PLoS ONE: BIM-medieret AKT Phosphorylering er en vigtig modulator af arsentrioxid-induceret apoptose i cisplatin-følsomme og resistente Ovarian Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Chemo-resistens over for cisplatin-centrerede kræftbehandling er en væsentlig hindring for en effektiv behandling af human ovariecancer. Tidligere rapporter viste, at arsentrioxid (ATO) inducerer celle apoptose i både narkotika-følsomme og resistente æggestokkene cancerceller.

vigtigste resultater

I denne undersøgelse har vi bestemt den molekylære mekanisme ATO- induceret apoptose i ovariecancerceller. Vores data viste, at ATO induceret celle apoptose ved at sænke niveauet af phosphoryleret AKT (p-AKT) og aktivering caspase-3 og caspase-9. Vigtigere er det, BIM spillet en afgørende rolle i ATO-induceret apoptose. Inhiberingen af ​​BIM-ekspression forhindrede AKT dephosphorylering hæmmede caspase-3 aktivering under celleapoptose. Men overraskende gendæmpning af AKT eller FOXO3A havde lille indvirkning på BIM-ekspression og phosphorylering. Endvidere aktiveringen af ​​caspase-3 ved ATO behandling forbedret AKT dephosphorylering, ikke blot ved spaltning af regulatoriske A-underenhed af proteinphosphatase 2A (PP2A), men også ved at øge dets aktivering. Desuden vores data indikeret, at c-Jun N-terminale kinaser (JNK) vej er involveret i reguleringen af ​​BIM udtryk.

Konklusioner

Vi demonstrerede roller BIM i ATO-induceret apoptose og de molekylære mekanismer i BIM-ekspression reguleres af ATO under ovariecancercelle apoptose. Vores resultater antyder, at BIM spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​p-AKT ved at aktivere caspase-3 og at BIM medierer niveauet af AKT phosphorylering at bestemme tærsklen for at overvinde cisplatin resistens i ovariecancerceller

Henvisning:. Yuan Z, Wang F, Zhao Z, Zhao X, Qiu J, Nie C, et al. (2011) BIM-medieret AKT Phosphorylering er en vigtig modulator af arsentrioxid-induceret apoptose i cisplatin-følsomme og resistente Ovarian Cancer Cells. PLoS ONE 6 (5): e20586. doi: 10,1371 /journal.pone.0020586

Redaktør: Pierre Bobé, Institut Jacques Monod, Frankrig

Modtaget: Oktober 20, 2010; Accepteret: 6 maj 2011; Udgivet: 31 maj, 2011

Copyright: © 2011 Yuan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af Natural Science Foundation of China (NSFC) -81.071.817 /H1609, (NSFC) -30.800.581 og (NSFC) -30.900.744. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest almindelige årsag til kræftdødsfald fra gynækologiske tumorer [1]. Cisplatin og dets analoger er de vigtigste forbindelser med kemoterapi for humane ovariecancere, men kemo-resistens er en væsentlig hindring for transaktioner vellykket behandling af patienter med ovariecancer [2], [3]. Det vil således være et stort gennembrud i fortsatte prækliniske studier for at finde et nyt, lav toksicitet, men effektiv medikament til at overvinde cisplatin modstand.

ATO, som har vist sig at være et effektivt kemoterapeutisk lægemiddel til behandling af recidiverende /refraktær akut promyelocyt leukæmi (APL) i 1990’erne [4], er blevet godkendt af FDA (Federal Drug Administration) til behandling af all-trans retinsyre (ATRA) resistent APL [5]. Den bemærkelsesværdige effektivitet af ATO i behandlingen af ​​APL har ført til efterforskningen af ​​dens anticanceraktivitet og underliggende mekanisme i andre maligniteter. Der har været lovende undersøgelser indikerer, at ATO ikke blot besidder iboende monoterapi tumordræbende aktivitet mod ovarie–cancercellelinier, men også kan udløse apoptose i cisplatin-resistente celler [6] – [10]. Imidlertid er de præcise molekylære mekanismer, som ATO overvinder kemo-modstand og inducerer apoptose i æggestokkene cancerceller dårligt forstået.

