PLoS ONE: Small Molecule amilorid modulerer oncogen RNA Alternativ splejsning til Devitalize humane cancerceller

Abstrakt

Alternativ splejsning indebærer differentieret exon udvælgelse af et gen afskrift at generere mRNA og protein-isoformer med strukturel og funktionel diversitet. Unormal alternativ splejsning har vist sig at være associeret med maligne fænotyper af cancerceller, såsom kemo-resistens og invasiv aktivitet. Screening små molekyler og lægemidler til modulering RNA-splejsning i human hepatocellulært carcinom cellelinie Huh-7, opdagede vi, at amilorid, adskiller sig fra fire pH-påvirkende amiloridanaloger, kunne “normalisere” splejsning af

BCL-X, HIPK3

og

RON /MISTR1

udskrifter. Vores proteomikanalyser af amilorid-behandlede celler detekteret hypo-phosphorylering af splejsning faktor SF2 /ASF, og nedsat niveau af SRp20 og to un-identificerede SR proteiner. Vi bemærkede endvidere nedsat phosphorylering af AKT, ERK1 /2 og PP1, og øget phosphorylering af p38 og JNK, hvilket antyder, at amilorid behandling nedregulerer kinaser og opregulerer phosphataser i signalveje, der vides at påvirke splejsning faktor protein-phosphorylering. Disse amilorid virkninger af “normaliseret” onkogen RNA-splejsning og splejsning faktor hypo-phosphorylering blev begge ophævet ved forbehandling med et PP1-inhibitor. Global exon array af amilorid-behandlede Huh-7-celler detekterede splejsningsmønster ændringer, der omfatter 584 exoner i 551 gentranskripter, hvoraf mange koder for proteiner der spiller vigtige roller i iontransport, cellulær matrixdannelse, cytoskeleton remodellering, og genom vedligeholdelse. Cellular funktionelle analyser afslørede efterfølgende invasion og migration defekter, cellecyklus forstyrrelser, cytokinese værdiforringelse, og dødbringende DNA nedbrydning i amilorid-behandlede Huh-7 celler. Andre human fast tumor og leukæmiceller, men ikke et par normale celler, viste lignende amilorid-ændrede RNA-splejsning med devitaliseret konsekvens. Denne undersøgelse tilvejebringer således mekanistiske fundament for udnyttelse lille molekyle modulering af RNA-splejsning for kræftmedicin

Henvisning:. Chang J-G, Yang D-M, Chang W-H, Chow L-P, Chan W-L, Lin H-H, et al. (2011) Små Molecule amilorid modulerer oncogen RNA Alternativ splejsning til Devitalize menneskelige kræftceller. PLoS ONE 6 (6): e18643. doi: 10,1371 /journal.pone.0018643

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: Oktober 6, 2010; Accepteret: 11. marts 2011; Udgivet: 9 juni 2011

Copyright: © 2011 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger NSC-95-2320-B-037-049 (LSG), NSC 95-2311-B-009-004-MY3 (HDH) og NSC 97-2627-B-009-007 (HDH) fra National Science Råd Taiwan og ved DOH95-B-11-TM007 (WKY) og DOH96-TD-i-111-TM003 (WKY) fra Department of Health Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Proteome kompleksitet udvides med alternativ splejsning (AS), til en proces, der involverer differentieret exon inklusion eller eksklusion af de samme præ-mRNA-molekyler producere forskellige mRNA og protein isoformer [1], [2]. AS processen styres af to høj konserverede protein familier: arginin /serin dipeptid gentagelser (SR) -relaterede proteiner og heterogene nukleare ribonucleoproteiner (hnRNP) -relaterede proteiner [3], [4]. SR proteiner indeholder en modulær todelt struktur omfattende en eller to motiver RNA anerkendelse ved N-terminalen og en RS domæne rig på arginin /serin-dipeptid-gentagelser ved C-terminalen [5], [6]. Funktionen af ​​de N-terminale motiver i SR proteiner involverer sekvensspecifik binding til exoniske splejsning exhancers. Den C-terminale RS domæne tjener som en generel aktivering domæne til splejsning ved at linke til en heterogen RNA bindende motiv [6]. SR proteiner regulerer valget af AS sites, der afviger fra kanoniske splejsningssteder, derfor fremme inklusion eller eksklusion af alternative exons. På den anden side er nogle hnRNPs, såsom hnRNPA1, kan modvirke som funktion af SR proteiner ved binding til exoniske splejsning lyddæmperelementer [7].

