PLoS ONE: virkningsmekanisme af to Flavone isomerer Targeting Cancer Cells med Varierende Cell Differentiering status

Abstrakt

Apoptose kan udløses på to forskellige måder, gennem den indre eller den ydre vej. Den indre vej medieres af mitokondrier via frigivelse af cytochrom C, medens den ydre vej er foranlediget af dødsreceptor signaler og omgår mitokondrierne. Disse to veje er tæt relateret til celleproliferation og overlevelse signalering kaskader, som derfor udgør mulige mål for cancerterapi. I tidligere undersøgelser introducerede vi to plante afledt isomere flavonoider, flavoner A og flavon B som inducerer apoptose i meget tumorgene cancerceller i bryst, colon, pancreas og prostata. Flavon En vist potent cytotoksisk aktivitet mod flere differentierede carcinomer i colon (CaCo-2) og bugspytkirtlen (Panc28), hvorimod der observeres flavon B cytotoksisk virkning på dårligt differentierede carcinomer i colon (HCT 116) og bugspytkirtel (MIA PaCa). Apoptose induceret af flavon A i bedre differentieret coloncancer Caco-2 og bugspytkirtelkræft Panc 28 celler via den indre vej ved inhibering af de aktiverede former af ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) og PS6, og efterfølgende tab af phosphorylering af Bcl -2 associeret død promoter (BAD) protein, mens apoptose udløses af flavon B i dårligt differentieret tyktarmskræft HCT 116 og MIA Paca bugspytkirtelkræftceller gennem ydre vej med samtidig opregulering af de phosphorylerede former for ERK og c-jun på serin 73. Disse ændringer i protein niveauer i sidste ende føre til aktivering af apoptose, uden inddragelse af AKT

Henvisning:. LeJeune TM, Tsui HY, Parsons LB, Miller GE, Whitted C, Lynch KE, et al. (2015) virkningsmekanisme af to Flavone isomerer Targeting Cancer Cells med Varierende Cell Differentiering status. PLoS ONE 10 (11): e0142928. doi: 10,1371 /journal.pone.0142928

Redaktør: Yu-Jia Chang, Taipei Medicin University, TAIWAN

Modtaget: April 29, 2015; Accepteret den 28. oktober 2015; Udgivet: November 25, 2015

Copyright: © 2015 LeJeune et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Institut for Farmaceutiske Fakultet på East Tennessee State University Gatton College of Pharmacy (https://www.etsu.edu/pharmacy/), tilskud 82.171 fra øst Tennessee State University Research Udviklingsudvalget Større Grants Program (https://www.etsu.edu/research/rdc/) og Kemi Institut på Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales (http: //www. udca.edu.co/)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forekomsten af ​​kræft er steget støt gennem fortiden. årtier [1]. Mens nuværende terapier er effektive på forskellige niveauer, mange af disse behandlinger er også ikke-specifik med hensyn til deres virkningsmekanisme. Dette vil til gengæld øger uønskede resultater opleves af behandlede patienter; barske bivirkninger og lave effektivitet er nogle af de mange grunde til, at der er søgt mere specifikke behandlinger i onkologi. Blandt disse bestræbelser, har naturlige produkter [2] blevet omfattende undersøgt i håb om at finde nye molekylære enheder med antineoplastiske egenskaber. Af disse naturlige produkter, flavonoider, en klasse af polyphenolforbindelserne findes i planter, er blevet vist at udøve antineoplastiske [3-9] egenskaber, såvel som antioxidant [10, 11], anti-inflammatorisk [12], antimikrobiel [13] og antivirale [14, 15] aktiviteter.

i de sidste fem år vores forskning har fokuseret på planter fra Andes bjergene i høj grad kendt som

vira Viras

. Disse planter er blevet udnyttet af de indfødte folk i denne region til medicinske formål, såsom i behandlingen af ​​cancer, som rapporteret i forskellige ethnobotanical undersøgelser [16, 17]. De tilhører familien