De seneste oplysninger tyder på, at den manglende medicin-induceret apoptose kan være en underliggende årsag til resistens. Nogle undersøgelser har identificeret en række centrale formidlere af apoptose, der er ændret i kemo-resistente ovariecancerceller [10] – [13]. Niveauerne af ekspression og aktivering af BCL-2 familie-proteiner spiller ofte vigtige roller i at kontrollere apoptotiske responser på lægemiddelbehandlinger, således modulere kemo-følsomhed af tumorceller [14] – [16]. Overekspression af Bcl-2 og Bcl-XL gener bidrager til apoptotisk hæmning og udviklingen af ​​multilægemiddelresistens-resistens af humane ovariecancere. P53-proteinet er også en vigtig regulator af kemo-følsomhed i ovariecancerceller og er hurtigt opreguleret i respons på DNA-beskadigende midler, såsom cisplatin. Endvidere p53 inducerer apoptose og regulerer frigivelse af cytochrom

c

, ikke blot ved at modulere transkription af BH3-only protein (f.eks PUMA og NOXA), men også gennem en transskription-uafhængig mekanisme, der involverer den direkte translokation af p53-protein til mitochondrierne efterfulgt af inhibitoriske vekselvirkninger med BCL-2 og Bcl-XL [13], [17], [18].

BIM er også et medlem af BH3-only familie af pro-apoptotiske proteiner og udtrykkes i en lang række væv [19], [20]. Som bestemt ved Western blot-analyse, de fleste væv udtrykker en fremherskende isoform af BIM, betegnet BIM-EL [21]. Efter en apoptotisk stress begivenhed, BIM translocates til mitokondrierne og initierer det mitokondrielle celledød pathway ved enten direkte aktivering BAX-lignende proteiner eller indirekte bindende pro-overlevelse BCL-2 familiemedlemmer, derved frigøre BAX-lignende proteiner [22], [23]. Bax-proteinet er påvist at modulere apoptose i ovariecancerceller [2], [13]. Men effekten af ​​BIM på cisplatin-følsomme og resistente ovariecancerceller er ikke blevet grundigt belyst.

De seneste rapporter har indikeret, at AKT er en vigtig faktor for cisplatin følsomhed i æggestokkene cancerceller. AKT fremmer celleoverlevelse, undertrykker apoptose og regulerer cisplatin følsomhed i ovariecancerceller [10] – [13]. Desuden AKT, også kendt som proteinkinase B eller Rac [11], er en inaktiv cytosolisk protein. AKT rekrutteres til plasmamembranen og aktiveres ved phosphorylering på threonin 308 og serin 473 som reaktion på vækstfaktorer eller cytokiner [2], [10], [11], [24]. Molekylet er ansvarlig for rekruttering af AKT til cellemembranen, samt dets aktivering, er den phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K) [2], [11]. Både PI-3K og AKT ofte aktiveret og /eller overudtrykt i ovariecancer [2], [11], [13], [25]. Ved aktivering, AKT phosphorylerer flere molekyler involveret i reguleringen af ​​apoptose, såsom pro-apoptotiske proteiner BAD, BIM og caspase-9 og transskription faktor FOXO3A. Dernæst p-AKT blokerer bindingen af ​​BAD eller BIM til BCL-XL, hæmmer caspase-9 protease aktivitet blokerer FOXO3A funktion og reducerer Fas ligand transskription [19], [26] – [28].

tidligere undersøgelser har også vist en modulerende rolle PI-3K /AKT signalering på BIM-ekspression. PI-3K-inhibitoren LY294002 øger BIM-ekspression i celler samtidig med en stigning i celledød [19]. Imidlertid foreslås det, at en vigtig nedstrøms effekt af LY294002 er at reducere mængden af ​​AKT i sin aktive, phosphorylerede form [2], [19]. Sammenhængen mellem reduceret AKT aktivitet og øget BIM ekspressionsniveauerne er FOXO3A, et medlem af forkhead familien af ​​transkriptionelle regulatorer, der direkte kan øge BIM ekspressionsniveauerne og inducerer apoptose i cancerceller ved overekspression [19], [29], [30]. Således opregulering af BIM-ekspression, som reguleres af LY294002, er forbundet med et tab af AKT-aktivitet og phosphorylering og en stigning i den aktive form af FOXO3A.

