PLoS ONE: Hurtig In Vitro Afledning af Endothel direkte fra human Cancer Cells

Abstrakt

Udviklingen af ​​en uafhængig blodforsyning af en tumor er afgørende for at opretholde vækst ud over en vis begrænset størrelse og for at give en portal for metastatisk spredning. Host-afledte endotelceller (ECS), der er bosiddende i, og belaster tumorvaskulaturen stammer via distinkte processer kendt som spiring angiogenese og vaskulogenese. For nylig EC’er stammer direkte fra tumorcellerne selv er blevet beskrevet, selv om grundlaget for dette fænomen stadig dårligt forstået. Her beskriver vi

in vitro

betingelser, der tillader lunge og ovariecancerceller at gennemgå en hurtig og effektiv overgang til EC’er der ikke kan skelnes fra dem, der opnås

in vivo

. En række forskellige metoder blev brugt til at fastslå, at de erhvervede fænotyper og adfærd af disse tumor-afledt EC’er (TDECs) ligner dem af autentiske EC’er. Xenografter forbindelse co-podet

in vitro

-afledt TDECs og tumorceller var også mere stærkt vaskulariserede end kontrol tumorer; Desuden er deres blodkar var i gennemsnit større og ofte indeholdt blandinger af værtsafledte ECS, TDECs afledt af den oprindelige inokulum. Disse resultater viser, at kræftceller kan manipuleres under veldefineret

in vitro

betingelser for at indlede en tumor celle-til-EF-overgang, der er stort set celle-autonome, højeffektive og nøje efterligner den

in vivo

proces. Disse undersøgelser giver et passende middel til at identificere og måske ændre de tidligste trin i TDEC generation

Henvisning:. Elster JD, McGuire TF, Lu J, Prochownik EV (2013) Hurtig

In vitro

Udledning af Endothelium direkte fra humane cancerceller. PLoS ONE 8 (10): e77675. doi: 10,1371 /journal.pone.0077675

Redaktør: Ken Arai, Massachusetts General Hospital /Harvard Medical School, USA

Modtaget: 28. maj 2013; Accepteret: September 11, 2013; Udgivet: 9 okt 2013

Copyright: © 2013 Elster et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud RO1 CA140624 til EVP og ved en St. Baldrick s ph.d.-stipendium pris til J.D.E. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på sin tidligste stadier, en begyndende tumor opfylder sin metaboliske behov gennem simpel diffusion af næringsstoffer og affaldsprodukter [1-3]. Efter at have nået en vis kritisk masse, dog ikke længere tilstrækkeligt diffusion til dette formål og yderligere vækst kræver udvikling af en uafhængig kar [3,4]. Uden dette, tumor vækstdvale ensues og kan vare ved i årevis i hvilket tidsrum yderligere tumorcelleproliferation afbalanceres af apoptotisk eller nekrotisk død [5,6]. Induktionen af ​​en “angiogen switch”, hvorved en vaskulær forsyning er ikke længere hastighedsbegrænsende, er nu anerkendt som en kritisk determinant af en tumor efterfølgende vækst, sin kommunikation med det systemiske kredsløb, og dens metastatiske spredning [3,4]. I overensstemmelse med disse resultater, vaskulær densitet er en velkendt prognostisk faktor i mange typer cancer, herunder brystcancer, neuroblastom, og astrocytom /glioblastoma [7-10].

angiogene switch er en kompleks proces, der involverer udarbejdelsen af ​​den avaskulære tumor af cytokiner og vækstfaktorer, herunder vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), fibroblastvækstfaktor (bFGF), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) , transformerende vækstfaktor beta (TGF-β), og en række angiopoietiner [1,11-13]. Nogle af disse er kemo-lokkemidler der mobiliserer både modne og progenitor endotelceller (ECS) fra knoglemarven og drive deres modning og organisation i blodkar ( “vasculogenese”), mens andre inducerer endotel af tilstødende blodkar til at formere sig og invadere tumor ( “spiring angiogenese”) [14-16].

