PLoS ONE: Stathmin Protein Level, en Potentielle Predictive Marker for taxan Behandling respons i Endometrie Cancer

Abstrakt

Stathmin er en prognostisk markør i mange kræftformer, herunder endometriecancer. Prækliniske undersøgelser, overvejende brystkræft, har foreslået, at stathmin derudover kan være en prædiktiv markør for respons på paclitaxel. Vi først vurderet respons på paclitaxel i endometriecancer cellelinier før og efter stathmin knock-down. Efterfølgende undersøgte vi det kliniske respons på paclitaxel kemoterapi i metastatisk endometriecancer i forhold til stathmin proteinniveau i tumorer. Stathmin niveau blev også bestemt i metastatiske læsioner, analysere ændringer i biomarkør status på sygdomsprogression. Knock-down af stathmin forbedret følsomhed over for paclitaxel i endometrie karcinom cellelinjer med både naturligt højere og lavere følsomhed over for paclitaxel. I kliniske prøver, blev højt stathmin niveau demonstreret at være forbundet med dårlig respons på paclitaxel indeholder kemoterapi og til reduceret sygdomsspecifikke overlevelse kun hos patienter behandlet med en sådan kombination. Stathmin niveau steg betydeligt fra primær til metastatiske læsioner. Denne undersøgelse tyder på, støttet af både prækliniske og kliniske data, der kunne stathmin være en prædiktiv biomarkør for respons på paclitaxel behandling i endometriecancer. Re-vurdering af stathmin niveau i metastaselæsioner før behandlingen starter, kan være relevant. Desuden vil validering i et randomiseret klinisk forsøg være vigtigt

Henvisning:. Werner HMJ, Trovik J, Halle MK, Wik E, Akslen LA, Birkeland E, et al. (2014) Stathmin Protein Level, en Potentielle Predictive Marker for taxan Behandling respons i endometriecancer. PLoS ONE 9 (2): e90141. doi: 10,1371 /journal.pone.0090141

Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal

Modtaget: Oktober 11, 2013; Accepteret: 21 januar 2014; Publiceret: 25 feb 2014

Copyright: © 2014 Werner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Helse Vest , Norges Forskningsråd (803.100, 805.797) og Den norske Cancer Society (Harald Andersens legat) støttede denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne rapporterer følgende konflikter: Universitetet i Bergen /Haukeland Universitetshospital /Dana Farber cancer Institute /Harvard gennem BTO (Bergen Teknologioverføring AS): Nogle aspekter vedrørende STMN1 som prognostisk og prædiktiv markør for endometriecancer er genstand for verserende intellektuelle ejendomsrettigheder (US 12 /962.946). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse af PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Stathmin1 (STMN1 herefter angivet som “stathmin«) er en 18 kD cytosoliske phosphoprotein, kendt spiller en vigtig rolle i cellecyklussen. Stathmin udtrykkes i alle væv. Det er en kritisk regulator af mikrotubulusdynamik gennem sine mikrotubulus destabiliserende egenskaber, herunder både forebyggelse af polymerisation og aktiv fremme af mikrotubulusdepolymerisation [1] – [4]. Phosphorylering af stathmin på fire serinrester i begyndelsen af ​​den mitotiske fase dæmper dens destabiliserende aktiviteter, så at cellerne danner en mitosespindelen; defosforylering så sker forud for afgangen af ​​mitose [1], [4]. Stathmin er også involveret i intracellulær transport, cellemotilitet, polaritet, vedligeholdelse af celleform og regulering af apoptose [1].