Selvom AKT-BIM-vejen er vigtig i kemo -sensitivity og apoptose af cancerceller, om AKT regulerer BIM aktivitet i æggestokkene cancerceller under ATO behandlingen er fortsat uklart. I vores rapport viste vi, at ekspressionsniveauet af BIM blev forøget, og at phosphorylering af AKT blev nedsat i apoptose af cisplatin-sensitive og -resistente celler efter ATO behandling. Desuden kunne nedregulering af AKT af siRNA ikke hæmme BIM-ekspression og fosforylering induceret af ATO, mens knockdown af BIM forhindrede AKT dephosphorylering i æggestokkene cancerceller. Endvidere vore resultater viste, at ATO-induceret AKT dephosphorylering er afhængig af caspase-3-medieret PP2A aktivering, som reguleres af BIM ekspression. Disse resultater antyder, at phosphorylering af AKT negativt moduleres af BIM og at BIM-medieret AKT phosphorylering er en stor molekylær begivenhed ved mediering ATO-induceret apoptose i kemo-sensitive og -resistente ovariecancerceller.

Resultater

ATO inducerer apoptose i cisplatin-følsomme og resistente ovariecancerceller

Vi først bestemmes væksthæmmende effekt af cisplatin i forskellige cisplatin-følsomme (COC1 og A2780) og resistent (COC1 /CP, A2780 /CP og OVCAR-3) humane ovariale cellelinier, som tidligere beskrevet [31]. Cellelevedygtighed blev påvist ved MTT-assayet efter 72 timers behandling. Som afbildet i figur 1A, cisplatin forårsagede en dosisafhængig reduktion af cellelevedygtighed i COC1 og A2780-celler, mens COC1 /CP, A2780 /CP og OVCAR-3 celler påviseligt udviste resistens over for cisplatin. Til undersøgelse cisplatin-induceret apoptose, blev cellerne behandlet med 5 pM cisplatin. Dernæst apoptose blev bekræftet ved en DNA-fragmentering ELISA-assay på forskellige tidspunkter. Disse resultater viste, at cisplatin effektivt induceret apoptose i cisplatin-sensitive ovarieceller, men ikke i cisplatin-resistente celler (Figur 1B). At undersøge virkningerne af ATO på apoptose i alle ovariecancerceller behandlede vi ovariecancerceller med ATO og analyseret celleapoptosen proces ved en DNA-fragmentering ELISA-assay. Vore data antydede, at ATO induceret celle apoptose i alle ovariecancerceller, uanset deres forskelle i kemo-følsomhed (figur 1C). Flow-cytometri analyse med Annexin V farvning afslørede desuden, at der ikke var nogen forskel i ATO-induceret apoptose mellem cisplatin-sensitive og resistente celler (Figur 1D).

A. Dosisafhængige virkninger af cisplatin i æggestokkene cellelinier. Celler blev udsat for cisplatin ved de angivne koncentrationer i DMEM eller RPMI-1640 med 10% FBS i 96-brønds plade i 72 timer og cellelevedygtigheden blev vurderet ved MTT-assayet. Grafer, der viser resultaterne af MTT-assayet. Alle data er afbildet grafisk som midlerne ± standardafvigelser af organerne i mindst tre uafhængige forsøg. B. Analyse af celleapoptose. Celler blev behandlet med cisplatin (5 uM) for forskellige tidsperioder. Celle apoptose blev kvantitativt detekteres af en celledød ELISA-kit. Grafer, der viser resultater af kvantitative analyser. Alle data er afbildet grafisk som midlerne ± standardafvigelser af organerne i mindst tre uafhængige forsøg. *,

P

0,05, **,

P

0,01. C. Effekt af ATO på apoptotisk død i cisplatin-sensitive og resistente celler. Celler blev dyrket i nærvær eller fravær af ATO (2 uM) for forskellige tidsperioder, derefter celleapoptose blev målt som beskrevet i Materialer og Metoder. Alle data er afbildet grafisk som midlerne ± standardafvigelser af organerne i mindst tre uafhængige forsøg. *,