AS derfor regulerer genekspression ved at generere diskrete proteinisoformer involveret i særskilte funktioner af cellulære begivenheder, såsom apoptose, kønsbestemmelse, axon vejledning, celle excitation, og celle sammentrækning [8], [9]. AS også spiller en central rolle i udviklingen af ​​menneskelige arvelige sygdomme og kræft [10], [11], [12], [13], [14]. Aberrant AS fra proto-onkogener og /eller tumorsuppressorgener kan bidrage til cellulære maligne fænotyper, såsom resistens over for apoptose, fremme af invasion og metastase, og stimulering af tumorangiogenese [11], [12], [13], [14 ]. Postulere, at modulere disse cancer-relaterede gener kan have stor indflydelse på deres patogene aktiviteter, har vi været på jagt efter små molekyler eller narkotika med modulerende virkninger på AS. I denne undersøgelse har vi fundet, amilorid, en kendt diuretikum, kan ændre onkogen AS i humant hepatocellulært carcinom Huh-7-celler såvel som i flere andre humane cancer og leukæmi cellelinjer, og dermed undersøge de underliggende molekylære og cellulære mekanismer for mulige terapeutiske implikationer.

Resultater

amilorid “normaliserer” isoformen RNA splejsning af

BCL-X, HIPK3

RON /

MISTR1 i Huh -7 celler

Det er for nylig blevet klart, at ubalanceret RNA-splejsning af visse gener er forbundet med maligne egenskaber af humane cancerceller [11], [12], [13], f.eks resistens mod kemoterapi og strålebehandling med

BCL-X,

kræftpsykologisk udviklingsmæssigt udifferentieret tilstand med

HIPK3,

og invasive metastatiske potentialer med

RON /MISTR1

. I hepatocellulært carcinom Huh-7 celler,

BCL-X

alternativt splejset ind antiapoptotiske store RNA isoform,

BCL-XL,

mere end pro-apoptotiske lille RNA isoform,

BCL-XS

[15];

HIPK3

splejses ind i exon 11-udelukkede U (-) samt exon 11-inkluderet U (+) isoformer for interaktion med Fas /FADD at modulere apoptose i den udviklingsmæssige proces [16]; og

RON /MISTR1

splejses ind i 5-kb i fuld længde (

flRON

) RNA og 2 kb exon 11-udelukkede

RON Hotel (

sfRON

) RNA isoformer, hvor sidstnævnte er blevet korreleret med epitelial til mesenkymale overgang i kræftcellen invasion og metastase [17], [18]. Efter screening mere end 500 små molekyler og narkotika, herunder i klinisk brug, fandt vi, at amilorid udøvede en potent effekt på AS af disse gentranskripter (figur 1A). Huh-7 celler behandlet med amilorid viste: (a) relativt fald på

BCL-XL

og forøgelse af

BCL-XS

RNA isoformer; (B) relativ vedligeholdelse af

HIPK3

U (-) og fald i

HIPK3

U (+) isoformer; og (c) reduktion af både exon 11 (+)

flRON

og exon 11 (-)

sfRON

RNA isoformer. Sådanne virkninger af amilorid var dosis- og tidsafhængig, være påviseligt ved 2 timer og mærket efter 24 timers inkubation med 0,5 mM amilorid. Disse observationer foreslog øget udnyttelse af den opstrøms alternativ 5′-splejsningssted inden exon 2 af

BCL-X

, øget exon 11 (U) udelukkelse af

HIPK3

og nedsat splejsning komplekser dannet for produktionen af ​​både

RON /MISTR1

exon 11 (+) og exon 11 (-) isoformer. Således kunne amilorid modulere AS disse tre gentranskripter til mindre ondartede “normaliserede” mønstre, der ligner de normale i tidligere rapporter [15], [16], [17], [18].