En biomarkør defineres som en “egenskab, der objektivt måles og vurderes som en indikator for normal biologiske processer, patogene processer eller farmakologiske reaktioner på en bestemt terapeutisk intervention [5]. Biomarkører kan opdeles i forskellige typer, såsom prognostisk; forbundet med prognosen for en patient uafhængig af behandlingen, og prædiktive biomarkører; at identificere patientens subpopulationer mest sandsynlige til (ikke) reagere på en behandling [5]. Således pålidelige prædiktive biomarkører er af afgørende betydning for en forbedret og individualiseret behandling

Stathmin er opreguleret i mange solide cancerformer, herunder endometriecancer [1], [6] -. [14], og dens opregulering har været forbundet med klinisk-patologiske variabler af aggressiv sygdom såsom øget risiko for lymfeknude metastaser [9], [15] og dårlig overlevelse [6], [9], [10], [12], [13], [16], bekræfter stathmins rolle som prognostisk biomarkør.

i øjeblikket er få prædiktive markører kendt i humane kræftformer og endnu mindre er klinisk anvendt. I endometriecancer ingen klinisk validerede prædiktive markører er endnu tilgængelige [17]. Både målrettede behandlinger og konventionelle kemoterapeutiske midler er kun effektive i en undergruppe af patienter [18], [19], er der derfor et presserende behov for at identificere klinisk nyttige prædiktive markører. Eksempler indarbejdet i klinikken omfatter

KRAS

mutationsstatus indikerer respons på cetuximab og panitumumab i kolorektal cancer [18], [20], [21], ALK re-arrangement i ikke-småcellet lungekræft forudsige respons på crizotinib [18], [20], [22] og HER2 /Neu forstærkning eller overekspression i brystkræft for berettigelse til trastuzumab behandling [18], [20], [23].

Taxaner er en gruppe af kemoterapeutiske midler, der ofte anvendes til behandling af endometrisk carcinoma. Prækliniske studier i bryst- og prostatakræft og retinoblastoma [24] – [28] giver prækliniske tegn på, at stathmin kan være en prædiktiv markør for respons på taxaner i disse kræftformer. Høje niveauer af stathmin faldt følsomhed brystcancercellelinier til paclitaxel og vincristin [24] og knock-down af stathmin af siRNA øget følsomhed over for paclitaxel i både bryst [25] og prostata celler [27]. Denne effekt af stathmin proteinniveau på behandlingsrespons var begrænset til anti-mikrotubuli midler. Desværre har ingen af ​​disse undersøgelser har taget denne viden til et næste niveau, integrerer sammen med kliniske data. I endometriecancer til vores viden ingen undersøgelser, prækliniske eller kliniske, har udforsket en sammenhæng mellem stathmin niveau og respons på paclitaxel kemoterapi. I denne rapport, vi demonstrere i endometrie karcinom cellelinjer, at reduktion af stathmin niveauer ved stathmin knock-down resulterer i forbedret respons på paclitaxel. Vi viser også for første gang til vores bedste overbevisning, er, at stathmin protein niveau er forbundet med respons på paclitaxel indeholder terapi i kliniske prøver fra patienter med metastatisk endometrie karcinom.

Materialer og metoder

cellelinier

To endometriecancer cellelinjer blev valgt på grund af forskellen i deres følsomhed profil for paclitaxel; Ishikawa (Sigma, følsom) og Hec1B (American Type Culture Collection, reduceret følsom). Kræftcellen Linje Encyclopedia (CCLE) data bekræfter forskellen i følsomhed [29]. Linjerne blev opnået i 2009 og ægthed verifikation ved kort tandem repeat (STR) profilering blev udført i 2012 [30], [31]. Cellelinjerne blev opretholdt under betingelserne anbefalet af leverandøren.

Cell transfektion Salg

Celler blev dyrket til 50-70% konfluens forud for transfektion ved lentiviral transduktion (Open Biosystems, GIPZ lentiviral shRNAmir) . En GIPZ lentiviral shRNA målgenet sæt med 3 (V3LHS_411977, V2LHS_62940, V3LHS_383505) ved MOI 2.5 blev brugt. En ikke-silencing GIPZ lentiviral shRNAmir kontrol (BV17110_2.80 × 10 8) blev anvendt som kontrol. Celler blev udvalgt med puromycin (1 pg /ml) efter transfektion.