P

0,05, **,

P

0,01. D. Påvisning af celleapoptose med flowcytometri analyse. COC1 og COC1 /CP-celler blev behandlet med ATO (2 uM) i 48 timer, derefter farvet med Annexin V og undersøgt ved flowcytometri. E og F. Analyser af cyt

c

frigivelse. Efter behandling med ATO for forskellige perioder blev cellerne udsat for subcellulær fraktionering. Den cytosoliske eller mitokondrie fraktioner blev immunoblottedes (30 ug protein /bane) med antistof specifikt for cyt

c

. β-Actin og Cox IV blev anvendt som et protein loading kontrol. Densitometrisk analyse af Western blots blev udført, og mængden af ​​cyt

c

blev sammenlignet med proteinet loading kontrol. For CYTO cyt

c

, relative mængde af cyt

c

fra behandlede celler (72 timer) blev oprettet som en, mens relative mængde fra ubehandlede celler (0 h) blev sat til 1 for mito CYT

c

. Data er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

For at afgøre, om mitokondrier spiller en vigtig rolle i ATO-induceret celle apoptose, frigivelse af cytochrom

c

blev opdaget af celle fraktionering analyse. Resultaterne viste, at ATO inducerede frigivelse af cytochrom

c

i en tidsafhængig måde i kemo-sensitive og resistente celler (figur 1E, F), hvilket tyder på, at ATO indleder apoptotisk celledød via mitokondriedysfunktion.

BIM er vigtigt for ATO-induceret apoptose i kemo-sensitive og -resistente ovariecancer celler

Mitokondriel dysfunktion spiller en vigtig rolle i apoptose i ovarieceller. Tidligere undersøgelser rapporteret, at ændringer i genekspressionen af ​​BCL-2-family proteiner var involveret i ATO-induceret apoptose [32], og at BH3-only proteiner var nødvendige for ATO-induceret apoptose i myelomaceller. Det er dog uklart, om BH3-proteiner kan fungere i ovariecancerceller efter ATO behandling. Derfor undersøgte vi udtryk for BCL-2-familie proteiner i cisplatin-sensitive og resistente celler efter ATO behandling. Som afbildet i figur 2A, pro-apoptotiske proteiner, såsom BAX, PUMA og NOXA, ikke blev ændret væsentligt i COC1 celler på forskellige tidspunkter efter ATO behandling. Anti-apoptotiske BCL-2 og BCL-XL proteiner udviste også ingen større ændringer. Men i modsætning til andre proteiner, ekspressionsniveauet af BIM blev markant forøget efter ATO behandling, som godtgør, at BIM var involveret i apoptotisk celledød i ovariecancerceller. I mellemtiden ATO induceret BIM ekspression ligeligt i COC1 /CP-celler (figur 2B). Lignende resultater blev også observeret i andre cellelinjer (data ikke vist). Disse resultater antyder, at BIM spiller en vigtig rolle i ATO-induceret apoptose i ovariecancerceller.

A og B. Western blots analyse af ekspressionsniveauet for BCL-2-familien protein. Tidsafhængig analyse af BCL-2 medlems ekspressionsniveauer i COC1 /CP og COC1 celler. Celler blev behandlet med ATO (2 uM) ved angivne tid, så lyseret i NP40-puffer til påvisning. p-actin blev anvendt som et protein loading kontrol. Individuelle proteinniveauer blev målt ved densitometrisk analyse af Western blots og sammenlignet med actinniveauer. Relative mængde af individuelle protein fra behandlede celler (72 timer) blev sat som 1. C. Virkning af BIM shRNA på celle apoptose. I samme forhold med A, blev celler transficeret med BIM eller Ctrl shRNA i 48 timer og derefter behandlet med eller uden ATO i 48 timer. Cellelysater blev fremstillet og undersøgt for BIM, caspase-9 og spaltes caspase-3 ved Western blot. CF omtales spaltet caspase-9. Relativ fold betyder mængde BIM i forhold til actin og Ctrl tilstand blev betragtet som 1. D. Detection effekten af ​​BIM shRNA på celledød med nukleare farvning. Celler blev transficeret med BIM eller Ctrl shRNA i 48 timer, og derefter transficerede celler blev behandlet med ATO i 48 timer. Celledød blev bestemt ved måling af celler med kondenseret og fragmenteret nukleart ved mikroskopi. Pile angiver de kondenserede, fragmenterede, smukt farvede kerner, som er kendetegnende for apoptose. Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

For at bekræfte effekten af ​​BIM på apoptose i æggestokkene cancerceller, udførte vi gendæmpning eksperimenter ved hjælp af en shRNA specifikt for BIM, der målrettet alle kendte isoformer af dets udskrift. Svarende til den afbildet i figur 2A resultat, ekspressionsniveauet af BIM var høj i kontrolvektoren-transficerede COC1 og COC1 /CP celler efter ATO behandling, mens BIM ekspressionsniveauer i celler transficeret med en BIM shRNA var relativt lav (Figur 2C) . Desuden nedregulering af BIM inhiberede caspase-9 og caspase-3-spaltning induceret af ATO. Tilsvarende ATO inducerede nuklear fragmentering og kondensation i kontrol vektor-transficerede A2780 og OVCAR-3 celler, men ikke i BIM shRNA-transficerede celler (figur 2D). Disse resultater giver yderligere bevis på, at BIM udtryk er nødvendig for ATO-induceret apoptose i æggestokkene cancerceller.

