Abstrakt
I tyktarmskræft, en meget aggressiv sygdom, progression gennem den maligne sekvens er ledsaget af stadig mere talrige kromosomale omlejringer. At kolonisere målorganer, invasive celler krydser flere væv af forskellige elasticitetsmoduler. Hvorvidt bløddele stiger malignitet eller i kontrast grænser invasive kolon celle spreder stadig et åbent spørgsmål. Brug af polyelektrolyt flerlagsfilm efterligner mikromiljøer af forskellige elasticitetsmoduler, vi viste, at human SW480 colon cancerceller vises stigende hyppighed i kromosomale adskillelse abnormaliteter ved dyrkning på substrater med aftagende stivhed. Vores resultater viser, at selv om faldende stivhed korrelerer med øget celle letalitet, har en betydelig del af SW480 cancerceller undslippe fra de bløde substrater, selv når der bærer unormal kromosom segregering, opnå mitose og gennemgå en ny cyklus af replikation i modsætning til human colon HCoEpiC celler, som døde på bløde underlag. Denne observation åbner muligheden for, at evnen af kræftceller til at overvinde fejl i kromosom adskillelse på meget bløde underlag kunne bidrage til øget kromosomale rearrangementer og tumorceller aggressivitet
Henvisning:. Rabineau M, Kocgozlu L, Dujardin D, Senger B, Haikel Y, Voegel JC et al. (2013) bidrag Soft Substrater til malignitet og Tumor Suppression under Colon Cancer Cell Division. PLoS ONE 8 (10): e78468. doi: 10,1371 /journal.pone.0078468
Redaktør: Thomas Claudepierre, Fakultet universitetet i Leipzig, Tyskland
Modtaget: April 15, 2013; Accepteret: September 13, 2013; Udgivet: 22 oktober, 2013 |
Copyright: © 2013 Rabineau et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af en bevilling fra Alsace Contre le Cancer. M.R. er i gæld til Faculté de Chirurgie Dentaire Strasbourg for finansiel støtte. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
i de sidste 10 år er det blevet klart, at celle adfærd ikke kun afhænger af kemiske signaler, men at mekaniske egenskaber af cellulære miljø spiller en så vigtig rolle. Dette spektarkulært fremgår af de skelsættende eksperimenter af DISCHER gruppe, som viste, at mesenchymstamceller enten kan differentiere til osteoblaster, fibroblaster eller neuroner afhængig af Young modulus adhæsion substrat [1]. Det er også godt accepteret, at forskellige celletyper brug substrater af forskellige Unge moduli til korrekt klæbe og formere sig. Osteoblaster kræver Unge moduli i intervallet fra MPa til klæbe henviser fibroblaster klæbe på blødere underlag, hvis moduler på ca. 10 kPa [2] og neuroner vokse på ekstremt bløde substrater på ca. 1 kPa [1]. Disse markante værdier er i overensstemmelse med de unge moduler, der karakteriserer de væv omkring disse forskellige celletyper. Disse resultater er af afgørende betydning for eksempel i tissue engineering til at designe stilladser tillader en passende vækst af celler eller implantat integration. Alligevel vedhæftning er ikke det eneste aspekt, der kendetegner celle adfærd: celledeling er også et afgørende aspekt for celle skæbne. Vores gruppe begyndte for nylig at undersøge indflydelsen af de mekaniske egenskaber af substratet, på celledeling [3]. Disse data fremhæves, at de mekaniske egenskaber af substratet spiller en kritisk rolle i kromosom segregering under mitose af epitelceller. Faktisk vi observeret en gradvis stigning i kromosomal segregation abnormiteter med faldende substrat stivhed i ikke-kræft rotte kænguru nyreceller pTk2- [3]. Desuden bløde substrater (under 50 kPa) blev beskrevet som en fysisk barriere mikromiljø næsten fuldstændig inhibering af pTk2- celler [3].