Narkotika

Paclitaxel og carboplatin blev købt fra Sigma.

cellelinje eksperimenter

cellelinierne blev behandlet med paclitaxel i stigende koncentrationer (interval 1-500 nM) i 24 timer. Som klinisk taxaner ofte kombineres med platin derivater i endometriecancer, vi også behandlede celler med en kombination af paclitaxel (i stigende koncentrationer (interval 1-500 nM) og carboplatin (fast koncentration, 200 mM) i 24 timer for at observere eventuel synergistisk behandling . virkninger Celler blev efterfølgende enten fikseret i 2% formaldehyd til mikroskopisk evaluering af apoptose; anvendes i et proliferationsassay (MTS) eller behandles til immunblotting Eksperimenter blev mindst udført tredobbelt

til vurdering af apoptose, ved.. mindst 150 celler blev talt i tre forskellige områder i 96-brønds plader. For proliferationsassays blev udført eksperimenter in triplo i 96-brønds plader. assays blev udført med CellTiter 96® AQ

ueous One Solution celleproliferationsassay (Promega) at følge instruktionerne fra fabrikanten. absorbansen blev registreret ved 490 nm med en ELISA-pladelæser (TECAN Magellan Sunrise).

Immunoblots blev udført ifølge en standardprotokol. Kort sagt blev celler dyrket og behandlet i 6-brønds plader og høstet i lysisbuffer efter 24 timers paclitaxel-behandling. Proteiner (25 ug) blev separeret ved SDS /PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (Biorad, Norge). Stathmin og /eller (spaltes) PARP blev påvist ved anvendelse spaltet PARP (Asp214) (D64E10) (# 5625Cell Signaling), fortyndet 1:1000 og stathmin (# 3352, Cell Signaling), fortyndet 1:1000; β-actin tjente som en loading kontrol (anti β-actin-antistof (AC-15) (ab6276) ABCAM), fortyndet 1:10000. Alkalisk phosphatase konjugerede sekundære antistoffer blev anvendt (Anti-kanin IgG (Sigma Aldrich A3687): Anti-mus IgG (Sigma Aldrich A3562)). Og chemoluminiscence substrat (lumiphos 34150 WB, Thermo videnskabelig) til påvisning

Patient serie Salg

Patienter diagnosticeret med og behandlet for endometriecancer ved Haukeland Universitetshospital, Bergen, Norge, er efter undertegnelsen informeret samtykke, fremadrettet og fortløbende i en database (population baseret indstilling) fra og med 2001, hvilket forhindrer selektionsbias og sikre optimal samling for alle patienter data, som tidligere rapporteret [14]. Patienterne er dog blevet behandlet efter rutinemæssige retningslinjer og de kliniske prøver undersøgte består derfor af prospektivt indsamlet arkivering væv. Klinisk-patologisk indsamlede data omfatter blandt andet FIGO 2009 etape, histologisk undertype, klasse, primær og adjuverende behandling, og opfølgning, herunder behandling for metastatisk sygdom. Med henblik på denne undersøgelse, patienter, som fik paclitaxel kemoterapi (som en rutine i vores hospital en kombination af paclitaxel og carboplatin) efter kirurgisk behandling til enten residual sygdom eller metastaser inden april 2011, blev undersøgt til behandling reaktion i henhold til RECIST kriterier [ ,,,0],32], med sidste opfølgende post juli 2013. af i alt 607 patienter i databasen, hvoraf 121 havde systemisk dvs. tilbagevendende eller residual sygdom, 57 havde respons data i henhold til RECIST-kriterierne rådighed; 33, der blev behandlet med paclitaxel indeholder kemoterapi. Vi definerede god respons så komplet eller delvis respons (RECIST kriterier), og dårlig respons som statisk sygdom eller sygdomsprogression (RECIST kriterier). Derudover kiggede vi på sygdomsspecifikke overlevelse i forhold til stathmin niveau for alle patienter med endometriecancer og specifikt for patienter behandlet for metastatisk sygdom. Den gennemsnitlige opfølgning i vores kohorte var 34 måneder (interval 0-105 måneder).