Den ekstra-tumorale oprindelse neovaskulatur indebærer, at dets enkelte celler er både genetisk normal og stabil og således stort set immune at udvikle det kemoterapeutiske modstand, der almindeligvis opstår i genomisk ustabil tumorcellepopulation. Faktisk er anti-angiogenese terapier delvist baseret på den antagelse, at tumorvaskulaturen bevarer genomisk stabilitet dens forløber cellepopulation [17,18]. Bevacizumab, den første klinisk nyttigt angiogeneseinhibitor, er et humaniseret anti-VEGF monoklonalt antistof (mAb), der viste tidlige løfte i behandling af en række avancerede cancere [19-22]. Men stort set alle svar er ufuldstændige og /eller forbigående som tumorer i sidste ende igen vaskularisere og blive reagerer til yderligere behandling med mAb. Som et resultat, har samlet patientoverlevelse blevet forbedret kun beskedent, hvis overhovedet [19-23].

For nylig har vi og andre har givet en potentiel forklaring på de ufuldstændige svar på antiangiogenesemidler ved at vise, at en betydelig sub-population af tumor-associerede EC’er udlede direkte fra selve tumorcellerne [24-28]. Disse “tumor-afledt EC’er” (TDECs) udtrykker en række EF-markører, nedregulere epitel markører og danne funktionelle fartøjer

in vivo

hvor de blande med ekstra tumorally afledt EC’er. Fordi de indeholder de samme markør kromosomer som tumorcellepopulationen, blev det foreslået, at ligesom selve tumorcellerne, TDECs var genomisk ustabile [24-28]. Konsistent med denne ide, den serielle passage af TDECs fører til den endelige fremkomst af klonalt afledte populationer, der udtrykker gradvist mere robuste EF fænotyper og er genetisk relateret til men adskilt fra både tumorceller og tidlig-passage TDECs [24]. TDEC s er blevet identificeret i en musemodel af glioblastom [27] og i humane glioblastom xenografter [26,28]. Tidligere men resultatløse undersøgelser havde også foreslået tilstedeværelsen af ​​TDECs i andre primære humane tumorer [29-31]. Disse resultater antyder, at TDEC generation er en udbredt, om ikke universel, fænomen, og at modstanden mod antiangiogene terapier kan opstå som følge af iboende TDEC genomisk ustabilitet.

Konstateringen af, at TDECs udgør en funktionelt signifikant og distinkt EF befolkning rejser en række spørgsmål, der er vanskelige eller umulige at løse ved at studere primære tumorer eller tumorxenoplantater. Disse omfatter arten og relative betydning af signaler, der initierer tumor celle til TDEC overgang, det tidsrum, hvor dette sker, uanset om TDEC udvikling og vedligeholdelse er celle selvstændig og om alle celler i en tumor er i stand til at generere TDECs. Vi beskriver her udviklingen af ​​en

in vitro

system, der giver os mulighed for at behandle disse spørgsmål. Under anvendelse af betingelser, som favoriserer væksten af ​​EC’er og efterligner den hypoxiske og næringsstof-berøvet tumor mikromiljø, viser vi, at en robust EF fænotype let kan genereres fra tumorceller og at optimal induktion kræver synergistisk samarbejde af disse faktorer. Egenskaberne for

i vitro-

afledte TDECs er næsten ikke skelnes fra dem, isoleret direkte fra tumorer. Desuden er deres co-podning med tumorceller fører til udvikling af xenotransplantater med en tættere tumorvaskulatur og, i nogle tilfælde, en hurtigere vækstrate. Disse undersøgelser giver således en enkel og kvantitative midler, hvormed TDEC ontogeni kan studeres og manipuleres fra starten under definerede betingelser.

Resultater

Angivelse af EF markører i humane tumorceller under defineret

in vitro

betingelser

Vi oprindeligt søgt at identificere forhold, der fremmer en tumor celle til TDEC overgang

in vitro

. Til disse undersøgelser vi udnyttet den humane H460 og CaLu1 ikke-småcellet lungekræft, PC3 prostatakræft og OVCAR3 ovariecancer cellelinier. Ved valget dyrkningsbetingelser, vi den hypotese, at en kombination af EF-specifik vækstmedium og moderat hypoxi, måske kombineret med udtømning af visse næringsstoffer, kunne rekapitulere