I de seneste år, er det blevet fastslået, at væv stivhed påvirkninger tumorprogression og kan fremme den maligne opførsel [4-6]. Ved at indføre cancerceller i 3-dimensionelle fibrin matricer, Liu et al. viste, at bløde matricer af Young modulus ca. 100 Pa fremmet væksten af runde kolonier med stigende aggressivitet når xenotransplanteret i immunsvækkede mus [7]. For ganske nylig, Tang et al. afslørede dæmpningen af celle mechanosensitivity af tumorceller, når de dyrkes på bløde substrater [8]. I tyktarmskræft, en meget aggressiv sygdom, progression gennem den maligne sekvens er ledsaget af stigende kromosomale rearrangementer [9-12]. At kolonisere målorganer, invasive celler krydser flere væv af forskellige elasticitetsmoduler (som eksempel, 175, 918, 320, 120 og 640 Pa for basalmembran, stroma, lymfe, lymfeknude og lever, henholdsvis) [2,4] og, mens de fleste af disse celler dør under deres rejse, få modstå og kan generere metastaser [13]. Hvorvidt bløddele stiger malignitet eller i kontrast grænser invasive celle spreder stadig et åbent spørgsmål. Brug af polyelektrolyt multilag-film (PEM) [14-18], vi viste, at human SW480 colon cancerceller vises stigende hyppighed i kromosomale adskillelse abnormaliteter ved dyrkning på substrater med aftagende stivhed (figur 1) og [3]. I nærværende papir, rapporterer vi, at substrater med stivhed på 50 kPa og lavere årsag massiv død mitotiske celler, men at få celler modstå og opnå mitose ved at overvinde unormal kromosomal segregation. Til dette formål blev synkroniseret SW480-celler podet på en række film fremstillet af en poly-L-lysin /hyaluronsyre (PLL /HA)
24 stratum lukkes med poly (styren) sulfonat /polyallylamin (PSS /PAH)
n
lag (
n
= 0, 1 og 2; stigende
n
øger substrat stivhed [19]) og efterfulgt af live-cell imaging.
Fisher Exact Test viser andelen på E
50 (18 celler med kromosom anomalier på 121 analyserede celler) er væsentligt anderledes end på glas (6/153,
s
0,003), og andelen på E
20 (14/78) er væsentligt anderledes end på glas (
s
0,001). De fejl søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller.
Resultater og Diskussion
1. Indflydelse af blødt underlag på tumor mitotiske progression
For at afgøre om tumorceller er i stand til fremskridt gennem mitose på meget bløde underlag, SW480 celler, synkroniseret ved hjælp af den mitotiske ryste-off metoden, blev podet på PEM-film med faldende stivhed (Young moduli aftager fra 50 ned til 0 kPa, tabel 1) og efterfølges af live-cell imaging løbet 2h30. Filmene blev sammensat af en (PLL /HA)
24 stratum lukkes med en anden (PSS /PAH)
n
stratum (
n
= 0, 1 og 2 ). Et typisk eksempel på konfokal z-sektion observation af en film sammensat af PLL /HA stratum og PSS /PAH capping er vist i figur 2. Selv om overfladekemien af glas og af polyelektrolytten multilag er anderledes, vi påvist i en tidligere arbejde at mængden af FBS-proteiner afsat på overfladen er afhængig hverken på overfladen kemi eller om antallet af lag, der udgør polyelektrolyt multilag film [16]. Desuden celler føler væsentlige de proteiner fra serummet, der adsorberer på før celle deposition overflade. den vigtigste parameter, der skifter mellem glas, E0 og E50 /E20 er således stivhed og det bør være til grund for forskellene i celle adfærd observeret i vores system. På E, celler hurtigt gik
0 gennem en lytisk proces, som angivet ved frigivelse af cytoplasmaet i dyrkningsmediet observeret i 100% af tilfældene (figur 3A, pilespids i række E
0, Film S1). Men på E
50 og E
20 substrater, opfølgningen af kromosom adskillelse, DNA dekondensering og cytokinese (figur 3A og Movie S2-S4) viste, at henholdsvis 60% og 10% af cellerne var i stand til at opnå mitose i 2h30 (figur 3C). De resterende celler enten lyserer (18% på E