AKT signalering er involveret i celledød

Nylige undersøgelser har vist, at AKT modulerer BIM aktivering enten direkte eller indirekte [19], [33]. Desuden ATO inducerer apoptose i myelomaceller ved at sænke AKT aktivitet og ekspression i celler [34]. Baseret på ovenstående observationer, vi spekulere at AKT sandsynligvis er involveret i ATO-induceret apoptose ved at regulere BIM udtryk. Følgelig vi først måles, om AKT er involveret i ATO-induceret apoptose i ovariecancerceller. Som vist i figur 3A, ATO inducerede nedregulering af p-AKT ved Ser473 i cisplatin-sensitive COC1 celler i en tidsafhængig måde, selvom ekspressionsniveauet af total AKT protein udviste ingen ændring. Nedregulering af p-AKT induceret aktivering af caspase-9 i følsomme COC1 celler. Tilsvarende ATO inducerede reduktion af p-AKT og spaltningen af ​​caspase-9 i andre ovariecancerceller, på trods af deres forskelle i kemo-følsomhed.

A. Påvisning af AKT fosforylering, udtryk og caspase-9-aktivering. Western blot-analyse af totalt AKT, p-AKT (Ser

473) -niveauer og caspase-9-spaltning i COC1 celler. Celler blev behandlet med ATO (2 uM) på forskellige tidspunkter og lyseret i NP40-puffer til påvisning. CF omtales spaltet caspase-9. Det samme detektion blev ansat i COC1 /CP, A2780 og OVCAR-3. Disse celler blev behandlet i 72 timer, derefter lyseret og analyseret for individuelle proteinniveauer ved Western blot. p-actin blev anvendt som et protein loading kontrol. p-AKT og Akt-niveauer blev målt ved densitometrisk analyse af Western blots og sammenlignet med actinniveauer. Relative mængde af p-AKT eller AKT fra ubehandlede celler blev betragtet som 1. B. Protein niveauer af PI-3K signalvejen i ATO-behandlede celler. Celler blev udsat for lægemiddel i forskellige tidsperioder. Cellelysater blev fremstillet og undersøgt for individuelle proteinniveauer ved Western blot. Individuelle proteinniveauer blev målt ved densitometrisk analyse af Western blots og sammenlignet med actinniveauer. Relativ mængde individuelle protein fra ubehandlede celler (0 h) blev sat som 1. C. Virkninger af ATO på protein niveauer af mTOR2, herunder p-mTOR (Ser

2448and

2481), mTOR, Rictor, SIN1, i A2780 celler. Celler blev udsat for lægemiddel som beskrevet i B, og derefter cellelysater blev analyseret ved Western blot. Relative mængde af proteinniveauer blev fastsat som beskrevet i B. Cellelysater blev analyseret ved western blot. Relative mængde af proteinniveauer blev fastsat som beskrevet i B. D. Beskyttende virkning af konstitutiv AKT på ATO-induceret apoptose i ovarieceller. OVCAR-3 og A2780-celler blev transficeret med konstitutiv Akt1- og blev udvalgt til 8 uger ved G-418 og behandlet med ATO i 72 timer. Cellerne blev lyseret og undersøgt for individuelle proteinniveauer ved Western blot.

Venstre,

protein niveauer af p-AKT (Ser

473) og AKT (Akt1) i både Ctrl eller AKT vektor transficeret OVCAR-3 og A2780 celler blev opdaget. Relativ mængde protein niveauer blev fastsat som beskrevet i B. p-AKT og AKT-niveauer af Akt1- transficeret A2780 celler blev betragtet som 1.