Asteraceae

, slægter

Gnaphalium

,

Achyrocline

, og

Gamochaeta

. Vores fokus i forhold til Vira Vira planter er blevet placeret på

Gnaphalium elegans

Achyrocline bogotensis

hvorfra to aktive forbindelser blev isoleret, 5,7-dihydroxy 3,6,8-trimethoxy- 2-phenyl-4H-chromen-4-on (5,7-dihydroxy-3,6,8-trimethoxyflavone eller flavon A) [18], og 3,5-dihydroxy-6,7,8-trimethoxy-2- phenyl-4H-chromen-4-on (3,5-dihydroxy-6,7,8-trimethoxyflavone eller flavon B) henholdsvis [19]. Det er blevet foreslået i vores tidligere arbejde, at disse to flavon isomerer kan være relevante for antineoplastiske aktiviteter af disse planter [20]. Faktisk flavoner A og B demonstrerede cytotoksisk aktivitet mod cellelinier afledt fra colon, pancreas, bryst, og prostatacancer, der er blevet kategoriseret som værende yderst tumorigene, med de mest lovende resultater på cancere i colon og pancreas. Høje niveauer af ekspression af aldehyddehydrogenase (ALDH) betragtes som en meget specifik markør anvendes til påvisning af cancer-initierende celler som subpopulationer i tumorer, og har vist specifikt i cellelinierne undersøgt [21-23]. Blandt disse meget tumorgene cellelinier, de to flavon isomerer viser præferentiel antineoplastisk aktivitet på celler med uens differentiering status. Flavon En induceret apoptose i de bedre differentierede cellelinier, men ikke på de ringe differentierede cellelinjer, mens flavon B viste sig at være aktive mod dårligt differentieret, men ikke mod bedre differentierede celler. Hertil kommer, at disse to flavon isomerer ikke inducere apoptose i normale celler og vise signifikant mindre apoptotisk aktivitet i mindre tumorigene cellelinjer [20].

Det er kendt, at mitokondriel forvaltning af apoptose kan styres gennem aktiviteten i overlevelse faktorer, såsom vækstfaktorer eller cytokiner, via ekstracellulære receptorer aktiverende kaskader af protein begivenheder, der til sidst fører til Caspase-3-spaltning. Disse veje blev probet ved at undersøge effekterne af de to flavon isomerer på ekstracellulære signal-regulerede kinaser (ERK), protein kinase B (AKT), S6 ribosomale protein (S6), og Bcl-2 forbundet død promotoren (BAD). Den præferentielle induktion af apoptose på meget tumorgene celler med uens differentiering status ved flavon A og flavon B, to strukturelt lignende forbindelser, antyder aktiveringen af ​​forskellige cellulære veje ved hver forbindelse. Denne undersøgelse viser, at flavon A udøver sin cytotoksiske virkning på bedre differentierede cancerceller via en iboende apoptosecyklus henviser flavon B omgår den mitokondriske pathway at inducere apoptose via en ydre vej i ringe differentierede cancerceller.

Materialer og metoder

Ekstraktion, oprensning, og identifikation af flavoner

De flavoner blev opnået som beskrevet før [20]. Kort fortalt blev Flavone A oprenset fra 1,5 kg

G

.

elegans

tørrede blomster udvundet med CHC

3. Ekstrakten blev koncentreret ved tør vakuum, opløst i methanol og filtreret for at fjerne fedtstoffer og carbonhydrider. Den blev derefter koncentreret og opløst i C

6H

6 efterfulgt af silicagelchromatografi under anvendelse af C

6H

6: Me

2CO (19: 1) som eluent. Fra dette blev 50 mg af flavonoid oprenset fra fraktionerne 12 til 18 af krystalliseringer i hexan. Forbindelsen blev identificeret ved dens fysiske og spektroskopiske egenskaber som 5,7 dihydroxy-3,6,8 trimethoxyflavone, smp 170 171C, 1H NMR (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 4,20 (3H, s), 7,50 7,6 (3H, m), 8,08 8,16 (2H, m). Flavon B blev oprenset fra 200 g friske blade af

A

.