50 og 88% på E
20) eller holdes blokeret i mitose (22% på E
50, og 2% på E
20). Tilghman et al. viste, at cancerceller dyrket på bløde polyacrylamid gel substrater udviste en længere cellecyklus, skyldes en forlængelse af G1-fasen af cellecyklussen, sammenlignet med cancerceller vokser på mere stive substrater [20]. For at demonstrere, at den betydelige andel af SW480 celler i stand til at komme videre i mitose på E
50 var relateret til kræft karakter af disse celler, blev deres adfærd i forhold til de af de ikke-kræft humane colon epitelceller HCoEpiC. Produktion af mitotiske HCoEpiC celler ved mekanisk shakeoff blev stærkt reduceret. Således blev standard asynkron HCoEpiC cellekulturer anvendes til at undersøge indflydelsen af E
50 på humane colon epitelceller. Resultaterne viser, at efter 6 timer af kultur på E
50, asynchronized HCoEpiC celler vedtaget en rund morfologi (figur 4A) i modsætning spredningen formen af disse celler observeret på glas (figur 4A). På E
50, HCoEpiC celler gik gennem en lytisk proces, som angivet ved frigivelse af cytoplasmaet i dyrkningsmediet i 100% af tilfældene (figur 4A). Nogle af disse celler viste fragmentering af deres kerne tyder død ved apoptose (figur 4C). I overensstemmelse med disse observationer, kunne ingen samling af mikrotubuli og actinfilamenter skal overholdes af immunofluorescens eksperimenter med antistof specifikt for α-tubulin og phalloidin (figur 4C). Alle interfase HCoEpicC celler døde på E
50 (figur 4B) afslører, at disse celler er naturligvis ude af stand til at gøre fremskridt i cellecyklus og at genindtræde i mitose. Vi kan påpege, at vore undersøgelser blev udført på substrater med Young moduler i området 1-50 kPa og vi observeret, at ikke-cancerceller ikke kunne overleve på sådanne bløde substrater. Dette resultat synes ved første øjekast selvmodsigende med observation af celledeling i tyktarmen, hvis Young modul er 2-25 kPa [21]. Men i colon celler er i en specialiseret 3D væv med celle /celle kontakter, som har stor indflydelse celle adfærd. En sådan effekt er ikke gengivet i vores 2D in vitro eksperimenter. Ikke desto mindre er vores in vitro-model er mere passende for enkelt tumorceller eller små grupper af celler, der undslipper tumormassen at invadere stroma og engagere sig i den proces, der fører til metastase dannelse efter en lang rejse gennem væv af forskellige Unge moduli. Samlet set viser vores resultater, at faldet i stivheden korrelerer med en stigning i celle letalitet in vitro for raske såvel som kræftceller. Ikke desto mindre meget vigtigt, observerede vi, at nogle kræftceller kan flygte fra meget bløde substrater og kan opnå mitose. Disse resultater er yderst relevante for både normal homeostase af faste væv og patologiske indstillinger.
Arkitektur
E
ap (kPa)
en
Notation
(PLL /HA)
24 ~ 0E
0 (PLL /HA)
24 – (PSS /PAH)
1 ~ 20E
20 (PLL /HA)
24 – (PSS /PAH)
2 ~ 50E
50Table 1. tilsyneladende elasticitetsmodul af (PLL /HA)
24- (PSS /PAH)
n
med
n
= 1 og 2.
filmene blev sammensat af en hyaluronsyre /poly-L-lysin (HA /PLL)
24 stratum lukkes med en anden poly (styren) sulfonat /polyallylaminhydrochlorid (PSS /PAH)
n
stratum. Filmene blev karakteriseret ved deres Youngs modul (
E
ap: tilsyneladende elasticitetsmodul), bestemt ved atomic force mikroskopi nano-indrykning eksperimenter, hvilket vil svare til den reelle elasticitetsmodul af laget, hvis det opførte strengt elastisk. Elasticitetsmodulet af den native (PLL /HA)
24 arkitektur er ca. 0 kPa.
a Værdier taget fra [19]. CSV Hent CSV
Lodret snit billede af en (PLL /HA)
23-PLL
FITC-HA- (PSS /PAH)
2-PSS
Rho-PAH flerlaget film observeret af CLSM.