in vivo

miljø, der giver signal (er) for TDEC indvielse. Tumorceller blev derfor dyrket i enten EF-specifik EGM-2 medium + normoxi (betingelse 1), standard vækstmedium + hypoxi (betingelse 2) eller en kombination af EGM-2 medium + hypoxi (betingelse 3). For OVCAR3 celler anvendte vi også Glutamax medium suppleret med EF specifikke faktorer identiske med dem i EGM2 medium, men berøvet asparagin, asparaginsyre, glutamin og prolin + hypoxi (betingelse 4) eller det samme medium + normoxi (betingelse 5). Vi henviser til denne sæt betingelser kollektivt som “EF-fremmende”. Tumor celler opretholdt i deres standard anbefalede vækstmedium under normoxiske betingelser tjente som udgangspunkt kontrol. Cellelysater blev fremstillet ud fra disse prøver og analyseredes ved immunoblotting for ekspressionen af ​​von Willebrands faktor (vWF), som er pålideligt induceres under tumorcellen til TDEC overgang

in vivo

[24,25]. Som vist i figur S1, de fleste af tumor cellelinier dyrket under standardbetingelser viste lidt eller ingen ekspression af vWF. I modsætning hertil blev vWF induceret i varierende grad under forskellige EF-fremmende betingelser med de højeste og mest vedvarende niveauer normalt blive set under betingelse 3. Skønt tid at opnå maksimal induktion varierede blandt de testede linjer og var undertiden forbigående, det var generelt maksimal mellem d 3-5 og ikke efterfølgende stige.

Efter at have fastslået arbejdsbetingelserne for at opnå maksimal vWF ekspression i hver cellelinje, vi udvidet vores indledende analyser til at omfatte yderligere EF-specifikke markører under anvendelse immuno-fluorescens-baserede assays, som beskrevet tidligere [24,25]. Til disse undersøgelser vi koncentreret om H460 og OVCAR3 celler dyrket i 5 d under betingelser 3 og 4, hhv. De EF-specifikke proteiner analyseret igen inkluderet vWF samt VEGFR1, VEGFR2, VE-cadherin og EF-selektiv adhæsionsmolekyle (ESAM). Desuden binding af

Ulex europeus

lectin (E-lectin), optagelse af acetyleret lavdensitetslipoprotein (AcLDL), og morfologi blev fulgt som indikatorer for mere komplekse EF fænotyper. Cytokeratiner 7 (CK7) og 19 (CK19) blev også undersøgt som markører for epitelial fænotype. Som vist i figur 1, blev alle EF markører induceres i begge cellelinier hvorimod begge cytokeratiner blev markant nedreguleret. Disse ændringer er involveret både procentdelen af ​​celler, der farves for markører samt intensiteten af ​​positive cellefarvning. Således udtrykket mønstre af alle markører tæt efterlignede dem, der ses med TDECs afledt fra de faktiske tumorxenoplantater [24,25].

(

A

) H460 celler blev dyrket i 5 d under betingelse 3 . (

B

) OVCAR3 celler blev dyrket i 5 d under forudsætning 4. antistof farvning for de EF-specifikke markører vWF, VEGFR1, VEGFR2, VE-cadhherin, ESAM, binding af E-lectin og optagelse af acetyleret AcLDL blev udført på begge sæt celler som beskrevet tidligere [24,25]. Epiteliale markør farvning blev udført for CK7 og CK19. Modfarvning med DAPI blev udført for at visualisere cellekerner. Bright felt billeder af tumorceller og TDECs er også inkluderet. Billeder blev opnået ved enten 40-60X forstørrelse (konfokal) eller 10X forstørrelse (lyse felt). Tal i øverste højre hjørne af hvert panel angiver procentdelen af ​​hver population, der viste tegn på farvning, uanset dens intensitet. Lignende resultater blev opnået i mindst tre uafhængige forsøg. Scale bar = 25 um.