Right,

analyse af apoptose i Ctrl eller Akt1 vektor transficeret OVCAR-3 og A2780 celler. Celle apoptose blev kvantitativt detekteres af en celledød ELISA-kit som beskrevet i Materialer og Metoder. Alle data er afbildet grafisk som midlerne ± standardafvigelser af organerne i mindst tre uafhængige forsøg. **,

P

0,01. E. Detektion af den rolle, LY294002 på apoptose af celler. Celler blev behandlet med ATO og /eller 25 pM LY294002 i 72 timer, og derefter blev cellerne lyseret og undersøgt for individuelle proteinniveauer ved Western blot.

Venstre,

protein niveauer af p-AKT (Ser

473) og total AKT i COC1 celler blev opdaget. Celle apoptose blev kvantitativt detekteres af en celledød ELISA-kit. Relativ mængde protein niveauer blev fastsat som beskrevet i B. p-AKT og AKT niveauer fra ubehandlede celler blev sat som 1.

Right,

analyse af apoptotiske celler som beskriver i materialer og metoder. Alle data er afbildet grafisk som midlerne ± standardafvigelser af organerne i mindst tre uafhængige forsøg. **,

P

. 0,01

Vi analyserede derefter ekspressionsniveauerne af opstrøms PI-3K signalering proteiner, som kan påvirke p-AKT niveauer i æggestokkene kræftceller. Som vist i figur 3B, niveauer af PI-3K pathway proteiner, herunder p85 (den regulatoriske subunit af PI-3K), PTEN og PDK1 blev ikke ændret signifikant efter ATO behandling for forskellige tidsperioder i COC1 /CP celler. Nylige undersøgelser tydede på, at pattedyr mål for rapamycin 2 (mTORC2) eller Rictor protein var ansvarlig for aktivering af p-AKT på Ser473 [35], [36], og udtømningen af ​​underenheder af intakt mTORC2, såsom SIN1, afskaffet AKT phosphorylering ved Ser473. Desuden Ser2448 på mTOR var en AKT fosforylering websted, og phospho-Ser2481 var en markør for mTORC2 komplekser [35], [37]. Vores data viste, at protein niveauer af mTOR kompleks 2, herunder phospho-mTOR (ved Ser 2481 og 2448), blev mTOR, Rictor og SIN1 ikke ændret væsentligt i A2780 celler efter udsættelse for ATO på forskellige tidsperioder (Figur 3C). Disse resultater antyder, at disse proteiner har ingen effekt på p-AKT niveau.

For at validere, om AKT signalering er en vigtig molekylært mål ansvarlig for ATO-induceret apoptose, transficerede vi en konstitutivt aktiv Akt1- gen i OVCAR-3 og A2780 celler og undersøgt deres respons på ATO behandling. Som vist i figur 3D, OVCAR-3 og A2780-celler transficeret med Akt1 udviste indlysende modstand mod ATO-induceret apoptose.

Desuden har vi brugt LY294002, en PI-3K-inhibitor, til at inhibere phosphoryleringen af ​​AKT ved opstrøms signalmolekyler og undersøgt den pro-apoptotiske effekt af ATO i ovariecancerceller. Vi fandt, at ATO alene elimineret p-AKT og induceret apoptose mens LY294002 alene ikke var tilstrækkelig til at inducere apoptose, selvom det delvist reduceret p-AKT. Yderligere forsøg viste sig, at kombinationen af ​​LY294002 og ATO fuldstændig elimineret p-AKT og forbedret induktion af apoptose i COC1 celler (figur 3e). Vores data indikerer, at virkningen af ​​kombinationen af ​​LY294002 og ATO på p-AKT og apoptose er større end den for LY294002 alene, og at AKT signalvejen er involveret i ATO-induceret apoptose i ovariecancerceller.

BIM-regulerede AKT fosforylering i celle apoptose

AKT medierer BIM aktivering via to primære veje: (1) AKT phosphorylerer BIM direkte og hæmmer BIM aktivering [19], [33], eller (2) AKT phosphorylerer FOXO3A , hvilket fører til dens cytoplasmatiske tilbageholdelse af 14-3-3-proteiner. Derved AKT kunne ikke translokere ind i kernen for at inducere BIM transkription, hvilket betyder, at AKT regulerer BIM aktivering indirekte. På grundlag af disse bemærkninger, besluttede vi at undersøge, om AKT påvirker BIM aktivering i æggestokkene cancerceller. Vi først nedreguleret ekspression af Akt1- af siRNA i ATO-behandlede A2780 og OVCAR-3 celler og fandt, at nedregulering af AKT øget caspase-3 og PARP-spaltning under ATO behandling. Imidlertid AKT nedregulering havde ringe virkning på BIM-ekspression, selvom AKT nedregulering steget til en vis grad, ATO-induceret nuklear fragmentering og fulgte celle apoptose (figur 4A). Lignende resultater blev også fundet i ATO-behandlede ovariecancer celler, når FOXO3A ekspression blev nedreguleret ved hjælp siRNA’er rettet mod FOXO3A (figur 4B). Disse resultater antyder, at AKT pathway ikke kan være involveret i regulering BIM ekspression under ATO-induceret apoptose.