A) efter såning af synkroniserede SW480 celler på glas, E
50, E
20 og E
0, time-lapse billede blev taget hver 5 min til 2h30; repræsentative billeder vises. Pilen angiver den indledende position af den mitotiske celle. Flettede billeder af fluorescens (DNA i rødt) og fase kontrast (i gråt); Målestokken: 20 pm. B) Time-lapse overvågning kromosom segregering i SW480 celler udført som beskrevet i A. Repræsentative billeder af kromosom adskillelse abnormiteter vises for E
50 og E
20; Målestokken: 10 um. C) Procentdel af SW480 celler fuldfører mitose overvejes i A, bestemt på to poolede uafhængige forsøg. Fisher Exact Test viser, at andelen af celler, der fuldfører mitose på E
50 (46 celler på 77 celler i mitose) er væsentligt mindre fra andelen på glas (185/212,
s
0,001) . Andelen på E
20 (16/161) er betydeligt mindre end på E
50 (
s
0,001) og andelen på E
0 (0/146) er betydeligt mindre end på E
20 (
s
0,001). D) Procentdel af celler med tilbagestående kromosomer. I C, D, fejlen søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller
A) Repræsentative billeder af HCoEpiC celler efter 6h kultur på glas og på E
50, pilespids indikerer en lyseret celle.; Målestokken: 50 um. B) Procentdel af lyserede HCoEpiC celler behandlet i A, bestemt på to poolede uafhængige forsøg. Fisher Exact Test viser andelen af lyserede celler på glas (5/142) er betydeligt mindre end på E
50 (112/112,
s
0,001). De fejl søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller. C) Fluorescens billeder af DNA, α-tubulin og actin efter 6h kultur på E
50 fra faste HCoEpiC celler; skala bar: 20 pm
2.. Adfærd af tumorceller, der bærer kromosom adskillelse abnormiteter
Time-lapse overvågning kromosom adskillelse viste, at SW480 celler podet på E
50 og E
20 vises halter kromosomer (figur 3B, pile), der angiver fejl i kromosomal segregation mekanismer. I slutningen telofase, kernerne reformeret og cytokinese afsluttet (figur 3B, 3D og film S5 og S6). Blandt SW480 celler forløber gennem mitose 4,8%, 11% og 13% viste kromosom adskillelse abnormaliteter på glas, E
50 og E
20,. Disse resultater viste, at på trods af stigende hyppighed af abnormaliteter induceret af bløde underlag, nogle SW480 kræftceller er i stand til fremskridt gennem mitose. Hvilket er i overensstemmelse med observation af stive substrater, celler med deficiente spindel checkpoint mekanismer kan fortsætte gennem mitose selv i nærvær af kromosomer misconnected til spindlen [22].
3. Den β1-integrin engagement mitotiske tumorceller som reaktion på bløde underlag
Interaktioner med den ekstracellulære matrix gennem integriner har vist sig at påvirke forskellige aspekter af mitosespindelen organisation [23,24]. Især er det velkendt, at mitotiske celler bliver afrundet i forberedelse til cytokinese og blive siddende på substratet gennem tilbagetrækningsmekanismer fibre via integrin engagement [25]. Tilbagetrækningen fibre giver modstandskraft, der udbreder inden mikrotubuli at orientere mitosespindelen [23-26]. Vi dermed undersøgte effekten af forskellige underlag stivhed på β1-integrin i SW480 celler. Som svar på bløde underlag (E
50 og E
20), β1-integrin engagement målt ved ligand-induceret bindingssteder (aktiverede p1-integrin LIBS) hjælp konformationel-specifikke antistoffer var uændret i forhold til glas substrat (figur 5A-C, MAPK lane svarer til kontrol loading). Interessant, er disse data i modsætning til en tidligere undersøgelse ved hjælp af ikke-tumor pTk2- celler viser progressivt aftager af β1-integrin engagement på bløde underlag [3]. Disse observationer er i overensstemmelse med andre undersøgelser, der påviser, at murine brystkræftceller bevarer høje niveauer af aktiv β1-integrin efter 24 kultur på en blød underlag [27]. Integrin ophobning i cellen midten zone er også nødvendigt at inducere mitotisk celleadhæsion og støtte cytokinese ved at tilvejebringe mekanisk forankring for den kontraktile actomyosin ring [28]. For at undersøge lokalisering af β1-integrin, immunfluorescens udført i celler i telofase afslørede β1-integrin ophobning i midten af kroppen, på E
50 og E
20, ligesom på glas (figur 5D). På glas, E
50 og E
20 actin akkumuleret også i denne celle midt zone (figur 5D). Disse resultater tyder på kontinuerlig β1-integrin engagement under mitose trods de bløde underlag, kompatibel med inddragelse at støtte cytokinese.