bogotensis

. Bladene blev nedsænket i CHC

3 i 20 minutter og derefter filtreret, opkoncentreret og opløst i varm methanol. For at eliminere fedtstoffer og carbonhydrider blev det kolde ekstrakt filtreres og koncentreres igen. Det resulterende faststof blev derefter opløst i varm hexan og successive omkrystallisationer i hexan producerede 100 mg oprenset flavonoid. Forbindelsen blev identificeret ved dens fysiske og spektroskopiske egenskaber som 3,5-dihydroxy-6,7,8-trimethoxyflavone, smp 149 150C, 1H NMR (300 MHz) 3,86 (3H, s), 3,97 (3H, s), 3,99 ( 3H, s), 4,12 (3H, s), 7,30 7,45 (3H, m), 8,70 8,82 (3H, m), 11,46 (1H, s).

cellelinier og dyrkningsbetingelser.

Colon (Caco-2, HCT116) og pancreas (MIA PaCa-2) cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og blev dyrket i overensstemmelse med ATCC instruktioner. Den Panc28 cellelinjen var en gave fra Dr. Paul Chiao (University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, TX), og blev dyrket på samme måde som pancreas cellelinie MIA Paca-2. Cellerne blev dyrket i medium suppleret med 10% serum (Gibco, Grand Island, NY) og penicillin /streptomycin (Hyclone, Logan, UT). Alle celler blev podet og tilladt at nå 75% konfluens før behandling med flavon A, B, eller vehikel (dimethylsulfoxid) ved en endelig maksimal koncentration på 0,27% i de behandlede brønde (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

Apoptose Detektion ved fluorescensmikroskopi

Apoptose blev påvist under anvendelse af Annexin V-FITC kit fra Abcam (Cambridge, MA) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev cellerne podet ved en densitet på 4-5×10

4 /brønd på 12-mm runde dækglas (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), fik lov til at nå 75% konfluens, og behandlet med enten vehikel, flavon A, eller flavon B ved en koncentration på 40 uM. Seks timer efter dosering, blev cellerne inkuberet i bindingsbuffer og FITC-konjugeret Annexin V i fem minutter i mørke. Cellerne blev derefter fikseret med 2% p-formaldehyd og billeder blev opnået under anvendelse af et EVOS fluorescensmikroskop (AMG, Bothell, WA).

Cell Cycle og Apoptose Analyse ved flowcytometri

Celler dyrkes på seks brønds plader, blev behandlet med enten opløsning køretøj, flavon A, eller flavon B. efter ni timers inkubation blev cellerne løftet fra pladen med trypsin, og analyseret for kvantificering af apoptose og cellecyklus distributioner under anvendelse af et Annexin V- FITC kit fra Abcam (Cambridge, MA) ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev cellerne suspenderet i bindingspuffer og Annexin V-FITC og propidiumiodid blev tilsat efterfulgt af en 5 minutters inkubation i mørke. Celletal blev opnået ved hjælp af BD Accuri C6 flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) og analyseret med CFLOW Plus (BD Biosciences).

Antistoffer og reagenser

Virkningsmekanismen blev vurderet ved hjælp af antistoffer mod ERK2 fra Santa Cruz (Dallas TX), AKT fra Millipore (Billerica, MA), c-Jun og BAD fra Cell Signaling (Beverly, MA), phosphoryleret c-jun (T91 /93) fra Abcam (Cambridge, MA ), phosphorylerede c-jun (S63 /73), de phosphorylerede former af ERK, S6 ribosomale protein (91B2), og dårlige, fra Cell Signaling, phosphoryleret AKT S473 fra Millipore, BH3-interagerende domæne død agonist (Byd) fra R D Systems (Minneapolis, MN), inaktive og aktive former af caspase 3 fra Santa Cruz og R Varian, Palo Alto, CA) under anvendelse af en protein-assay fra Cytoskeleton (Denver, CO, USA). Prøverne blev kørt i SDS-PAGE og derefter blottet på nitrocellulose- eller PVDF ark. Signalet af den primære monoklonale eller polyklonale antistoffer blev påvist under anvendelse sekundær affinitetsoprenset ged anti-mus eller anti-kanin-immunoglobuliner koblet til peroxidase og et kemiluminescenssystemet (Pierce, Grand Island, NY) og eksponeret på røntgenfilm (Kodak; Rochester, NY). Intensiteten af ​​båndene blev vurderet ved at digitalisere billedet (J- Billede) fra X-ray film. Efter fratrække baggrunden, blev alle bandets intensiteter sammenlignet med kontrol.