RNA blev ekstraheret fra Huh-7 celler udsat for vækstmedium indeholdende amilorid eller andre phi modulator amilorid derivater og undersøgt for den onkogene RNA alternativ splejsning ved RT-PCR, som beskrevet i Materialer og Metoder. Panel (A) viser, at amilorid øget brugen af ​​opstrøms alternativ 5′-splejsningssted i exon 2, der giver den apoptotiske Bcl-XS isoform (øverste række), øget exon 11 (U exon) springer af HIPK3 der øger den apoptotiske isoform (midterste række), og steg svagt exon 11 skipping af RON på 0,5 mM koncentration (nederste række). Panel (B) viser, at splejsning mønstre af de testede gener ikke var signifikant påvirket af fire amilorid derivater, herunder 5- (N-ethyl-N-isopropyl) -amiloride eller EIPA; 5- (N-methyl-N-isobutyl) amilorid eller MIBA; 5- (N, N-dimethyl) amilorid eller DMA; og 5- (N, N-hexamethylen) amilorid eller HMA, ved ækvivalente koncentrationer af pHi modulation.

Fordi amilorid er en prototype intracellulær pH ​​(pHi) modulator lægemiddel undersøgte vi fire amilorid derivater på tilsvarende eller større pHi-påvirkende doser. Vi observerede, at disse derivater inducerede ingen lignende “normalisere” virkninger på

BCL-X

,

HIPK3

og

RON /MISTR1

AS mønstre i Huh-7 celler (figur 1B). Derimod i en tidligere undersøgelse [19] vi observeret, at 5- (N-ehyl-N-isopropyl) amilorid (EIPA), men ikke amilorid moduleret AS ved at nedsætte den patogene exon7 udelukkelse af

SMN2

transkripter af arvelig spinal muskelatrofi celler. Disse paradoksale observationer viser kompleksiteten i AS mekanismer og også foreslå, at splejsning valg af lokalitet i

BCL-X

,

HIPK3,

og

RON /MISTR1

udskrifter i amiloride- behandlede Huh-7-celler medieres gennem cellespecifik splejsning virkningsmekanisme (r) i stedet for blot intracellulær pH-ændring.

proteomiske påvisning af hovedsagelig hypo-phosphoryleret splejsning faktor SF2 /ASF i cytoplasmaet og kernen af ​​amilorid-behandlede celler

Som phosphorylering status SR proteinkomponenter i AS komplekser vides at påvirke protein-protein-interaktion for splejsning funktion, vi næste brugt 2D-gelelektroforese til analyse af differentiel ekspression af serin-phosphoryleret proteiner. Vi har fundet mere end ti proteiner med kvantitative ændringer efter amilorid behandling (figur 2). Vælge syv af disse protein spots for proteomisk identifikation ved massespektrometri (tabel 1), fandt vi en af ​​dem til at være ASF /SF2, en splejsning faktor kendt for at være involveret i AS af

RON

udskrift [20] . For at verificere denne konklusion, udførte vi western blots af ASF /SF2 og fundet markant reduceret ASF /SF2 phosphorylering i både cytoplasmaet og kernen af ​​amilorid-behandlede Huh-7-celler (figur 3A). Analyse af andre proteinbestanddele af splejsning komplekser (såsom SRp20, hnRNPA1, hnRNPA2 /B1, Sam68 og fælles SR proteiner) viste, at SRp20 og to un identificerede phosphorylerede SR proteiner også blev reduceret i cytoplasmaet og kernen efter amilorid behandling (figur 3B). Disse resultater indebærer, at amilorid modulerer AS af

BCL-X

,

HIPK3

og

RON /MISTR1

gennem hypo-phosphorylering af ASF /SF2 og nedsat udtryk for SRp20 og nogle andre SR proteiner.