A) Western blots af β1-integrin LIBS og MAPK protein til SW480 celler seedet 30 min post-synkronisering på glas, E
50 og E
20. Histogram viser de tilsvarende scanninger fra B) β1-integrin LIBS og C) P44 /P42 MAPK kontrol lastning. Representant resultater fra 2 uafhængige eksperimenter (fejlsøjlerne repræsenterer S.E.M .; en arbitrær værdi på 1 blev tilskrevet middelværdien svarende til celler på glas). D) α-tubulin og β1-integrin fordeling 30 min post-synkronisering på glas, E
50 og E
20 fra faste SW480 celler, overlejring af celler med anti-α-tubulin (grøn) og anti-β1 -integrin (rød) (α-tubulin /β1-integrin). Pil angiver en fin spids af β1-integrin koncentreret om mid-krop. Repræsentative billeder vises i 2 uafhængige eksperimenter for i alt 10 celler for hver betingelse; Målestokken: 10 um. På glas, E
50 og E
20 fra faste SW480-celler, overlejring af celler med DNA (blå) og actin (rød) (DNA /actin). Pilespids angiver actin akkumulering i cellen midten zone. Repræsentative billeder vises i 2 uafhængige eksperimenter for i alt 10 celler for hver betingelse; skala bar: 10 pm
4.. Mitosespindelen organisering af tumorceller som reaktion på bløde underlag
Vi næste kontrolleret mitosespindelen samling på bløde matricer ved immunfluorescens med anti-α-tubulin og DNA farvning med Hoechst. De mitosespindler af SW480 celler, synlige på stive underlag (glas), blev bevaret på E
50 og endda på E
20 (figur 6A og B). Dette resultat står i kontrast til den observeret for ikke-kræft mitotisk pTk2- celler podet på bløde matrix siden til Young modulus ≤ 50 kPa, kan mitosespindelen ikke observeres [3]. I overensstemmelse med vores levende celle analyse (figur 3B og D), unormale kromosom segregation begivenheder kunne observeres (figur 6B og D) imidlertid uden evidens for multipolære eller monopolære spindler på de forskellige substrater sandsynligvis på grund af p1-integrin indgreb bevares på meget blød substrat. Faktisk blev der observeret multipolære spindler til celler, som bærer muterede β1-integrin [23].
SW480 celler 30 min-2h post-synkronisering på glas, E
50 og E
20 fra faste celler. Billeder overlejres med anti-α-tubulin (hvid) og Hoechst for DNA (rød) (α-tubulin /DNA). Pilen angiver den mitotiske spindel, uden anomali (A), med anomali (B), pilespids angiver anomali; Målestokken: 10 um. C) Procentdel af SW480 celler med mitosespindelen fra A, bestemt på tre poolede uafhængige forsøg. Fisher Exact Test viser, at andelen af celler med en mitosespindelen på E
50 (93/140) er signifikant forskellig fra andelen på glas (139/142,
s
0,001). Andelen på E
20 (16/50) er betydeligt mindre end på E
50 (93/140,
s
0,001). D) Procentdel af celler, som bærer kromosomsegregering abnormiteter, blandt cellerne med mitosespindelen betragtes i C. I C og D, fejlsøjlerne repræsenterer 95% konfidensintervaller.