Immunofluorescens

Immunofluorescens blev udført som beskrevet før [24]. Kort fortalt blev cellerne fikseret med 3% p-formaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter skylning blev cellerne permeabiliseret med 0,2% Triton X-100 i 5 min eller 0,1% saponin hele proceduren. Permeabilisering blev efterfulgt af quenching af aldehydgrupperne i 50 mM NH

4 cl. Celler blev derefter inkuberet med primært antistof fortyndet i 1% BSA i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask og inkubering med sekundært antistof blev cellerne monteret i 10% polyvinylalkohol, 30% glycerol, 1% n-propylgallat og Slow Fade (Molecular Probes, Invitrogen) ved en fortynding på 5: 1. Fluorescens billeder blev opnået ved hjælp af en EVOS fluorescens mikroskop (AMG, Bothell, WA).

Resultater

flavon A og flavoner B inducere apoptose og en cellecyklus skift

Vores tidligere data antyder, at flavoner A og B forårsager DNA-fragmentering på bedre og dårligt differentierede celler henholdsvis [20]. Annexin V assays blev udført for at bekræfte induktion af apoptose på tumorigen celler status efter dosering med flavoner. Apoptose blev detekteret 6 timer efter pancreascancer Panc-28 (Fig 1A) og coloncancer Caco-2 (Fig 1B) -celler blev doseret med 40 pM af flavon A. På samme måde blev apoptose detekteret 6 timer efter pancreascancer MIA Paca -2 (fig 1C) og tyktarmskræft HCT116 celler (fig 1D) blev doseret med 40 pM af flavoner B. for at kvantificere de apoptotiske forandringer som følge af de flavoner, celler doseret med køretøjet eller flavon, blev analyseret 6, 9 og 12 timer efter behandling via flowcytometri under anvendelse Annexin V /propidiumiodid. Ved 9 timer, Panc 28 celler behandlet med flavon A havde 2,9 gange stigning i apoptose (fig 2A og 2C). Ligeledes på 9 timer, HCT 116 celler behandlet med flavon B havde en 2,3 gange stigning i apoptose (fig 2B og 2C).

Apoptotisk effekt af flavon A ved en koncentration på 40 uM, om mere differentieret pancreas Panc28 og colon Caco 2 cancerceller (fig 1A og 1B), som bestemt ved Annexin V assay (grøn kanal) seks timer efter behandling. DAPI (blå kanal) anvendes til at lokalisere kernerne i cellerne. Celler behandlet med bærer alene (DMSO i en slutkoncentration på 0,27%) tjente som kontrol. Aktivering af apoptose på dårligt differentieret pancreas MIA PaCa og colon HCT116 cancerceller (fig 1C og 1D) af flavon B ved en koncentration på 40 uM, som bestemt ved Annexin V assay (grøn kanal) seks timer efter behandling. Kontrolforanstaltninger opfylder de samme som beskrevet ovenfor, og Dapi blev anvendt til at lokalisere kerner.

A. Apoptose blev påvist under anvendelse Annexin V-FITC og propidiumiodid i Panc 28 celler behandlet med 40 pM flavon A, 9 timer efter behandling. B. Påvisning af apoptose i HCT 116-celler behandlet med 40 pM flavon B, 9 timer efter behandling. C. Søjlediagram repræsentation af apoptose i Panc 28 og HCT 116 celler behandlet med flavon A og B henholdsvis. D-E. Celle cyklus Bestemmelsen gennemføres propidiumiodid i Panc 28 celler behandlet 40 uM flavon A. F-G. Cell cyklus bestemmelse i HCT 116 celler behandlet med 40 pM flavon B.