2D-gelelektroforese analyse af proteiner ekstraheret fra Huh-7 celler uden (venstre) og med (højre) 0,5 mM amilorid behandling i 24 timer viste signifikante forandringer i mindst ti steder, hvoraf syv (angivet med pile) blev isoleret for nano-LC-MS /MS-spektrometri-analyse og protein identifikation, som vist i tabel 1.

Western blot-analyse af subcellulære fraktioner af Huh-7 celler med og uden 0,5 mM amilorid 24 timers behandling blev udført ved anvendelse af specifikke antistoffer mod forskellige splejsning proteinfaktorer og β-tubulin. (Panel A) amilorid behandling øgede dephosphorylerede SF2 /ASF former i både cytoplasmatiske og nukleare fraktioner. (Panel B) Den amilorid behandling faldt udtryk for SRp20 og to un-identificerede fosforylerede SR proteiner i både C (cytoplasmatisk) og N (nuklear) cellulære fraktioner.

amilorid down-regulerer phosphorylering af AKT kinase og PP1 phosphatase

Nylige undersøgelser har vist, at amilorid inhiberer phosphorylering af kinaser og phosphataser er forbundet med PI3K-AKT pathway [21], [22], [23], og at AKT kinase og PP1 fosfatase kan regulere aktiviteten af ​​SR proteiner [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Vi har derfor bestemt virkningerne af amilorid på de phosphorylerede former af Akt-kinase og relaterede fosfataser i Huh-7 celler. Nedsatte niveauer af Ser (473) p-AKT og Thr (320) p-PP1 blev observeret i cytoplasmaet og kernen, hvilket tyder inhibering af AKT-aktivitet og aktivering af PP1 phosphataseaktivitet (figur 4A). For at bestemme om inaktivering af Akt kinase per se vil spille en rolle i reguleringen af ​​alternativ splejsning, blev Huh7-celler behandlet med PI3K-AKT pathway hæmmere, herunder LY294002, wortmannin og triciribin; 1 uM triciribin men ikke LY294002 eller wortmannin faldt niveauet p-Akt. Men triciribin ved denne koncentration udøvede ingen effekt på den alternative splejsning af

BCL-X

HIPK3

udskrifter (Figur S1). Interessant, at forbehandling af cellerne med okadainsyre hæmme PP1 fosfatase aktivitet ophævet virkningerne af amilorid på

BCL-X

HIPK3

splejsning, samt effekter af amilorid på dephosphorylering af SF2 /ASF og faldende af SRp20 niveau, men okadainsyre udøvede nogen sikker effekt på ekspressionen af ​​hnRNP A1 og hnRNP A2B1 (figur 4B). Taget sammen antyder disse resultater, at PP1 spiller en vigtig rolle i modulering fosforylering af SR splejsningsfaktorer og dermed modulering af onkogene AS i Huh-7-celler efter amilorid behandling.

(Panel A). Western blots viser betydelige fald i cytoplasmatisk p-Akt, nuklear p-Akt og nuklear p-PP1 i Huh-7 celler behandlet med amilorid på 0,3 mM og derover. (Panel B) RT-PCR og western blot-analyser viser, at forbehandling med et PP1-inhibitor, okadainsyre, ophævede den amilorid virkninger på BCL-X og HIPK3 onkogen RNA-splejsning, phosphoryleringen af ​​ASF2 /ASF splejsning faktor og niveauet af SRp20 i Huh-7 celler.

genom-bred exon-detektion af ændret RNA splejsning af mange funktionelle gener i amilorid-behandlede celler