5. Rac1 ekspression af tumorceller som respons på bløde substrater
Rac1, proteiner af den lille GTPase Ras familie, er involveret i orienteringen af den mitotiske spindel og dens aktivitet stiger på plasmamembranen af polære sider under cytokinese [29 ]. Vi yderligere synkroniseret en samling af SW480 celler og analyseret Rac1 udtryk gennem Western blot eksperimenter [29]. Der var ingen forskel i Rac1 udtryk for mitotiske SW480 celler podet enten på bløde underlag (E
50 og E
20) eller på stift underlag (glas) (Figur 7A-C). Vores resultater viste, at mitotisk tumor SW480 celler opretholder Rac1 udtryk på bløde underlag. Tværtimod vi tidligere observeret, at ikke-kræft pTk2- celler gradvist aftager dette udtryk på bløde underlag [3]. Vigtigere, β1-integrin engagement og Rac1 udtryk vedligeholdes på bløde underlag (E
50, E
20) ikke var tilstrækkelig til, at massiv opdeling af tumor SW480 celler. Faktisk på disse substrater kun 60% (E
50) og 10% (E
20) af celler er i stand til at gøre fremskridt i mitose
A) Western blots af Rac1 og MAPK protein til SW480 celler på glas, E
50 og E
20, 30 min post-synkronisering. Histogrammet viser de tilsvarende scanner efter Rac1 (B) og for p44 /p42 MAPK (C). Representant resultater fra 2 uafhængige eksperimenter (fejlsøjlerne repræsenterer S.E.M .; en arbitrær værdi på 1 blev tilskrevet den gennemsnitlige svarende til celler på glas).
6. DNA-replikation aktivitet af tumorceller som respons på bløde substrater
For at bestemme om SW480-celler, der var i stand til fremskridt gennem mitose var i stand til igen at gå cellecyklus, vi undersøgte deres evne til at undergå DNA-replikation 4h efter at være blevet podet på forskellige substrater. SW480-celler podet på E
50 og E
20 show site af replikation ensartet fordelt i kernen (figur 8A) med henholdsvis 60% og 23% af celler med nuklear BrdU signal (figur 8B). Det er bemærkelsesværdigt, at de procentdele af SW480-celler inkorporerer BrdU korreleret med procentdelen af celler, der opnår mitose på E
50 og E
20 (figurerne 3C og 8B), hvilket antyder at SW480 celler i stand til at fuldføre kromosomsegregering på bløde substrater er endvidere i stand til at undergå en ny cyklus af DNA-replikation.
A) BrdU visualiseret ved indirekte immunofluorescens af SW480 celler 4h post-synkronisering på glas, E
50 og E
20; Målestokken: 10 um. B) Procentdel af celler med nukleare BrdU bestemt på tre poolede uafhængige forsøg. Fisher Exact Test viser, at andelen af celler med nukleare BrdU E
50 (108/170) er betydeligt mindre end den på glas (400/400,
s
0,001) og andelen på E
20 (35/150) er betydeligt mindre end på E
50 (
s
0,001). De fejl søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller.
Konklusion
Som konklusion, rapporterer vi, at trods massiv celledød på ekstremt bløde underlag (E
0), tumorceller som de SW480 tyktarmskræft celler, selv når der bærer unormal kromosom segregering, modstå de meget bløde underlag (E
20 og E
50) og opnå mitose. Disse resultater kan være yderst relevant for patofysiologien af kræft og udbredelse af tyktarmen tumorceller. Faktisk, deres kræft karakter i det mindste nogle af tumorcellerne kan hjælpe dem med at overvinde kromosomal segregation abnormiteter i forbindelse med ændringen i substratet stivhed og derfor undslippe de bløde substrater til at fortsætte deres rejse op til stedet for metastase-dannelse. Desuden kunne denne evne til at overvinde segregation abnormiteter resultere i flere kromosomale rearrangementer, hvilket kan bidrage til at øge tumorceller aggressivitet. Yderligere undersøger respons af tumorceller til fysiske miljømæssige ændringer kan bidrage til at identificere nye potentielle mål for anticancer-terapi. Salg
Materialer og metoder
1. Materialer og fabrikation af PEM
PLL (MW = 5,7 x 10
4 Da, Sigma, St. Quentin Fallavier, Frankrig) og HA (MW = 4,0 x 10
5 Da, BioIberica, Barcelona ) blev anvendt til opbygning (PLL /HA)
24 film, og PSS (MV = 7,0 x 10
4 Da, Sigma, St. Quentin Fallavier) og PAH (MV = 7,0 x 10
4 Da , Sigma) i (PSS /PAH)
n
capping film (
n
svarer til antallet af lagpar), der blev deponeret oven på (PLL /HA)
24 strata. PLL, HA, PSS, og PAH blev opløst ved 1 mg /ml i en pufferopløsning indeholdende 150 mM NaCI og 20 mM tris (hydroxymethyl) -aminomethan (TRIS, Merck) ved pH 7,4, og blev udført alle skylletrin i samme puffer. (PLL /HA)
24 lag og (PSS /PAH)
n
capping film blev fremstillet ved anvendelse af en dypning maskine (Dipping Robot DR3, Riegler Kirstein GmbH, Berlin, Tyskland), på objektglas (VWR Scientific, Fontenay sous Bois, Frankrig). Stivheden af (PLL /HA)
24- (PSS /PAH)
n
film stiger med antallet af deponerede PSS /PAH lagpar (tabel 1) [19]. De stenografi notation E
0, E
20 og E
50 er for (PLL /HA)
24, (PLL /HA)
24- (PSS /PAH)
n
film med
n
= 0, 1 og 2.