For at teste, om behandling med flavoner A eller flavon B havde en effekt på cellecyklus distributioner, flowcytometri assays under anvendelse propidiumjodid blev udført. Bedre differentierede pancreasceller Panc 28 celler blev behandlet med flavon A (Fig 2D og 2E). Efter 9 timer, er et skift fra G0 /G1 til S og G2 faser tydeligt ses. Dårligt differentierede kolon kræftceller HCT 116 blev behandlet med flavoner B. Et lignende skift fra G0 /G1 fasen til S og G2 faser er tilsyneladende 9 timer efter behandling (fig 2F og 2G).

flavon A har en hæmmende effekt på phosphoryleret ERK og S6, men har ingen effekt på AKT eller c-jun i bedre differentieret Panc28 og Caco-2 kræftceller

for at bestemme den mekanisme ansvarlig for den cytotoksiske effekt på bedre differentierede kræftceller observeret efter behandling med flavon A, proliferativ, overlevelse og apoptotiske signalveje blev undersøgt. Tyktarmskræft Caco-2 og bugspytkirtelkræft Panc28 celler blev doseret med 40 pM af flavoner A og niveauer af aktiverede AKT blev ERK, S6, og c-jun analyseret. Som vist i fig 3A og 3C, dosering Panc 28 celler med flavon A inducerede en gennemsnitlig reduktion af den phosphorylerede form af ERK til 64,27% (51,84% -74,83%, p = 0,0029) og PS6 til 52,58% (37,90% -62,50 %; p = 0,012) sammenlignet med kontrollen. I Caco-2-celler, var den gennemsnitlige reduktion af phosphoryleret ERK af flavon A var at 42.58% (25,38% -55,64%, p = 0,0031), og 57.99% (43.84% -77,36%, p = 0,0138) for PS6, sammenlignet til kontrollen. Ingen ændring blev observeret i ekspressionsniveauerne af de unphosphosphorylated proteiner analyseres (Fig 3A). Disse immunblotresultaterne blev bekræftet ved immunofluorescens. Phosphorylerede ERK resultater i Caco-2 celler er vist i fig 3E. Endvidere er de aktiverede former af AKT ved serin 473 og c-Jun på serin 73, blev også undersøgt som disse proteiner regulerer både celleoverlevelse og stress-induceret apoptose hhv. Ingen af ​​disse påvist signifikante ændringer i Panc-28 og Caco-2 cellelinjer (Fig 3A og 3C)

A og B:. Påvisning af de aktiverede og ikke-phosphorylerede former af ERK, c-Jun, S6, AKT ved immunoblot af de samlede SDS-ekstrakter. Bedre differentierede Panc28 og Caco 2-celler blev behandlet med 40 uM af flavon A (+ A), og dårligt differentieret MIA PaCa og HCT116 celler med flavon B (+ B) eller DMSO (-) opløsning køretøjet. Efter lysis og SDS-PAGE blev membraner probet med det angivne antistof. Membranerne blev testet igen for actin som en loading kontrol, og en repræsentant billede er tilvejebragt. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. C og D: Til kvantificering (grafer) bandets tætheder fra de behandlede /ubehandlede betingelser identificeret af (+) eller (-), var normaliseret og beregnet som procentdele af værdien for de ubehandlede celler (100%), og viste gennemsnit ± standardafvigelser fra tre uafhængige eksperimenter (* p 0,05). E og F:. Påvisning af phosphoryleret ERK efter behandling af CaCo 2-celler med flavon A og HCT116-celler med flavon B ved immunofluorescens

Forøget ekspression af fosfor-c-jun (S73) og ERK var observeret efter behandling af dårligt differentierede MIA PACA og HCT116 kræftceller med flavoner B

En gennemsnitlig stigning til 190,19% af aktiverede ERK i bugspytkirtelkræft MIA Paca celler (175,32% -204,08%; p = 0,0036, n = 3 ), og 160,23% i Colon cancer HCT116 celler (144,99% -174,22%; p = 0,012, n = 3) blev observeret efter behandling med flavon B (fig 3B og 3D) sammenlignet med kontroller. Ingen ændring blev observeret i ekspressionsniveauerne af de unphosphosphorylated proteiner analyseres (fig 3B). Disse immunblotresultaterne blev bekræftet ved fluorescensmikroskopi og phosphorylerede ERK resultaterne er vist for HCT-116-celler (fig 3f). Også observeret var øget niveauer af den phosphorylerede form af c-jun (S73) i MIA PaCa på 170,83% fra kontrol niveauer (162,27% -181,90%; p = 0,0008, n = 3), og i HCT116 på 271,34% (222,95 % -312,93%, p = 0,0028, n = 3) som vist i fig 3B og 3D

flavon B har uens effekt på PS6 i MIA PaCa og HCT116-celler, men har ingen effekt på phosphoryleret AKT