Funktionel analyse af

in vitro

-afledte TDECs

For at sammenligne yderligere EF fænotyper af

i vitro-

afledte TDECs med dem fra de faktiske tumorxenotransplantater undersøgte vi de tidligere celler for deres evne til at danne rørlignende strukturer i halvfast medium. Til disse undersøgelser blev H460-celler dyrket under standarddyrkningsbetingelser (kontrol) eller under betingelser 1-3 til 5 d på hvilket tidspunkt de blev udpladet på halvfast medium og dyrket under normoxi i yderligere 5 dage. Under både standard- og EF-fremme vilkår 1 eller 2, H460 celler fortsatte som individuelle celler eller dannede amorfe acini mens dyrkning under betingelse 3 stærkt forbedret dannelse rør (figur 2A). Kvantificering af dette viste dannelse rør af H460-celler forøges med 10- til 50 gange over den, der ses under betingelser 1 eller 2 og med næsten 25 gange i forhold at af standard betingelser (figur 2B). Selv om antallet af rør dannes og deres kvalitet var ringere end dem, der stammer fra human navlevene EC’er (HUVEC’er) (figur 2C), de var ikke til at skelne fra rørene dannet af

in vivo

-afledt TDECs [24,25 ]. Disse observationer indikerer, at H460-afledte TDECs kunne danne rør i de normoksiske betingelser, hvorunder røret-formation assay blev udført, og foreslog, at TDEC fænotype kan være stabil. For at teste dette, H460 celler, først udsættes for betingelse 3, blev udpladet direkte til delvis solgt medium som beskrevet for figur 2A eller blev holdt under standardbetingelser i yderligere 7 d før udpladning i en formation rør assay. Overraskende, under sidstnævnte regime, røret danner evne TDECs var ikke kun opretholdes, men de resulterende rør mere lignede dem, der dannes af HUVEC’er (Figur 2C). Således, mens TDEC rør-dannende potentiale blev vist til at kræve hypoxi, blev det opbevares i mindst 2 uger efter en tilbagevenden til almindelige vækstbetingelser.

(

A

) H460 tumorceller blev induceret til dannelse TDECs med 5 d eksponering for de angivne betingelser. 2 x 10

4 celler fra hver gruppe blev derefter udpladet på Matrigel i en formation rør assay under normoxiske betingelser for 5 d, som tidligere beskrevet [24,25]. Ubehandlede H460 celler dyrket under standardbetingelser tjente som kontroller. er vist typiske lysmikroskopiske felter. Alle billeder er vist ved identiske forstørrelser. (

B

) Resultaterne er vist i (

A

) er grafisk afbildet som det gennemsnitlige antal helt lukkede rør pr felt ± SEM. p-værdier blev opnået ved hjælp af en envejs ANOVA (**: p 0,01). (

C

) H460 tumorceller blev dyrket under standardbetingelser eller tilstand 3 til de angivne tider. Halvdelen af ​​cellerne blev derefter straks udpladet på Matrigel og dyrket under normoxiske betingelser i yderligere 6 d. Resten af ​​cellerne blev returneret til standardbetingelser for 7 d forud for at blive udpladet i Matrigel for 6 d at vurdere persistens af rør-dannende potentiale. HUVEC’er blev anvendt som en positiv kontrol for dannelse rør. Lysfelt fotografierne blev taget ved 10X forstørrelse. Lignende resultater blev opnået i fire uafhængige forsøg (A) og to uafhængige forsøg (C). Scale bar = 100 um.

En biosenser-baserede assay til at overvåge

in vitro

TDEC induktion

For at bekræfte og bedre kvantificere

in vitro

tumor cellTDEC overgang, genereret vi adskilte populationer af H460 og OVCAR3 celler stabilt udtrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) under kontrol af den EF-specifikke angiopoietin receptor (Tie2) promotor [32]. Under standard vækstbetingelser, disse celler udtrykte lidt EGFP, selv når vurderet ved flowcytometri (figur 3). Efter TDEC induktion under betingelse 3 for H460-celler og tilstand 4 for OVCAR3 celler, blev 3-5-fold stigninger i EGFP signal rutinemæssigt observeret (figur 3). Således Tie2-EGFP induktion tjener som en enkel, reproducerbar og kvantificerbar surrogat assay for TDEC differentiering, som, i levende celler, nøjagtigt afspejler resultaterne opnået ved flere standardassays af EF fænotype. Det giver også direkte bevis for transkriptionel opregulering af i det mindste nogle af markørerne i løbet af TDEC differentiering og hjælper til at dokumentere deres koordinere opregulering over en 4-5 dages tidsramme (figur S2).