2. PEM karakterisering
CLSM observationer blev udført med Zeiss LSM 510 mikroskopet med x40 /1.4 olie nedsænkning objectif. FITC-fluorescens detekteret efter excitation ved 488 nm med cutoff dikroisk spejl 488 nm og emission båndpasfilteret 505-530 nm. Rho-fluorescens detekteret efter excitation ved 543 nm, dikroisk spejl 543 nm, og emission lang pasning filter 585 nm.
3. Celler og synkronisering
tyktarms adenocarcinom epiteliale SW480-celler (ATCC, CCL-228) blev dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen) suppleret med glutamax, 10% FBS (Invitrogen), 100 pg /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen), 0,025 U /ml insulin, 50 mg /ml hydrocortison og 1,25 mg /ml G418 holdt ved 37 ° C med 5% CO
2. Tre dage før synkronisering blev cellerne genudpladet på 1.2×10
4 pr cm
2. Celler blev synkroniseret ved mekanisk shakeoff. Mitotiske celler blev centrifugeret (800
g
, 7 min), resuspenderes i dyrkningsmedium, og genudpladet på 1.2×10
4 pr cm
2 på filmovertrukne dækglas til yderligere analyser. Menneskelig Colon epithelceller (HCoEpiC, ScienCell Research Laboratories) blev dyrket på Colon epitelcelle Medium (CoEpiCM, ScienCell Forskning Laboratories) suppleret med colon epitelial cellevækst supplement (CoEpiCGS, ScienCell Research Laboratories) og med penicillin /streptomycin opløsning (P /S, ScienCell, Research Laboratories) fastholdt ved 37 ° C med 5% CO
2. 2 populationsfordoblinger blev udsået på 5×10
5 på substrater for yderligere analyser pr cm
2.
4. Immunolabeling
Celler blev fikseret /permeabiliseret i 3,7% (w /v) PFA i PBS plus 0,1% Triton X-100 i 15 minutter og blokeret med 10% decomplemented FBS (Invitrogen). Celler blev inkuberet med β1-integrin (fortynding 1:20, Santa Cruz efterfulgt af rhodamin-konjugeret sekundært antistof (fortynding 1: 250, Santa Cruz), eller med anti-α-tubulin (fortynding 1: 100, Santa Cruz) efterfulgt af FITC-konjugeret sekundært antistof. (fortynding 1: 500, AnaSpec, CA) blev og DNA afslørede med Hoechst 33258 (20 ug /ml, Sigma) i DNA replikering undersøgelser, celler tidligere dyrket med BrdU (37 ° C) (1:50 , RPN 201, blev GE Healthcare) fast /permeabiliseret, inkuberet med anti-BrdU og DNase i 1 time ved 37 ° C (fortynding 1: 100, RNP 202, GE Healthcare), efterfulgt af TRITC-konjugeret sekundært antistof (1: 500 , AnaSpec).