Det er muligt, at virkningerne af amilorid på phosphorylering og intracellulære lokalisering af splejsning faktorer og mRNA eksport [29] kan påvirke splejsning af andre gentranskripter foruden

BCL-X, HIPK3

RON /MISTR1

. Brug af gen-chips (Affymetrix GeneChip® Menneskelig Exon 1.0 ST Array af 518000 exons af 42974 gener) for exon array analyse (sæt parametre korrelationskoefficienten ≥0.7, splejsning indeks ≤-1.585, og log

2 forholdet ≤- 1,585), fandt vi, at amilorid påvirket splejsning mønstre af 551 gener, der involverer mindst 584 exons, som omfattede 495 kendte protein-kodende gener, der involverer 526 exons (tabel S1; MIAME tiltrædelse nummer # GSE24581). Disse 495 kendte protein-kodende gener kan klassificeres i funktionelle kategorier involverer cytoskelet remodeling, celleadhæsion, iontransport, transkriptionsfaktorer, immunrespons, og muskelkontraktion (figur 5A-C og tabel S2). For at kontrollere disse exon array-resultater, valgte vi syv (

APF-1, CRK, MBNL2, MIZF, WAC, PAPDS

survivin

) til analyse af RT-PCR og faktisk bekræftet særskilt AS mønster ændringer af disse gentranskripter i amilorid-behandlede celler (figur 5D).

Bioinformatik analyser af de 495 gentranskripter med amilorid-modificerede alternativ splejsning, der detekteres af genom-dækkende exon-array-målinger blev udført i henhold til gen ontologi kategorier af biologisk proces (A), Molecular Function (B) og cellulære komponent (C). Amilorid-ændret AS mønstre af

APAF1, CRK, MBNL2, MIZF, WAC, PAPD5

SU

R

VIVIN

specifikke protein gen udskrifter opdaget af exon- array analyse blev valideret ved RT-PCR af splejsede RNA isoformer (panel D)

ved detaljerede gen ontologi (GO) niveauer, de RNA-transkripter viser amilorid-ramte AS inkluderet: a.). 4 af 5 gener (80,0%) af “microfilament motorisk aktivitet” (GO 0.000.146) og 28/132 (21,2%) af gener af “motorisk aktivitet” (GO 0.003.774); b). 5 af 7 (71,4%) af “kation: klorid symporter aktivitet” (GO 0.015.377), 5/18 (27,8%) af “anion-kation symporter” (GO 0.015.296), 3/10 (30,0%) af “natrium kalium udveksle ATPase “(GO 0.005.391), og 2/8 (25,0%) af uorganisk anionbytter aktivitet” (GO 0.005.452); c). 2 af 3 (66,7%) nitric- oxid syntase-aktivitet (GO 0.004.517); d) 16/29 gener (62.1%) af “ekstracellulær matrix strukturel bestanddel giver trækstyrke” (GO 0.030.020), 38/346 gener (11,0%) af “cytoskeletal proteinbinding” (GO 0.030.020), 2/7 (28,6% ) af kollagen bindende (GO 0.005.518); 2/8 (25,0%) af “myosin bindende” (GO 0.017.022), og andre. Af 213 apoptose-relaterede gener, 6 (

CCAR1, EP3000, KIAA1967, PRKDC, og PRPF8

) viste ændrede alternativ splejsning af amilorid. Af 608 cancer-relaterede gener, 32 herunder

RON /MISTR1, ATM Hotel (ataksi teleangiectasis muteret) og

FANCM

(Fanconi anæmi M protein) blev påvirket af amilorid. Som

ATM

spiller en vigtig rolle i DNA-skader reparation mens

FANCM

er involveret i samlingen af ​​fancy proteinkomplekser der opretholder genom integritet og stabilitet [30], ændrede AS af disse to gentranskripter ved amilorid kan resultere i kromatin nedbrydning, som verificeret vores efterfølgende eksperimenter. Men

RON /MISTR1

, men ikke

BCL-X

HIPK3

, var blandt de 495 gener opdaget at have amilorid-ændret splejsning mønstre ved exon array analyse, formentlig på grund af de strenge kvantitative kriterier, og /eller korte splejset sekvenser af

BCL-X

.