Efter behandling af MIA PACA celler med flavon B, var de gennemsnitlige niveauer af PS6 er faldet til 51,68% (19,95% -77,77%, p = 0,0237, n = 3) i forhold til kontrol, som det ses i fig 3D. Omvendt efter behandling af HCT116 celler, en stigning på 149,88% (fra 136,54 til 170,22; p = 0,0116, n = 3) observeres, sammenlignet med kontrollerne. Ekspressionsniveauerne af phosphoserin 473 AKT, var uændret efter behandling af MIA PaCa og HCT116 celler med flavon B som vist i fig 3B og 3D.

flavon A modulerer BAD phosphorylering i serin 112, men ikke flavon B

for yderligere at undersøge forskellene i cellulære effekt af flavoner A og flavon B, blev phosphorylering status BAD ved serin 112 undersøgt. Cellelinjer Panc-28 og Caco-2 doseret med flavon En udviser en nedgang i phosphoryleret BAD ved serin 112 (Fig 4A). Denne reduktion havde en middelværdi på 35.91% (34,21% -37,61%, p = 0,006, n = 3) i Panc-28, og 57.03% (42.12% -71,62%, p = 0,0068, n = 3) i Caco-2 celler (fig 4C). Disse observationer blev bekræftet via immunfluorescens for Panc-28 som vist i fig 4E. Omvendt dosering MIA PACA-2 og HCT116 tumorigene celler med 40 pM af flavoner B producerede ingen signifikant ændring i den totale mængde phosphoryleret BAD ved serin 112 som vist ved western blot (Fig 4B og 4D) og immunofluorescens for MIA Paca-2 ( fig 4F). Mens der ikke er nogen signifikant ændring observeret i ekspressionsniveauerne af ikke-phosphoryleret BAD i bedre differentierede celler (Fig 4A), observeres en lille stigning i de ringe differentierede celler (Fig 4B)

A og B:. Påvisning af tabet af fosforylering af BAD ved immunoblot af de samlede SDS ekstrakter. Bedre differentierede Panc 28 og CaCo 2-celler blev behandlet med 40 uM af flavon A (+ A), og dårligt differentieret MIA PaCa og HCT116 celler med flavon B (+ B) eller DMSO (-) opløsning køretøjet. Efter lysis og SDS-PAGE blev membraner probet med et antistof specifikt for BAD phosphoryleret i serin 112 eller ikke-phosphoryleret protein. Membranerne blev testet igen for actin som en loading kontrol. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. C og D: Til kvantificering (grafer) bandets tætheder fra de behandlede /ubehandlede betingelser identificeret af (+) eller (-), var normaliseret og beregnet som procentdele af værdien for de ubehandlede celler (100%), og viste gennemsnit ± standardafvigelser fra tre uafhængige eksperimenter (* p 0,05). E og F: Påvisning af phosphoryleret BAD ved serin 112 (rød kanal), efter behandling af Panc 28 celler med flavoner A og MIA Paca celler med flavoner B ved immunfluorescens. DAPI (blå kanal) blev anvendt til at lokalisere kerner.

flavon A kan inducere apoptose via caspase 9

For at bestemme om caspase 9 deltager i den apoptotiske kaskade initieret af flavon A, Caco-2 og Panc28 celler blev doseret og analyseret ved SDS PAGE efterfulgt af immunoblot for tilstedeværelsen af ​​spaltede fragmenter af 37 og 17 kDa med et antistof stand til at detektere aktiverede caspase. Fig 5A viser et repræsentativt immunblot af Caco-2, og fig 5B for Panc28 celler fra lysater taget på forskellige tidspunkter efter dosering med flavon A. Begge cellelinier vise store fragmenter, 37 og 35 kDa, der detekteres af antistoffet (Fig 5A og 5B). KDa fragmentet 37 er tydelig i kontrollen (celler doseret med vehikel), hvilket tyder deregulering af proteinet i disse cellelinier. Men en gradvis reduktion i niveauet af ekspressionen af ​​procaspase 9 (47kDa) er tydelig start 3 timer efter dosering.