Tissue microarray (TMA) konstruktion

TMA s blev genereret som tidligere beskrevet og valideret i adskillige undersøgelser [33 ]. Arealet af højeste tumor aggressivitet blev identificeret på alle hematoxylin /eosin objektglas for at sikre tumor repræsentative og tre (primær tumor) eller en (metastase) vævscylinderne (0,6 mm diameter hver) blev monteret i en modtagerblok anvendelse af en skræddersyet præcisionsinstrument ( Beecher instrumenter, Silver spring, MD, USA). Formalin fast paraffin indstøbt (FFPE) primær tumor væv var til rådighed i TMA’er fra 603 patienter til evaluering af stathmin niveau. Fra 77 patienter med metastaser, ekstra metastatisk væv var tilgængelige i TMA’erne til undersøgelse af stathmin niveau sammenlignet med den tilsvarende primære tumor. Alt for få tilfælde havde yderligere evaluerbare metastatiske læsioner, opnået før paclitaxel indeholder kemoterapi, til evaluering stathmin niveau, med respons data ifølge kriterierne RECIST og en lignende tidligere behandling profil (n = 3) for at tillade meningsfulde statistiske analyser af respons i relation til biomarkør status i metastatiske læsioner.

Immunhistokemi

5 um tykke TMA sektioner blev afvokset med xylen /ethanol. Antigen genfinding blev gjort ved mikrobølge i TRS pH 6 (S1699 Dako Target Retrieval Solution) i 20 minutter. Objektglas blev blokeret i peroxidase (Dako S2023) i 8 minutter og inkuberet i 60 minutter med stathmin (celle signalering # 3352), fortyndet 1:50. EnVision + systemet, blev HRP sekundært antistof (Dako K4011), der anvendes, efterfulgt af DAB + kromogen (DAKO K4011) som detection system. Slides blev modfarvet med hæmatoxylin (Dako, S2020).

Farvning evaluering

Blinded for patientkarakteristika og resultatet blev objektglassene scoret af to forfattere (HMJW og JT) ved hjælp af standard lysmikroskopi som tidligere beskrevet [34], [35]. Den kappa værdi, som et mål for reproducerbarhed, var 0,73 i et separat sæt 68 slides scoret individuelt af HMJW og JT. Høj proteinniveau blev defineret som den øvre kvartil, score 9, i overensstemmelse med tidligere publikationer [15]. I tilfælde af flere metastaser med variation i stathmin niveau, læsionen med højeste niveau defineres det endelige score for metastatiske læsioner.

Statistik

Statistiske analyser blev udført ved hjælp PASW18 Statistik (Predictive Analysis Software, SPSS inc. Chicago, USA). Kategoriske variabler blev vurderet ved anvendelse af Pearson χ2-test eller Fisher eksakt hvor det er relevant. To-sidet P-værdier for 0,05 blev anset for signifikante. Univariate analyser af tid fra primær behandling til døden på grund af endometrisk carcinoma (sygdomsspecifikke overlevelse) blev udført under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Cox proportionel risiko metode blev brugt til en multivariat overlevelsesanalyse (proportionalitet antagelse kontrolleret af log minus log plot).

Etik erklæring

Alle patienter har underskrevet informeret samtykke forud for inklusion i studiet. Undersøgelsen er godkendt af det norske Datatilsynet (961.478-2), de norske Samfundsvidenskabelige Data Services (15501) og den lokale Institutional Review Board (regionale udvalg for medicin og sundhed Etik; REKIII nr 052.01)

Resultater

reaktion på paclitaxel i endometrie cancer cellelinjer

svar på paclitaxel varierer mellem endometriecancer cellelinjer [29], [36], [37]. Vi viser Ishikawa-celler er følsomme over for paclitaxel behandling med en høj procentdel af apoptotiske celler efter 24 timers behandling (mikroskopisk tælling og proliferationsassay) i modsætning til Hec1B celler (fig. 1A og 1B). Kombinationsbehandling af carboplatin og paclitaxel ikke resulterede i synergistisk behandlingseffekt (ikke vist)

A:. Mikroskopisk evaluering af apoptose i Ishikawa og Hec1B vildtypeceller efter behandling med paclitaxel i følgende doseringer: 0 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM og 500 nM. Resultater er repræsentative for 5 uafhængige eksperimenter. Standardfejl af middelværdien er vist. B: Cell metaboliske aktivitet vurderes med en proliferationsassay (MTS, Promega) i Ishikawa og Hec1B vildtypeceller efter behandling med paclitaxel i følgende doseringer: 0 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM og 500 nM. Resultaterne er repræsentative for tre (Ishikawa) og 2 (Hec1B) uafhængige forsøg.

