkaldt tab af mitochondriemembranpotential i livmoderhalskræft celler og aktiverede caspase-3 protein

det er velkendt, at den intracellulære translokation af Bcl-2 og Bak-1 kan inducere tabet af mitokondrielle membranpotentiale, som er knyttet til indledning og aktivering af den apoptotiske proces i celler [27], [28 ]. At undersøge virkningen af ​​annoncer i Gmail på mitochondriemembranpotential, blev integriteten af ​​det mitokondrielle membran af celler bestemt ved farvning med JC-1, et kationisk lipofilt farvestof. Som vist i fig. 5A og C, HeLa og SiHa celler behandlet med annoncer i Gmail i 48 timer blev analyseret ved FACS. Den gennemsnitlige procentdel af grøn fluorescens-positive HeLa-celler var 3,10% ved 0,00 ug /ml, 5,27% ved 20 ug /ml, 6,90% ved 40 ug /ml og 10,83% ved 80 ug /ml (fig. 5B), mens der de SiHa-celler var 0,45% ved 0,00 ug /ml, 1,55% ved 20 ug /ml, 8,35% ved 40 ug /ml og 35,47% ved 80 ug /ml (fig. 5D). Disse resultater viste en betydelig stigning i grøn fluorescens-positive celler med stigende doser af annoncer i Gmail (

s Restaurant 0,01), hvilket antyder, at annoncer i Gmail kan inducere cervikal cancerceller mister mitochondriemembranpotential. Derfor annoncer i Gmail inducerede apoptose af cervicale cancerceller gennem afbrydelse af mitochondriemembranpotential.

HeLa (A) og SiHa (C) -celler blev behandlet med de angivne doser af annoncer i Gmail i 48 timer og derefter høstet, farves med JC-1 farvestof, og endelig analyseret ved flowcytometri. Annoncer i Gmail resulterede i et betydeligt tab af mitochondriemembranpotential i HeLa (B) og SiHa celler (D). Caspase-3-aktivitet i HeLa og SiHa-celler blev målt under anvendelse af et kolorimetrisk proteinanalyse, og behandling af HeLa (E) og SiHa (F) celler med annoncer i Gmail resulterede i en dosisafhængig stigning i aktiviteten af ​​caspase-3. GFP: Grøn fluorescens positiv. Data er præsenteret som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter, *

s Restaurant 0,05

vs

kontrol.; **

s

0,01

vs

kontrol

På grund af tabet af mitochondriemembranpotential, er cytochrom c frigives i cytosolen, som aktiverer.. procaspase 9 i apoptosome og fører til spaltningen af ​​caspase-3 [29]. Efterfølgende aktiv spaltet caspase-3 kan spalte et bredt spektrum af målproteiner og endelig resultere i apoptotisk celledød. At undersøge, om apoptose induceret af annoncer i Gmail er involveret i kaskade aktivering blev aktiviteterne i caspase-3 bestemt ved en kolorimetrisk assay. Resultaterne viste, at behandling af både HeLa og SiHa celler med annoncer i Gmail i 48 timer resulterede i signifikant stigning i caspase-3-aktivitet i en dosisafhængig måde (fig. 5E og F), hvilket antyder, at apoptose af livmoderhalskræft celler induceret af annoncer i Gmail skete gennem aktivering af caspase-3 bane.

annoncer i Gmail hæmmede initiering og progression af livmoderhalskræft in vivo

Fordi annoncer i Gmail kunne inducere apoptose af livmoderhalskræft celler in vitro, var det nødvendigt at teste, om annoncer i Gmail kunne inhibere initiering og tumorvækst af cervikale cancerceller in vivo. For at teste virkningerne af annoncer i Gmail til indledningen og fremadskriden af ​​humane cervikale cancerceller, blev nøgne mus fodret annoncer i Gmail i 10 dage før inokulering med cervicale cancerceller. Væksten af ​​tumorer blev monitoreret i form af tumorvolumen hver tredje dag. Ved afslutningen af ​​forsøget blev tumorerne udskæres efter musene blev aflivet, og de våde vægte af tumorerne blev bestemt.

Først fandt vi, at tumordannelse af HeLa-celler i kontrolgruppen forekom ved 12 dage efter inokulering; dog tumordannelse i annoncer i Gmail behandlingsgruppe (annoncer i Gmail, 0,2% og 0,4%) forekom tilnærmelsesvis 15 dage efter inokulering. Lignende resultater blev observeret i SiHa-celler, hvilket antyder, at annoncer i Gmail inhiberede initiering af livmoderhalskræft. For det andet, at vækstraten for HeLa og SiHa tumorxenoplantater i mus behandlet med annoncer i Gmail var betydeligt langsommere end for kontrollerne (fig. 6A og B), der foreslog, at annoncer i Gmail hæmmede væksten af ​​livmoderhalskræft xenografter i nøgne mus. I sidste ende, den gennemsnitlige vådvægt af tumorxenotransplantater dannet af HeLa-celler efter annoncer i Gmail behandling var signifikant mindre end den af ​​kontrollen (