Brug kendte konsensus nukleotidsekvenser for splejsning regulerende elementer, vi yderligere identificeret mulige splejsning forstærker og lyddæmper elementer i alternativ splejsning exon, 5′-flankerende intron og 3′-flankerende intron regioner af de 495 gener ramt af amilorid (tabel S3). Disse splejsning cis-elementer er de bindingssteder ASF /SF2, SRp55 og andre ukendte regulatoriske faktorer. Under interaktioner af SF2 /ASF og andre SR proteinfaktorer med cis-elementer i splejsningsfaktorerne komplekser, kan den funktionelle tilstand af protein-protein-bindende komplekser moduleres ved phosphorylering status af proteinerne [21], [23], [31] , [32]. Dette indebærer, at den ændrede splejsning af disse gentranskripter blev medieret gennem amilorid-induceret hypo-phosphorylering af SF2 /ASF og andre SR proteiner.

Nedsat celle mobilitet /invasion aktiviteter og udtømte cytoskeletstrukturen efter AS ændringer af de involverede gener efter amilorid eksponering

Fordi ændret

RON /MISTR1

splejsning medieret af SF2 /ASF har vist sig at resultere i øget mobilitet og invasive aktiviteter af celler [20] undersøgte vi funktionelle konsekvenser af amilorid induceret fald i exon 11 (+) fl

RON

og exon 11 (-) sf

RON

isoformer (figur 1C) og fald i exon 13 og exon 20 inklusion opdaget af exon array analyse (tabel S1). Migration af celler fra et skrabet monolag kant blev forringet med 0,4 mM amilorid (figur 6A). Fluorescerende phalloidin binding påvist ændring af F-actin cytoskeletale scaffolds fra et peri-nuklear netværksstruktur i kontrolceller, til en celle-overflade fordeling med en tilsyneladende stiv indeslutning af flere kerner i amilorid-behandlede celler, og også alvorlige nedbrydning af cytoplasmatiske indhold, herunder F-actin, efter udsættelse for 0,4 mM eller højere koncentrationer af amilorid (figur 6B). Disse observationer af nedsat celle mobilitet og unormal cytoplasmatisk organisering af F-actin er i overensstemmelse med vores exon array-fund af ændret RNA splejsning af mange vigtige interagerende protein komponenter af den ekstracellulære matrix, herunder kollagen familier for cytoskeletale netværk samt myosin familier og deres binding proteiner (tabel S1), foruden

RON /MSTIR

og tilknyttede regulatoriske molekyler.

(panel A). Celle migration blev bestemt i konfluent Huh-7-cellemonolag skrabet med en plast skraber, udsat for vækstmedium med eller uden 0,45 mM amilorid i 48 timer, skyllet 2x med PBS og senere tilføres vækstmedium uden amilorid. Serielle mikroskopiske fotografier af samme områder (markeret grøn eller rød på undersiden af ​​retter) træffes på 48 og 96 timer viser fuldstændig hæmning af celle migration fra kanten af ​​amilorid-behandlede monolag. (Panel B) Celler udsat for de angivne koncentrationer af amilorid i vækstmedium i 36 timer blev fikseret med paraformaldehyd, permealized og farvet med DAPI og FITC-phalloidin for observation ved konfokal mikroskopi. DAPI-farvede kerner er magenta-pseudocolored i sammenlagte konfokale fotografier. (Panel C) Inhiberende virkning af amilorid på cytokinese blev observeret med mitotiske Huh-7-celler rystes fra skålen, genudpladet i vækstmedium indeholdende forskellige koncentrationer af amilorid. Skillelinjen datterceller blev fastsat til 24, 48 og 72 timer, farves og fotograferet mikroskopisk. (Panel D) Måling af afstande mellem de to kerner af dividere eller delte datterceller viser, at amilorid hæmmer post-mitotisk cytokinese og adskillelse af datterceller. Diameteren af ​​cellekernen er indstillet som 10. gennemsnitlige og standardafvigelsen for hver prøve punkt er 15-20 datter celle par.