A. Virkning af AKT siRNA på BIM-ekspression. Celler blev transficeret med enten kontrol siRNA eller Akt1 siRNA i 48 timer og derefter blev udsat for ATO i 72 timer. Cellerne blev lyseret og undersøgt for individuelle proteinniveauer ved Western blot. CF omtales spaltet PARP. p-actin blev anvendt som et protein loading kontrol.

Op, Salg proteinniveauer af AKT, BIM, spaltet caspase-3 og PARP blev påvist ved Western blot. Relative mængde af individuelle proteinniveau blev indstillet som beskrevet i figur 3B. p-AKT og AKT niveauer af Ctrl siRNA transficeret og behandlet A2780 celler blev betragtet som 1.

Ned,

analyse af apoptotiske celler. som beskrevet i Materialer og Metoder. Alle data er afbildet grafisk som midlerne ± standardafvigelser af organerne i mindst tre uafhængige forsøg.

P

0,05 (ikke signifikant). B. Virkning af FOXO3A siRNA på BIM-ekspression og celleapoptose. Celler blev transficeret med enten kontrol siRNA eller FOXO3A siRNA i 48 timer og derefter blev udsat for ATO i 72 timer.

Op,

Efter transfektion i 48 timer blev Immunblot for BIM og FOXO3A proteinekspression udføres på helcellelysater. Relative mængde af individuelle proteinniveau blev indstillet som beskrevet i figur 3B. FOXO3A og BIM niveauer af Ctrl siRNA transficeret COC1 celler blev betragtet som 1.

Ned,

protein niveauer af BIM, cytosolen cyt

c

og PARP blev analyseret ved Western blot i FOXO3A siRNA OVCAR-3 celler. For cyt

c

afsløring blev celler behandlet efter Figur 1E. Som beskrevet i figur 3B, relative mængde af BIM og cyt

c

i ATO behandlede celler (72 h) blev betragtet som 1. C. Virkning af AKT på BIM phosphorylering. Celler blev metabolisk mærket med [

32P] orthophosphorsyre og behandlet med ATO (2 uM) i 48 timer, og BIM blev immunpræcipiteret ved anvendelse af en agarose-konjugeret BIM-antistof, derefter påvisning af phosphorylering af BIM. Phosphorylering af BIM blev bestemt ved autoradiografi (øvre panel). Western blot-analyse blev udført for at bekræfte og kvantificere BIM-protein (nederste panel).

Venstre,

effekten af ​​LY294002 på BIM fosforylering. Celler blev behandlet med ATO og /eller LY294002 (25 uM), og derefter påvisning af BIM-ekspression og phosphorylering. Som beskrevet i figur 3B, blev relative mængde af

32P-BIM og BIM i ATO behandlede celler anses for 1.

Højre,

virkningen af ​​AKT siRNA på BIM phosphorylering. Celler blev transficeret med enten kontrol siRNA eller Akt1 siRNA i 48 timer og derefter blev udsat for ATO i 48 timer. Påvisning af BIM-ekspression og phosphorylering som beskrevet. Relativ mængde

32p-BIM og BIM i AKT transficeret og ATO behandlede celler blev sat som 1. D. Effekt af BIM shRNA på AKT fosforylering. Celler blev transficeret med enten kontrol shRNA eller BIM shRNA i 48 timer og derefter blev udsat for ATO i 48 timer. Western blot undersøgt BIM-ekspression, caspase-3-spaltning, proteinniveauer af p-AKT (Ser

473) og AKT i celler. Relativ mængde af p-AKT, AKT og BIM i Ctrl shRNA transficeret og ATO behandlede celler blev sat som 1. Alle data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