5. DNA Replication
1,2 x 10
4 synkroniserede celler blev udsået per cm
2 og inkuberet med BrdU (37 ° C) (1:50 ;.. RPN 201, GE Healthcare) celler blev fikseret /permeabiliseret i 3,7% PFA i PBS plus 0,5% Triton X-100 i 15 min efter vask med PBS, cellerne blev inkuberet med anti-BrdU og DNase i 1 time ved 37 ° C (fortyndet 1: 100; RNP 202, GE Healthcare). Efter vask med PBS, cellerne blev inkuberet med TRITC-konjugeret sekundært antistof (1: 500; AnaSpec).
6. Fluorescensmikroskopi
Prøver blev monteret i Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). fluorescens billeder blev taget med Nikon Elipse TE200 med 63 × PL APO (1,4 NA) objectif udstyret med Nikon digitalkamera (DS-Q11MC med NIS-Elements software), og behandles med ImageJ (https://rsb.info.nih.gov /ij /).
7. Live-cell imaging
For at dividere analyser, celler blev inkuberet 20 min med Hoechst 33.242 (0,1 mikrogram /ml, Sigma) før mekanisk shakeoff, genudpladet på 1.2×10
4 pr cm
2 på filmovertrukket dækglas og monteret i en Ludin afdeling (Life Imaging Services, Basel Schweiz) ved 37 ° C, 5% CO
2, på en Leica DMIRE2 mikroskop udstyret med en 40 × HCX PL APO PH2 (0,75 NA) mål og en Leica DC350FX CCD (Leica FW4000 software). Billeder blev erhvervet hver 5 min til 2h30, ved fluorescens og fasekontrast.
8. Western Blot
Celler blev podet på overflader (Nunc) ved 2 × 10
5 pr cm
2 og inkuberet i 30 min post-synkronisering i dyrkningsmedium ved 37 ° C. Celler blev lyseret i 20 mM Tris-base, pH 8, (0,15 M NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 10% glycerol, 1 mM natriumorthovanadat indeholdende 1% protease inhibitor cocktail, Sigma). Ekstraktion blandinger rystet ved 4 ° C og centrifugeret (3 min, 13k rpm ved 4 ° C). Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af DC-proteinassay (Bio Rad, USA). Ens mængder af totale proteinekstrakter blev underkastet SDS PAGE (NuPAGE, Invitrogen, Frankrig) og overført til nitrocellulosemembraner (Iblot Transfer Stack, Invitrogen, USA) blokeret i T- TBS (0,1% Tween 20, 50 mM Tris-base, pH 7,6, 0,15 M NaCl) indeholdende 1% BSA (Euromedex, Frankrig) og probet natten over ved 4 ° C. Blots blev inkuberet 2 timer med primært antistof: p-integrin aktiverede LIBS, (klon B44) (fortyndet 1: 1000, Millipore), anti-Rac1 (fortyndet 1: 1000, Millipore) og p44 /p42 MAPK (fortyndet ved 1: 1000, cellesignalering, USA) blev anvendt. Blots blev inkuberet i 2 timer med HRP-konjugeret anti-kanin, anti-museantistoffer (fortyndet 1: 2000; GE Healthcare). Bånd blev påvist ved anvendelse ECL Western Blotting Analyse System kit (RNP2109, GE Healthcare). Autoradiogrammer blev kvantificeret med Kodak Digital Science 10 Software. Repræsentative middelværdier for mindst to uafhængige forsøg med standard fejl (fire tidspunkter pr band) præsenteres.
Støtte Information
Movie S1.
Movie svarende til figur 3A til SW480 celler på E
0.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s001
(AVI)
Movie S2.
Movie svarende til figur 3A til SW480 celler på E
50.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s002
(AVI)
Movie S3.
Movie svarende til figur 3A til SW480 celler på E
20.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s003
(AVI)
Movie S4.
Movie svarende til fig 3A til SW480-celler på glas.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s004
(AVI)
Movie S5.
Movie svarende til figur 3B for SW480 celler på E
50.
doi: 10,1371 /journal.pone.0078468.s005
(AVI)
Movie S6.
Movie svarende til figur 3B for SW480 celler på E
20.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.