Separate kulturer af H460 og OVCAR3 tumorceller blev stabilt cotransficeret med Tie2-EGFP plasmid og pFR400 koder for en mutant form af dihydrofolatreduktase [36,37] og udvælges i G-418 og stigende koncentrationer af methotrexat til tillade amplifikation af de to tandem integrerede vektorer og en tilsvarende stigning EGFP signal intensitet. Celler blev udsat for betingelser, der tidligere er vist at inducere den maksimale TDEC fænotype (dvs. betingelse 3 for H460 s og tilstand 4 for OVCAR3) og sammenlignes med kontrolværdier celler dyrket under standardbetingelser. (

A

) Fluorescens-mikrografer af hver cellelinje efter fem dages vækst under hvert sæt af betingelser. (

B

) Flowcytometrisk analyse af de samme celler. Repræsentative resultater af mindst tre uafhængige forsøg er afbildet. Scale bar = 25 um.

De ovenstående resultater, sammen med dem, der er afbildet i figur 2, viser, at et flertal af tumorceller vise tilstrækkelig plasticitet til at tillade deres

in vitro

overgangen til TDECs. For at teste denne direkte undersøgte vi 80 enkelt celle kloner afledt fra H460 og OVCAR3 celler for at bestemme graden, hvortil de kunne udtrykke EF markører. Som vist i tabel 1, stort set alle klon viste højt niveau optagelse af AcLDL, E-lectin binding og Tie2-drevet EGFP ekspression under EF-fremmende betingelser henviser kunne detekteres kun svag ekspression af disse markører i celler opretholdt under standardbetingelser. Således, som tidligere foreslået for

i vivo-

afledte TDECs [25], er erhvervelsen af ​​EF fænotype ikke begrænset til nogen bestemt cellulær delmængde.

H460

OVCAR -3

% + celler (Std tilstand /betingelse 3)

% + celler (Std tilstand /betingelse 4)

klon nr

E-lectin

AcLDL

Clone No.

Tie-2-GFP

Clone No.

E-lectin

AcLDL

Clone No.

Tie-2-GFP

1 3/90-95 3/ 9521 3/90-9541 3/80 3/9061 3/ 952 3/90-95 3/ 9522 5/90-9542 3/90 3/9062 3/ 9535/80 3/90-9523 5/ 9543 3/ 95 3/9563 3/ 345/ 95 3/ 9524 3/ 9544 3/ 95 3/9064 3/ 9555/ 95 3/80253-5/ 9545 3/ 95 3/9065 3/ 9565/ 95 3/90-9526 3/ 9546 3/90 3/9566 3/ 9575/90-95 3/ 9527 3/ 347 3/80 3/9567 3/ 9585/ 955/90-9528 3/ 9548 3/90 3/9068 3/ 395/ 955/ 9529 3/90-9549 3/90 3/9069 3/ 95105/80-855/ 9530 3/ 9550 3/50 3/9070 3/ 31110/ 955/90-9531 3/ 9551 3/ 95 3/9571 3/ 9512 3/ 95 3/ 9532 3/ 352 3/ 3 3/5072 3/ 95135/ 95 3/ 9533 3/ 9553 3/30-40 3/9573 3/ 951410/ 953/ 95345/ 9554 3/30-40 3/8074 3/ 31510/90-95 3/ 9535 3/ 95555/90-95 3/9575 3/ 316 3/90-953/ 9536 3/ 95565/ 95 3/9576 3/ 9517 3/90-95 3/ 9537 3/ 95575/ 95 3/9577 3/ 95185/ 953/ 9538 3/ 3585/90-95 3/9578 3/ 95195/ 95 3/ 9539 3/ 3595/ 95 3/9579 3/ 320 3/ 95 3/90-95405/ 9560 3/ 95 3/9580 3/ 95Table 1. Endothelial differentiering af human tumor line enkelt cellekloner.

Cellesortering blev anvendt til at pode individuel H460 og OVCAR3 celler i 96-brønds plader. 20 kloner afledt fra hver celletype blev udvidet og evalueret under standard eller EF-fremme vilkårene for E-lectin binding og AcLDL optagelse. Yderligere 20 kloner hver afledt af H460-Tie2-GFP og OVCAR3-Tie2-GFP-celler blev også bedømt for ekspression af GFP. Procenten af ​​positive celler for hvert af disse EF-specifikke markører efter 5 dages opformering blev målt under standardbetingelser eller betingelser 3 eller 4 og de to værdier, der opnås er adskilt med “/”. Disse undersøgelser tager ikke hensyn til de store forskelle i markør intensitet, der fandt sted efter hypoxiske formering, som er illustreret i figur S2. CSV Hent CSV