Stathmin knock-down af viral transfektion

Fluorescens mikroskopi viste en transfektion på 70-80% ved starten af ​​eksperimenterne, med markant reducerede stathmin niveauer i stathmin knock-down cellelinier i sammenligning med kontrolgruppen knock-down og vildtype cellelinjer (fig 2a og 3a.)

A:. Immunblot efter transfektion celler med et stathmin lentiviral shRNAmir ( »stmn kd«) eller et ikke-silencing kontrol ( “ikke sil«) samt den parentale cellelinje (vildtype; »WT«). Blots blev farvet for stathmin, og β-actin til lastning kontrol. B: Ishikawa vildtype-cellelinje, ikke-nedregulering og stathmin knock-down efter behandling med paclitaxel i 24 timer i følgende doseringer: 0 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM og 500 nM. Niveauet for fragmentering af cellerne er angivet i en indsats, som en proxy for progression i apoptotiske proces. diamanter; vildtype, trekanter; ikke-tavshed og krydsninger; stathmin knock-down celler. C: Immunblot af Ishikawa vildtype, kontrol (ikke-nedregulering) og stathmin knock-down cellelinier efter behandling med paclitaxel i 24 timer i følgende doseringer: 0 nM, 100 nM og 250 nM. Blottet blev farvet for spaltet PARP og stathmin, med β-actin tjener som ladningskontrol. D: Venstre: Ishikawa vildtype ( »WT«) cellelinie og højre: Ishikawa stathmin knock-down ( ‘Stmn kd «) cellelinie. Mikroskopiske billeder af celler efter behandling i 24 timer med 0 nM (øverste række) eller 500 nM (nederste række) paclitaxel også demonstrere øget fragmentering sats for de stathmin knock-down Ishikawa-celler (højre nedre panel) sammenlignet med vildtype (venstre lavere panel)

a:. Immunblot efter transfektion af celler med en stathmin lentiviral shRNAmir ( ‘stmn kd «) eller et ikke-silencing kontrol (” ikke sil «) samt den parentale cellelinje (wild -type «WT«). Blots blev farvet for stathmin, og β-actin til lastning kontrol. B: Hec1B vildtype-cellelinje, ikke-nedregulering og stathmin knock-down linjer, efter behandling med paclitaxel i 24 timer i følgende doseringer: 0 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 250 nM og 500 nM. C: Venstre: Hec1B vildtype ( »WT«) cellelinie og højre: Hec1B stathmin knock-down ( ‘Stmn kd «) cellelinie. Viser mikroskopiske billeder af celler efter behandling i 24 timer med 0 nM (øverste række) eller 500 nM (nederste række) paclitaxel demonstrerer øget celledød for stathmin knock-down Hec1B celler (højre nedre panel) sammenlignet med Hec1B vildtype (venstre nederste panel).

I begge stathmin knock-down cellelinier (Ishikawa og Hec1B), blev observeret forbedret respons på paclitaxel behandling (fig. 2b og 3b). Hec1B celler viser en statistisk signifikant øget apoptotisk sats efter stathmin knock-down. Muligvis på grund af den iboende højere følsomhed over for paclitaxel i Ishikawa-celler, knock-down resulterede ikke i en tilsvarende stor stigning i celledød. Men vi bemærkede en klart øget fragmentering sats i de behandlede stathmin knock-down Ishikawa-celler i modsætning til de kontrol celler, der kan betragtes som et tegn på yderligere aktivering af apoptosecyklus (indsæt fig. 2b). Brug af immunoblot, forsøgte vi at yderligere validere denne styrkede apoptosecyklus aktivering demonstrerer PARP-spaltning ved en lavere paclitaxel koncentration for Ishikawa efter stathmin knock-down sammenlignet med kontroller (Fig. 2c). Mikroskopiske billeder af Ishikawa og Hec1B vildtype og stathmin knock-down celler efter 24 timer paclitaxel behandling med 0 nM (kontrol) og 500 nM er vist i figurerne 2d og 3c. Vi testede effekten af ​​stathmin knock-down på følsomheden over for carboplatin monoterapi og paclitaxel-carboplatin multikombinerbare behandling uden iagttagelse øget følsomhed eller synergistiske virkninger (ikke vist).