forstyrrelse af cellecyklusprogression og mitotiske cytokinese af amilorid

Vores exon array analyse af amilorid-behandlede Huh-7-celler (tabel S1 S2) detekterede ændringer af RNA-splejsning overvejende af proteiner involveret i cytokinese, der er forbundet med stoftransport, og funktioner actin, mikrotubuli, og cytokinesis- relaterede kinaser [33]. Desuden ændrede RNA splejsning af

CENPE

(centromer protein E 312kDa),

CEP250

(centrosomal protein 250kDa) og

CEP192

(centrosomal protein 192kDa) kan forventes at resultere i ineffektiv kromatid separation under cellecyklussen. Faktisk var proliferation af Huh-7-celler inhiberet af 0,3 mM amilorid eller højere i vækstmediet (figur 7A). Endvidere var der en ophobning af G2 /M tetraploide celler begyndende ved 24 timer, bliver markeret ved 48 timer (figur 7B). Ved lys mikroskopisk undersøgelse, der var mange bi-nukleeret og sene anafase celler, der var formentlig G2 /M tetraploid cellepopulation observeret af fluorocytometry. Under cellecyklusprogression og datter celleseparation i nærvær af varierende koncentrationer af amilorid, mitotiske celler eksponeret for amilorid på 0,3 mM eller højere udviklet sig til bi-kerneholdige former ved 24 timer, men ikke efterfølgende generere separerede datterceller (figur 6C og 6D) . Disse tre observationer indebærer, at ved at ændre RNA AS af gener, amilorid forårsager forstyrrelse af cytokinese ved at hæmme mitotiske celler i at passere gennem sent anafase processer nedskæringsredskaber, division, og adskillelse af datterceller. Endelig bekræftede vi en tidligere rapport, at Huh-7 celler udtrykker Prominin /AC133 /CD133, en immunologisk markør af de “cancer stamceller-lignende” celler [34], og endvidere, at amilorid på 0,3 mM eller mere nedreguleret CD133 udtryk huh-7-celler (figur S2-A), hvilket resulterer i suppression af antallet og størrelsen af ​​cellen koloni formationer (Figur S2-B).

(Panel A) huh-7 celler udpladet i 6-brønds skåle ved 3 × 10

5 celler per brønd natten over blev ændret til vækstmedium indeholdende forskellige koncentrationer af amilorid; celleantal blev bestemt en og tre dage senere. Celletallet efter 24 timer viser væksthæmning af amilorid på 0,4 mM og derover. Yderligere celletal fald var tydelige på 72 timer på grund af celledød og løsrivelse i medium indeholdende amilorid på 0,3 mM og derover. (Panel B) Cytofluorometrisk analyse viser amilorid inhibering af cellecyklusprogression med akkumulering af G2 /M-fase celler. (Panel C) Apoptose er tydeligt ved cytofluorometrisk påvisning af annexinV bindende i Huh-7 celler blev behandlet med 0,5 mM amilorid. (Felt D) markerede nuklear DNA-nedbrydning blev observeret i Huh-7 celler blev behandlet med 0,4 mM amilorid, men ikke med 0,2 mM amilorid, især bemærket efter 48 og 72 timer.