Påvisning af aktiveret caspase 9 ved immunoblot af SDS ekstrakter af A. CaCo 2 og B. Panc 28 celler 1,5, 3, 6, 9 og 12 timer (bane 2-6) efter behandling med flavon A eller vehikel (DMSO) til kontrol (C, bane 1) og SDS-PAGE. Membranerne blev probet med et antistof, der kan detektere både procaspase (47 kDa) og de store fragmenter resulterende efter aktivering (37 og 35 kDa). Membranerne blev testet igen for actin eller tubulin som en loading kontrol. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Membranerne blev testet igen for actin eller tubulin som en loading kontrol. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

flavon B hverken phosphorylere c-jun på threoniner 91 og 93 eller aktivere caspaser 8 og 10 i HCT 116 eller MIA Paca celler

at bekræfte flavon B aktivering af den apoptotiske program via ydre vej uden inddragelse af den indre vej, studerede vi phosphoryleringssteder former af c-Jun relevante for indgrebet af mitokondrierne via spaltning af caspase 8 [25, 26]. HCT 116 og MIA Paca celler doseret med flavon B viser ikke aktivering af c-Jun på threoniner 91 og 93 som vist i fig 6A via immunfluorescens i HCT 116-celler. Breast cancer SKBR3 celler doseret med tamoxifen, en positiv kontrol for denne aktivering [27], blev forarbejdet på samme måde som beskrevet ovenfor (Fig 6B). Dette resultat blev bekræftet ved immunoblot som vist i fig 6C. Undersøgelse af aktiveringsstatus af caspaser 8 og 10 i disse celler efter behandling med flavon B udviste ingen spaltning af dette protein i enten HCT 116 eller MIA Paca celler. Dette er tydeligt ved tilstedeværelsen af ​​de uspaltede caspaser på forskellige tidspunkter spænder fra 1,5-12 timer. Repræsentative immunoblotter af tidsforløbet forsøg til caspaser 8 og 10 i HCT 116-celler er vist i fig 6D og 6E henholdsvis.

A og B. Immunofluorescens af behandlede celler viser ekspression af phospho-c-jun (T91 /T93 ) i SKBR3-celler (grøn kanal), men ikke på HCT116 celler. DAPI (blå kanal) blev anvendt til at lokalisere kernerne. C. Immunblot phospho-c-jun (T91 /T93) ved anvendelse af SDS ekstrakter af dårligt differentieret HCT116-celler behandlet med 40 uM af flavon B (+ B), eller opløsning køretøj DMSO (-). SDS lysater fra SKBR3 celler behandlet med 10 pM tamoxifen (+) blev anvendt som en positiv kontrol. Efter SDS-PAGE blev nitrocellulosemembraner probet med et antistof specifikt for denne phosphorylerede form. D. Påvisning af caspase 8 ved immunoblot af SDS lysater af HCT116 celler 1,5, 3, 6, 9 og 12 timer (bane 2-6) efter behandling med flavon B eller vehikel (DMSO) til kontrol (C, bane 1) og SDS-PAGE. Membranerne blev probet med et antistof, der kan detektere både procaspase (54/55 kDa) og fragmenterne resulterende efter aktivering (43 og 18 kDa). Membranerne blev testet igen for actin eller tubulin som en loading kontrol. De viste resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Vi havde tidligere vist forskellen antineoplastiske virkninger af flavoner A og B på kræftformer celler i brystet (MCF7, SKBR3) , colon (CaCo-2, HCT116), pancreas (Panc 28, MIA PaCa) og prostata (LNCaP, PC3) med forskellig differentiering status. De flavoner blev udvundet fra

G

.

elegans

A

.