Høj stathmin niveau forudsiger dårlig respons på paclitaxel i kliniske prøver

Vi derefter undersøgte patient tumorprøver at se, om der kunne observeres en lignende sammenhæng mellem stathmin niveau og behandlingsrespons. Stathmin farvning var overvejende cytoplasmatisk, som rapporteret i litteraturen [15], [38]. Repræsentative billeder fra immunhistokemi med svag (normal) og stærk (høj) stathmin-farvning er vist i figur 4a. Eksklusive metastatiske patienter, der får anti-hormonbehandling kun, patienter med metastatisk sygdom fik paclitaxel kemoterapi havde lignende klinisk-patologiske karakteristika som patienter, der behandles forskelligt. Herunder patienter behandlet med anti-hormonelle lægemidler kun, overvejende svagelige ældre patienter, klinisk-patologiske karakteristika stadig var ens, bortset fra at denne undergruppe var væsentligt ældre (tabel 1). Patienter med normal stathmin niveau klart reageret meget bedre (RECIST kriterier) til behandling end patienter med forhøjet stathmin niveau (fig. 4b). Stathmin niveau ikke forudsige respons på andre kemoterapi eller behandlingsmodaliteter

A:. Billeder repræsentative for svag immunhistokemisk stathmin farvning (øverst) og stærk (høj eller patologisk) stathmin farvning (nederst) i endometriecancer. Bars (højre nederste hjørne) foranstaltning 40 um. B: Klinisk respons på paclitaxel for alle endometrialcarcinom patienter med evaluerbare sygdom henhold til RECIST-kriterierne og adskilt for normal versus højt stathmin niveau. Dårlig respons (RECIST: statisk sygdom eller sygdomsprogression) anført i blå, god respons (RECIST: komplet eller delvis respons) angivet med rødt. C:. Sammenligning af høj (patologisk) stathmin proteinniveau i primære og metastatiske læsioner

Nærmer fra en anden vinkel, generelt, patienter med forhøjet stathmin niveau viste en reduceret sygdomsspecifikke overlevelse, på linje med stathmins rolle som prognostisk biomarkør (fig. 5a). Men inden for gruppen af ​​patienter med metastatisk sygdom behandlet med paclitaxel indeholdende kemoterapi, sygdomsspecifikke overlevelse signifikant dårligere hos de patienter med høj sammenlignet med normal stathmin (p = 0,03, Fig. 5b). Hos patienter, der fik andre behandlinger for metastatisk sygdom, prognose var relateret til stathmin niveau (p = 0,76, fig. 5c. At udelukke confounding af kendte vigtige klinisk-patologiske prognostiske variable, vi udførte en multivariat overlevelsesanalyse for begge undergrupper til at undersøge effekten af stathmin niveau på overlevelse efter behandling for metastatisk sygdom, korrigeret for FIGO stadie og histologisk undertype. Stathmin proteinniveauet forblev en selvstændig indikator for sygdomsspecifikke overlevelse i undergruppen af ​​patienter, der modtog paclitaxel kemoterapi (n = 38, HR 2.3, CI 1.1 -5,2), justeret for FIGO stadie og histologisk subtype, men ikke i undergruppen modtager andre behandlinger (n = 43, HR 1.1, CI 0,4-2,7)

A:. Alle patienter med komplette data (n = . 476) Antal sygdomsspecifikke begivenheder mellem parentes B:. Alle patienter med metastatisk sygdom, som fik paclitaxel behandling (n = 38) Antal sygdomsspecifikke begivenheder mellem parentes C:.. Alle patienter med metastatisk sygdom, der modtog forskellige behandlinger (n = 43). Antal sygdomsspecifikke begivenheder mellem parentes.

uharmonisk biomarkør status i primære og metastatiske læsioner

Andelen af ​​patienter med forhøjet stathmin niveau var signifikant højere i metastaser i forhold til primære læsioner med patologisk (høj) niveauer noteret i 18% af sidstnævnte (n = 84 af 477 primære læsioner med stathmin farvning tilgængelig) sammenlignet med 37% i metastatiske prøver (n = 29 af 79) (fig. 4c).

i de parrede primær-metastase prøver, 35% af metastatiske læsioner viste højt stathmin niveau. En uoverensstemmelse på 26% mellem metastatiske læsioner og deres primærvalg blev observeret. I 16% skete der en ændring til højt niveau i metastaser og i 10% til normalt niveau.