TDECs indarbejde tumorneovaskulaturen, forbedre tumorvækst og øge fartøj tæthed

Vores tidligere resultater, som

i vivo-

afledte TDECs kan indarbejde ind i tumoren neo-kar og øge blodkar tæthed [24,25] foreslog, at

in vitro

-afledt TDECs kunne opføre sig på samme måde. For at løse dette, EGFP-mærkede H460 tumorceller [25] blev dyrket under forudsætning 3 for 5 d, blandet med en 20-ganges overskud af

Discosoma

sp.

Rødt fluorescerende protein (DsRed ) -mærket H460 tumorceller og opformeret som subkutane xenotransplantater i immunkompromitterede mus. Kontrol- injektioner blev udført identisk, men med den EGFP + -populationen dyrket under standardbetingelser. Tumorer opstået fra det tidligere celleblandingen voksede betydeligt hurtigere end dem fra den sidstnævnte (figur 4A). Fluorescens mikroskopi af frosne snit viste også blodkarrene i de tidligere tumorer skal beriges for EGFP + EC’er (figur 4B), hvilket indikerer en forkærlighed for

in vitro

-afledt TDECs at indarbejde i tumorvaskulaturen. Endelig blodkarrene i de tidligere tumorer var både tættere og større end sidstnævnte tumorer (figur 4C-4F). Lignende forsøg udført med OVCAR3 celler viste, at de resulterende tumorxenoplantater, mens ikke vokser betydeligt hurtigere end deres kontrol- kolleger, indeholdt større andel af EGFP + luminale TDECs og en tættere kar (figur S3). Således co-injektion af

i vitro-

afledt TDECs letter tumor neovaskularisation, som i visse tilfælde giver mulighed for accelereret tumorvækst.

EGFP-mærkede H460 celler blev holdt i 5 d under betingelse 3. de resulterende TDECs blev derefter blandet med en 20-fold overskud af DsRed-mærkede H460-tumorceller dyrket under standardbetingelser og i alt 10

6 celler blev inokuleret subkutant i flankerne af nøgne mus og opformeret som tumor xenografter. Kontroltumorer bestod af det samme blanding af DsRed-mærkede tumorceller og EGFP-mærkede tumorceller opformeret under standardbetingelser. (

A

) Grafisk fremstilling af tumorvækst. Tumorvolumener blev bestemt på de angivne tidspunkter og gennemsnittene blev plottet (± SEM).

s Drømmeholdet værdi vist for dag 17 tumorvolumener blev udledt ved hjælp af en ensidet t-test. (

B

) Konfokal fluorescens billeder af frosne sektioner tumorer fra hver af de to grupper. Scale bar = 25 um. (

C

) Repræsentative energibesparende hæmatoxylin-eosin-farvede paraffin vævssnit taget fra typiske tumorer i hver af de to grupper. (

D

) Grafisk afbildning af det gennemsnitlige antal tumor blodkar pr felt (± SEM) i typiske felter af hver tumortype. Det samlede antal felter undersøgte var 32 for betingelse 3 tumorer og 24 for standard tilstand tumorer. Kun fartøjer udviser distinkte lumen og indeholder røde blodlegemer, der angives med

sort og

pile

, blev talt. (

E

) Grafisk afbildning af den gennemsnitlige blodkar tværsnitsareal (± SEM) i de to tumortyper. Det samlede antal fartøjer målt var 85 fra standard tilstand tumorer og 248 fra tilstand 3 tumorer. (

F

) Det gennemsnitlige antal tumor blodkar med tværsnitsareal (± SEM), der var små (30-499 um

2), medium (500-1999 um

2) , stor (2000-4999 um

2), og meget store (≥ 5000 um

2), som målt ved anvendelse ImageJ software. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en ensidet Students

t

test (*,

s

0,01, **,

s

0,001; ***,

s

0,0001). Lignende resultater blev opnået i to uafhængige forsøg.