bogotensis

, planter med lignende medicinske egenskaber, der således anvendes indistinctively efter ethnobotanical undersøgelser. Men flavoner er ikke forbeholdt disse arter. Flavon A er blevet fundet i

Ainsliaea henryi

[28], og i

Helichrysum decumbens [29]

mens flavon B er blevet isoleret fra

Helichrysum graveolens

[30], som samt

Helichrysum odoratissimum

[31], og

Helichrysum compactum

[32]. Flavoner A og B viste en signifikant cytotoksisk virkning mod stærkt tumorigene cellelinjer, samtidig skåne normale epitelceller. Specifikt flavon A demonstrerede høj cytotoksicitet mod mere differentieret Panc28 og Caco-2-celler, mens flavon B viste en præference for dårligt differentieret MIA PaCa, HCT 116, og SKBR3 celler [20]. Celle fordoblingstid, og tilstedeværelsen af ​​specifikke differentiering og polaritet markører anvendes til at bestemme cellulær differentiering status. Blandt cellerne vi testede, er Panc28 tidligere blevet beskrevet som dårligt differentieret hovedsagelig på grund af fraværet af polaritet markører er til stede i andre pancreatiske cellelinjer, såsom Capan-1, til trods for at det har en temmelig lang celle fordoblingstid. Men det er den generelle konsensus, at Panc 28 celler har en højere differentiering status end MIA Paca celler [33], og vores resultater tyder på, at flavoner kan være følsomme over for denne forskel. For bedre at forstå den mekanisme, hvormed den apoptotiske program initieres ved flavoner A og B i deres målceller, vurderede vi virkningen af ​​hver flavon på tasten ydre og indre apoptosecyklus proteiner, såsom ERK, PS6, AKT, BAD, og ​​c -JUN i deres aktiverede former.

Vores resultater antyder, at flavon A kan inducere apoptose i bedre differentierede pancreas og colon cancerceller, via den mitokondriske indre vej. Dette er tydeligt ved faldet i phosphoryleret ERK og S6 og efterfølgende tab af aktiveret BAD. Phosphorylering holder BAD i cytoplasmaet, og dens tab resultater i binding og inaktivering af overlevelse proteiner Bd-XL eller bcl-2 efter at have krydset mitokondriemembranen [34] og derved aktivere apoptose. Et signifikant fald af fosforyleret BAD ved serin 112 er observeret i bugspytkirtelkræft Panc 28 og tyktarmskræft Caco-2 celler efter behandling med flavoner A. Aktiveringen af ​​BAD ved serin 112 er medieret af MAPK pathway, specielt via aktivering af Ras- Raf-ERK [35]. Inhiberingen af ​​phosphoryleret ERK og S6 observeret efter behandling med flavon A, kunne være opstrøms for tab af aktiveret dårlige til serin 112 og den efterfølgende initiering af apoptose via afbrydelse af mitokondrielle membran integritet og frigivelse af cytochrom c og andre apoptotiske faktorer. Disse begivenheder kan føre til aktivering af caspase 9 og effektor-caspaser. Men caspaser meget dereguleret i kræft gennem forskellige mutationer eller tab af udtryk [36]. I tilfælde af caspase 9, disse er ualmindelige, og det er ophævelsen af ​​post mitochondriale funktionelle aktiviteter, der fremmer tumorprogression [37]. Dette kan være tilfældet i vores caspase 9 resultater, hvor aktiverede caspase er til stede i kontrol og behandlede celler, hvilket kan tyde tab af apoptotiske funktion. Det er vigtigt at bemærke, at forringet mitokondriel integritet kan udløse en standard caspase 9-uafhængig program af celledød [38]. Hvorvidt apoptose forekommer uafhængigt af caspase 9-aktivitet eller ved at skabe et gunstigt forhold af aktive versus inaktive caspase, som det ses i vores resultater, præsenterer vi beviser, som understøtter aktivering af en indre vej. Derudover vores resultater viser også, at hverken AKT eller c-jun er involveret i den foreslåede virkningsmekanisme for flavoner A.

Omvendt flavoner B inducerer apoptose i dårligt differentierede kræftceller i bugspytkirtlen og tyktarmen via en ydre vej.