Diskussion

Stathmin proteinniveauet har vist sig at være en prognostisk markør for aggressiv sygdom i mange cancertyper , herunder endometriecancer, hvor højt stathmin niveau i primær tumor identificerer patienter med høj risiko for tilbagevendende sygdom og lymfeknudemetastaser [6], [9], [10], [12], [13], [15], [16 ]. Identifikation og udvikling af prædiktive biomarkører er af afgørende betydning for at øge behandlingen effektivitet og reducere unødvendige bivirkninger, ikke kun i målrettede behandlinger, men også i kemoterapeutiske regimer, som for begge tæller, at kun en delpopulation vil reagere godt, især i den metastatiske indstilling, men med i øjeblikket meget begrænsede værktøjer til rådighed til at forudsige disse patienter [39], [40]. Ingen af ​​de vigtige klinisk-patologiske faktorer, såsom FIGO stadie eller histologisk undertype, der i øjeblikket kendt for at hjælpe skelne potentielle respondenter fra non-respondere til paclitaxel kemoterapi i metastatisk indstilling. Studere stor population baseret serie med høj kvalitet klinisk annotation som vores serie, kombineret med prækliniske forsøg er et nyttigt og tidsbesparende værktøj til at udforske potentielle predictive biomarkører, som efterfølgende kan testes i kliniske forsøg.

I overensstemmelse med tidligere

in vitro

resultater i brystkræft, viser vi i endometriecancer cellelinjer, der uafhængigt af det oprindelige stathmin niveau, følsomhed over for paclitaxel øget og dermed apoptose hurtige efter en vellykket stathmin knock-down. Dette blev vist ved direkte mikroskopisk tælling og i Ishikawa-celler også underbygges af immunoblotting fokus på PARP spaltning. PARP spaltning er en etableret indikator for apoptose, skelne det fra andre mekanismer celledød, såsom nekrose. Den forøgede apoptotiske legemers dannelse bemærket af mikroskopi i stathmin knock-down cellelinjer passer med øget apoptose [41], [42].

I vores prospektivt indsamlet retrospektivt analyseret patient serier, vi viste ligeledes en slående forskel som reaktion på paclitaxel kemoterapi sammenligne patienter med normal til dem med høj stathmin niveau, også når der korrigeres for de vigtigste klinisk-patologiske prognostiske variable. Selv når udforske sådan en stor klinisk serie med endometrie kræftpatienter som vores, der er indsamlet i løbet af mere end 10 år, med en passende opfølgning og RECIST [32] kompatibel dokumentation af respons, i sidste ende kun et mindre antal patienter var blevet behandlet med behandlingen af interesse, hvilket understreger vanskeligheden ved at indsamle serie med passende patient tal for specifikke markør undersøgelser; men samtidig vigtigheden af ​​at udnytte disse store prospektivt indsamlet population baseret serie for prædiktive biomarkører foreslået i prækliniske studier, og udforske potentielle kliniske gyldighed forud for kliniske forsøg. Den statistisk signifikant sammenhæng mellem højt stathmin niveau og dårlig paclitaxel reaktion i henhold til RECIST kriterier i kliniske prøver og det faktum, at stathmin niveau har en selvstændig prognostisk værdi i patienter, der fik paclitaxel for metastatisk sygdom, ikke er til stede hos patienter, der ikke, i overlevelse analyser, støtter sandsynligheden for, at niveauet af stathmin niveau kan virke ikke blot som en prognostisk markør, men også som en prædiktiv markør for respons på paclitaxel behandling i endometriske carcinomer.

i modsætning til tidligere undersøgelser, der ser på stathmin som en potentiel prædiktiv markør, overvejende

in vitro

brystkræft undersøgelser, i denne undersøgelse var vi i stand til at teste og bekræfte foreningen i kliniske prøver fra patienter behandlet med lægemidlet af interesse; ved hjælp af data fra en godt kommenteret prospektivt indsamlet patient serien. Både præklinisk og klinisk afprøvning støtte, stathmin niveau påvirkninger følsomhed over for paclitaxel. Vi har udforsket og udelukkes, at denne virkning kan generaliseres til andre kemoterapeutiske stoffer såsom carboplatin, også ofte i endometriecancer.