Diskussion

De seneste observationer i en række forskellige kræftformer har tilkendegivet, at ECS omfatter tumor neo-kar kan stamme direkte fra tumoren cellerne selv og sameksistere med EC’er stammer fra ekstra-tumoral kilder [24-28]. Meget gerne deres tumor celle forgængere, disse TDECs er genomisk ustabile [24]. Dette kan give en overlevelse fordel over for anti-angiogenese behandlingsformer, således måske tegner sig for de forbigående effekt af disse stoffer [19-22]. Faktisk har vi observeret, at

i vitro-

afledte TDECs såsom dem beskrevet her, kan udledes i EGM2 medium uden VEGF og dermed synes at være uafhængig af denne vækstfaktor selv i fravær af forudgående udvælgelse. Desuden er de ekstremt lave niveauer af VEGF udskrifter der blev detekteret i H460 og OVCAR3 celler ved realtid QRT-PCR, blev ikke ændret væsentligt efter induktion af TDEC fænotype (ikke vist).

Vores resultater tyder på, at tumor celler kan manipuleres

in vitro

under definerede betingelser for at generere TDECs der er både biokemisk og funktionelt ligner dem oprindelse

in vivo

[24,25]. At stort set alle tumorceller kan erhverve EF-lignende egenskaber (tabel 1), mens miste deres epitelial egenskaber er i overensstemmelse med vores tidligere fund, at single-celle-kloner, der stammer fra tumorceller kan generere TDECs

in vivo

[25]. Således forekommer kapacitet for TDEC generation at være en fælles, hvis ikke universel, træk, der deles af et flertal af tumorcellepopulationen og er celleautonom. Den variable del af TDECs findes i forskellige tumorer [25] kan således være mindre tegn på nogen iboende generationsskifte kapacitet end konkurrerende processer såsom spiring angiogenese og vaskulogenese, sub-optimale betingelser for TDEC induktion og mangel på andre selektive pres som før terapeutisk interventioner. Egenskaben synes at være begrænset til tumorcellepopulationer som vi ikke har observeret EC’er at hidrøre fra ikke-transformerede celler, såsom humane embryoniske nyre eller primær eller udødeliggjort bronchiale og brystkirtel-epitelceller, når de dyrkes under betingelser identiske med dem beskrevet heri (ikke vist).

evnen til at generere TDECs under definerede

in vitro

betingelser svar flere spørgsmål, som ikke umiddelbart kan løses ved hjælp af

in vivo

modeller, hvor tumor mikromiljø ofte heterogen med forbehold af hurtige ændringer [1,33], og hvor TDEC dannelse forventes at konkurrere med yderligere vaskulære remodeling processer. Disse spørgsmål omfatter art og indbyrdes af de induktive signaler for TDECs og deres timing. Oplagte kandidater til sådanne signalmolekyler inkluderer EF-specifikke vækstfaktorer, såsom VEGF, bFGF og TGF-beta, samt hypoksi, som alle er kraftige inducere af tumor-neovaskularisering [3-5,11-14]. Vores resultater indikerer, at i det mindste

in vitro

, hverken vækstfaktorerne leveret af EF-specifik vækstmedium eller hypoksi alene er særligt potente inducere af tumorcellen til TDEC overgang men at den i kombination, de er meget synergistisk. Dette er ikke helt uventet, da disse faktorer har været længe kendt for at være nødvendig for generering og vedligeholdelse af tumorneovaskulaturen følge af mere traditionelle kilder [34,35]. I nogle tilfælde, som eksemplificeret ved vores resultater med OVCAR3 celler, andre faktorer, såsom selektiv næringsstof afsavn eller acidose kan spille yderligere støttende roller og forblive at blive udforsket mere grundigt. Den præcise karakter af disse effektorer og deres relative betydning for TDEC generation vil sandsynligvis være ganske afhængige af iboende egenskaber specifikke tumortyper, erhvervede sekundære forandringer og forskellige andre konkurrerende og samarbejdende miljøfaktorer. Det er også sandsynligt, at længden af ​​udsættelse for forskellige induktive faktorer samt når under tumorcellen til TDEC overgangsperiode de er operative vil spille vigtige roller. Alle disse spørgsmål bør være adresserbare bruge de typer af assays beskrevet her, der giver mulighed for præcis styring og timingen af ​​potentielle miljømæssige signaler.