For at opdage BIM fosforylering under apoptose, A2780 og COC1 /CP-celler blev metabolisk mærket med [

32P] orthophosphorsyre og behandlet med ATO i 48 timer, og phosphorylering af BIM blev analyseret ved autoradiografi. En tidligere rapport viste, at BIM induktion og phosphorylering steg i apoptose [38]. Vore undersøgelser har også undersøgt BIM phosphorylering og øget BIM-ekspression efter ATO behandling. Vores data viste desuden, at AKT nedregulering af siRNA eller en AKT-inhibitor (LY294002) ikke kunne falde BIM fosforylering i kemo-sensitive og resistente celler efter ATO behandling (figur 4C). Disse resultater viste, at AKT inaktivering havde lidt til ingen effekt på BIM phosphorylering og foreslog, at AKT ikke kunne regulere BIM aktivering og at andre potentielle mekanismer vedrørende reguleringen af ​​BIM aktivering kan eksistere.

Men vores yderligere data indikeret, at knockdown af BIM hæmmede AKT dephosphorylering og caspase-3 spaltning i kemo-følsomme og resistente ovariecancer celler (Figur 4D). Disse resultater antyder, at ATO-induceret BIM-ekspression forhindrer phosphoryleringen af ​​AKT, hvilket indikerer, at BIM regulerer AKT aktivering under ATO stimulation i ovariecancerceller.

BIM regulerer AKT dephosphorylering af caspase-3-aktivitet

tidligere rapporter indikeret, at AKT blev dephosphoryleret ved både Thr308 og Ser473 og inaktiveres in vitro ved proteinphosphatase 2A (PP2A), hvilket dannede et kompleks med AKT. AKT blev aktiveret i celler efter behandling med PP2A-inhibitorer, såsom okadainsyre (OA) [39], [40]. For nylig blev det rapporteret, at caspase-3 regulerede phosphoryleringen af ​​AKT gennem spaltning af den regulerende A-underenhed af PP2A (PP2A /A), som steg PP2A-aktivitet [39]. Vores resultater viste, at BIM er involveret i reguleringen af ​​caspase-3 og AKT aktivering (figur 4D). Derfor foreslår vi, at BIM kan regulere AKT phosphorylering med caspase-3-medieret PP2A aktivering i æggestokkene celler.

For at validere vores hypotese, vi først afgøres, om PP2A medieret AKT fosforylering i vores undersøgelse. Forbehandling af cellerne med OA, en inhibitor af PP2A, resulterede i en gradvis tilbageførsel af ATO-induceret AKT dephosphorylering på en dosis-afhængig måde i COC1 /CP-celler (figur 5A). Samtidig, OA også reddet AKT-phosphorylering i A2780 og OVCAR-3 celler under ATO behandling.

A. Forskellige celler blev præinkuberet med angivne koncentrationer af OA i 1 time og eksponeret for ATO i 48 timer, derefter lyseret i NP40-puffer til påvisning. Western blot-analyse af totalt AKT og p-AKT (Ser

473) niveauer blev vist. p-actin blev anvendt som et protein loading kontrol. Relative mængde af p-AKT og AKT i ubehandlede celler blev sat som 1. B. Analyse af virkningen af ​​caspase-3 på PP2A aktivering.

Op

, Celler blev præ-inkuberet med angivne koncentrationer af DEVD-CHO i 1 time og eksponeret for ATO i 48 timer, derefter lyseret i NP40-puffer til påvisning. Western blot-analyse af totalt AKT og p-AKT (Ser

473) niveauer blev vist. Relative mængde af p-AKT og AKT i ubehandlede celler blev sat som 1.

Mellemøsten

blev de behandlede celler lyseret med prøvepuffer og underkastet immunoblot assay med en A-underenhed-specifikt anti-PP2A /A antistof. CF betegnes spaltet PP2A /A. Membranen blev derefter strippet og testet igen med en C-underenhed-specifikt anti-PP2A /C-antistof. Relative mængde af PP2A /C i ubehandlede celler (0 h) blev sat til 1.

Down

, Western blot-analyse af virkningen af ​​DEVD-CHO (100 uM) i PP2A spaltning. C. Påvisning af PP2A-aktivitet. Celler blev præ-inkuberet med eller uden 0,2 uM OA eller 100 uM af DEVD-CHO i 1 time og eksponeret til lægemiddel i 48 timer. *,

P

0,05.