Reporting anbefalinger til tumor markør prognostiske undersøgelser (NB) retningslinjer er udviklet med det formål at forbedre den metodiske kvalitet og rapportering gennemsigtighed i sådanne undersøgelser [43]. Den aktuelle undersøgelse er udført i overensstemmelse med disse retningslinjer for at forbedre kvaliteten og almene gyldighed af dens resultater.

Taxaner, oprindeligt isoleret fra barken af ​​taks, hører til familien af ​​anti-mikrotubuli kemoterapeutika med paclitaxel som deres prototype. Kort sagt, taxaner binder til p-tubulin, hvilket mikrotubuli at modstå depolymerisering, hæmme cellecyklusprogression og fremme mitosestandsning og celledød [44]. Carboplatin er derimod er et af de platinbaseret midler, interaktion med DNA og forstyrre DNA-reparation. Som stathmin er en kritisk regulator af mikrotubulusdynamik, taget hensyn til virkningsmekanisme af narkotika, den positive effekt af stathmin knock-down på paclitaxel respons og fraværet af den til carboplatin følsomhed, er også biologisk plausibelt.

Vi viser en højere andel af højt stathmin niveau i metastatisk (37%) sammenlignet med primære læsioner (18%). Uoverensstemmelsen i stathmin status blev bemærket i en fjerdedel af parrede prøver, parallelt fund i f.eks brystcancer, hvor uoverensstemmelser mellem primære og metastatiske læsioner er vist i 14-55% og 0-40% for hormonreceptorer og HER2 henholdsvis [45] – [47]. I endometriecancer, få studier diskuterer forskelle i markør status mellem primære og metastatiske læsioner [38], [48], [49]. Intratumoral heterogenitet er godt beskrevet i kræft og en potentiel forstyrrende faktor i mange undersøgelser, uanset at bruge fuld væv dias eller TMA. Inter-observatør variation er usandsynligt at være den eneste forklaring på disse beskrevne forskelle. Også en ny undersøgelse vurderer mutation status, en metode betragtes som mindre subjektive end immunhistokemisk scoring, i flere metastatiske læsioner fra en patient med renalcellecarcinom, støtte, der opdages biomarkør ændringer fra grundskole til metastatiske læsioner er reelle og kan være relateret til og relevant for tumorprogression [39]. Ændringerne i biomarkør status fra primær til metastaselæsioner støtter behovet for gentagne biopsier i metastatiske læsioner, for bedre at kunne relatere terapi reaktion på potentielle prædiktive biomarkører, men også til kun tilbyde behandlinger med sandsynlige positiv effekt, når prædiktive biomarkører er tilgængelige [47], [50 ], [51]. For brystkræft, The American Society of Clinical Oncology (ASCO) rådede i 2007 allerede at for hormon-receptor status, bør testning overvejes at blive gentaget i metastatisk sygdom, hvis resultaterne var at påvirke patientens forvaltning [52].

Konklusion

Disse resultater, herunder prækliniske data og for første gang data fra kliniske prøver, der understøtter, at stathmin kan være en prædiktiv biomarkør for respons på paclitaxel behandling i endometriecancer. Der er imidlertid behov bekræftende undersøgelser, ideelt set fra randomiserede kliniske forsøg. Den biomarkør uoverensstemmelse på tumorprogression er på linje med andre undersøgelser af tumor biomarkør heterogenitet og støtter behovet for gentagne biopsi i metastatisk sygdom.

Tak

Britt Edvardsen, Ellen Valen, Gerd Lillian Hallseth,