Vores tidligere undersøgelser havde vist, at både ekspressionen af ​​EF-specifikke markører og funktion af

in vivo

-afledte TDECs var cellelinie-afhængige, og dette blev bekræftet af de igangværende undersøgelser. Måske er det mest oplagte eksempel på dette blev illustreret af forskellene mellem H460 og OVCAR3 TDECs med hensyn til deres evne til at påvirke tumor xenograft vækstrater og fartøj størrelse (figur 4 og S3). Hvorvidt dette afspejler iboende funktionelle forskelle i TDECs, vækst- mønstre af tumorcellerne selv, stromale interaktioner eller en kombination af disse faktorer er i øjeblikket ukendt. Definitive beviser for sådanne årsagssammenhængen venter fremtidig bekræftelse.

Evnen til at rekapitulere tumor celle til TDEC overgang effektivt, hurtigt og under veldefinerede og let foranderlige betingelser bør nu tillader mere grundige evalueringer af de præcise roller af de enkelte induktive faktorer spiller i lette denne proces samt deres relative betydning. Den lethed, hvormed TDECs kan genereres også tyder på, at de kan tjene som værdifulde reagenser til brug ved identifikation af nye midler, der forhindrer denne proces.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Alle mus undersøgelser blev udført i overensstemmelse med dyreværnsloven Public Health service Politik og og godkendt af University of Pittsburgh Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) (Tilladelse nummer: 0.812.276). Dyrene blev opstaldet i patogenfrie enheder på Børnehospital of Pittsburgh i overensstemmelse med IACUC regler.

Dyr

Alder og køn-matchede nu /nu-mus blev indkøbt fra Harlan Sprague-Dawley Laboratories ( Indianapolis, IN). Tumor xenografundersøgelser blev udført som beskrevet tidligere [24,25].

In vitro

induktion af TDECs og tumor xenograft vækst

NCI-H460 humane lunge carcinom (H460) , CaLu-1 human lunge carcinom, PC3 prostatacancer, og OVCAR3 ovariecancer cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og blev holdt under normoxiske “standard” betingelser som beskrevet tidligere [24,25]. Dyrkningsmedier inkluderet alpha Minimal Essential Medium ( “MEM”) til H460 og PC3 og McCoys 5a medium til CaLu-1 og OVCAR3, begge suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 110 ug /ml pyruvat, minimum ikke-essentielt aminosyrer, 100 ug /ml streptomycin og 100 enheder /ml penicillin G). Humane umbilical vene-endotelceller (HUVEC’er) og EF-specifik EGM-2 vækstmedium blev indkøbt fra Cambrex Bio Science (Walkerville, MD). Alle cellelinjer blev opretholdt i en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C. For de fleste tumorlinjer blev induktion af et EF fænotype opnås ved dyrkning af celler under forskellige betingelser. Disse omfattede EGM-2 medium under normoxiske betingelser (betingelse 1); standard medium under hypoxisk tilstand [1% O

2 i en Hypoxic Glove Box inkubator (Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, MI)] (betingelse 2); eller EGM2 medium + hypoxi (betingelse 3). For nogle forsøg optimal induktion endvidere kræves næringsstof-deficient medium [Glutamax D-MEM medium, som manglede den ikke-essentielle aminosyrer asparagin, asparaginsyre, glutamin og prolin (Invitrogen, Inc.)] under hypoxiske betingelser, men ellers indeholder den identiske vækst faktorer og kosttilskud som EGM-2 medium (betingelse 4). En sidste betingelse inkluderet ovennævnte næringsstof-deficient medium plus normoxi (betingelse 5). Lentiviral emballage og infektioner for at producere EGFP- eller DsRed-mærkede celler blev udført som tidligere beskrevet [25].

subkutane tumorxenografter blev opnået ved at pode 10

6 tumorceller, og som bestod af EGFP-mærkede TDECs og DsRed-mærkede tumorceller (1:20), subkutant i flankerne af nu /nu-mus som tidligere beskrevet [25]. målinger tumorvolumen blev foretaget hver 2-3 dage, indtil den maksimale tilladelige diameter på ca. 2 cm blev nået (typisk 4-6 wks for både H460 og OVCAR3 celler), på hvilket tidspunkt tumorerne blev udskåret. Separate fragmenter af tumorer blev anvendt til fremstilling af frosne og paraffinindlejrede sektioner.

Støtte Information

Figur S1.