s Restaurant 0,01, Fig 6C og E.). Tilsvarende administration af annoncer i Gmail resulterede også i signifikant reduktion i vådvægt SiHa tumorxenoplantater (

s

. 0,01, figur 6D og F). Derudover blev den histopatologiske undersøgelse af tumorxenotransplantater udført under lysmikroskop. Som vist i fig. 6G og H, blev observeret tydelige morfologiske ændringer i de annoncer i Gmail behandlede grupper. Sammenlignet med kontrolgruppen, tumor væv af annoncer i Gmail behandlede grupper, især 0,4% annoncer i Gmail gruppe, præsenteret udbredt karyopyknosis, apoptotisk legemers dannelse og cellesprængning, hvilket antyder, at annoncer i Gmail førte til den apoptotiske og nekrotiske død cervicale cancerceller. Kollektivt, disse resultater antydede, at annoncer i Gmail kunne hæmme initiering og vækst af livmoderhalskræft implanteret, udviser en kemoforebyggende effekt mod livmoderhalskræft.

Mus var

sc

podet i højre fløj med 2 × 10

6 tumorceller. (A og B) Gennemsnitlige tumorvolumener hos hver gruppe blev målt regelmæssigt. Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev tumormassen høstes (C og D), og den våde vægt af tumoren blev registreret (E og F). (G og H) histopatologisk undersøgelse af tumorxenografter blev udført under lysmikroskop, (forstørrelse, 40 ×). Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD, og ​​den statistiske signifikans af forskelle blev analyseret ved envejs ANOVA efterfulgt af Tukey testen. *

s

0,05

vs

kontrol.; **

s

. . 0.01

vs

kontrol

kemoterapeutiske effekt af annoncer i Gmail på livmoderhalskræft implanteret

For at evaluere den terapeutiske effekt af annoncer i Gmail på de etablerede tumorer blev mus behandlet med annoncer i Gmail (0,4%, vægt /volumen) på 12

th dag efter implantation, efter tumorer havde allerede dannet. Væksten af ​​tumorer blev monitoreret regelmæssigt, og vi fandt, at behandling med annoncer i Gmail fører til en signifikant reduktion i tumoren vækstrate. Som vist i fig. 7A og B blev tumorvolumener af annoncer i Gmail-behandlede mus markant reduceret sammenlignet med kontrolmus, hvilket antyder, at annoncer i Gmail kunne inhibere væksten af ​​HeLa og SiHa tumorxenoplantater. Endvidere ved afslutning af forsøget, målingen af ​​tumor vådvægt afslørede, at den våde vægt af tumorer i annoncer i Gmail-behandlede gruppe var signifikant faldt sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 7C og D,

s

0,01), og den histopatologiske undersøgelse fandt også, at morfologisk ændring af tumorxenografter i annoncer i Gmail-behandlede gruppe var også bemærkelsesværdig i sammenligning med kontrolgruppen (fig 7E og F).. Derfor er disse resultater viste yderligere hæmmende virkning af annoncer i Gmail mod livmoderhalskræft progression.

I GSP-behandlede gruppe blev musene administreret annoncer i Gmail (0,4%) på 12

th dag efter implantation af tumorceller. (A og B) Tumorvoluminer blev optegnet hver 3. dag, og administrationen af ​​annoncer i Gmail hæmmede væksten af ​​HeLa (A) og SiHa (B) tumorxenoplantater. (C og D) Tumormassen blev høstet ved slutningen af ​​eksperimentet, og den våde vægt af tumoren blev målt. Administrationen af ​​annoncer i Gmail ført til en betydelig reduktion af den våde tumor vægt. (E og F) Den indlysende morfologisk ændring af apoptotisk celledød blev observeret i tumorvæv hos annoncer i Gmail-behandlede gruppe, men ikke i kontrolgruppen, (forstørrelse, 40 ×). Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD, **

s

. . 0.01

vs

kontrol

annoncer i Gmail inducerede celle apoptose af livmoderhalskræft implanteret in vivo

Modstand mod apoptose er en af ​​de vigtige karakteristiske træk ved maligne tumorer. For at bestemme om annoncer i Gmail inhiberer livmoderhalskræft progression ved at inducere apoptotisk celledød af tumorceller, vurderede vi apoptose ved anvendelse af TUNEL-analysen på tumorvæv dannet af SiHa og HeLa-celler med eller uden annoncer i Gmail behandling i model 1. Analyseresultaterne er vist i fig . 8A og kvantitativt opsummeret i fig. 8B. Procentdelen af ​​TUNEL-positive celler i tumorvæv fra HeLa-celler behandlet med 0,4% annoncer i Gmail var ca. tre gange højere end for kontrollen, og af SiHa-celler behandlet med 0,4% annoncer i Gmail med fire punkter højere end for kontrollen. Som vist i fig.