Celledød med svær DNA-nedbrydning efter amilorid-induceret ændret splejsning af funktionelle molekyler i apoptose og DNA reparation veje

i amilorid-behandlede celler, splejse ændringer i

BCL-X

HIPK3

RNA ( Figur 1A) ville forudsige ændrede cellulære apoptose mekanismer, og ændret AS af

ATM

FANCM

RNA (tabel S1) ville ændre DNA-reparation og cellulære mekanismer til beskyttelse af genom. Huh-7 celler kultur i nærvær af 0,3 til 0,5 mM amilorid demonstrerede ikke blot mangel på cellevækst, men også efterfølgende tab af oprindeligt belagte Huh-7-celler (figur 7A). Apoptose var tydeligt af øgede procentdele af annexinV bindende celler efter udsættelse for 0,3-0,5 mM amilorid i 24 eller 46 timer (Figur 7C). Endvidere fluorocytometric analyse af cellulært DNA viste omfattende nukleare DNA-fragmentering og nedbrydning i flere celler end dem demonstreret at undergår apoptose; efter udsættelse for 0,4 mM amilorid, kun 48,2%, 6,5% og 1,2% af Huh-7 celler havde intakte cellulær DNA-profiler efter 24, 48 og 72 timer (figur 7D). Salg

Lignende modulerende effekter af amilorid på oncognic RNA splejsning i andre menneskelige solid tumor og leukæmiske cellelinjer

for at bestemme den generelle betydning af amilorid virkninger observeret i Huh-7 celler, vi brugte yderligere 10 etableret human cancer og leukæmi-cellelinjer, herunder 2 hepatoma HepG2 og Hep3B; rabdomyosarkom TE671; 3 glioblastoma multiforme 8401, ASCG13T1xm og ASCG7T (4); 2 coloncancer invasive cellelinier HT29 og COH; og 3 leukæmier K562, HL60 og MOLT4 celler, og en normal knoglemarv-afledte mesenkymale stromale linje KP-hMSC samt et par normale blod lymfocytkulturer, til at udføre forskellige førnævnte eksperimenter. Vores resultater viste, at der generelt amilorid tendens til at påvirke den maligne fænotype-associerede AS mere end den normale AS i cellen. Første, i det væsentlige som i Huh-7-celler (figur 1), fandt vi amilorid-moduleret “normalisering” af abornal

BCL-X

HIPK3

splejsning mønstre i hepatom Hep G2, rhabdomyosarcom TE671, glioblastom 8401, leukæmier K562, HL60 og MOLT4 (f.eks supplerende data [35]). Mest markant, amilorid kan modulere transskription /splejsning af

BCR-ABL

fusion gen og re-bevidstgøre kemoterapi

Bcr-Abl

T3151 mutant celler for imatinib [35]. Tværtimod bruger amilorid op til 2 mM i vækstmediet, vi ikke registreres ændring i

BCL-X

HIPK3

splejsning mønstre i dyrkede aktiverede normale mononukleære celler fra perifert blod (supplerende data [35]) eller i udødeliggjort knoglemarv stromale KP-hMSC celler. Konsekvent, amilorid i området fra 0,02 mM-0,5 mM var cytotoksiske for cancerceller, men ikke for normale celler i kultur (figur S3 A ​​ B). Ved hjælp af en 72-timers

in vitro

kultur-assay, fandt vi, at væksten 50% inhiberende doser af amilorid var ca. 0,02 mM for TE671, 0,10 mM for K562, 0,20 mM for Huh-7, 0,3 mM for to andre HCC Hep-G2 og Hep-3B, og 0,2-0,4 mM for de tre glioblastom multiforme linjer, men (. Figur S3-B) 3 mM eller umålelige for de normale cellelinjer. Endvidere udførte vi global exon array analyse på myeloid leukæmi blaster K562 og glioblastoma 8401, med og uden amilorid behandling, til sammenligning med Huh-7 (tabel S1, S2 og S3). Cross-matching af de 200 top-nu amilorid-modulerede gener af hver af de tre cellelinier afslørede en temmelig fælles træk ved amilorid-modulerede splejsning, nemlig at 187 gener eller 93,5% af disse 200 var den samme for de tre celler; 188 (187 plus

DNAH8

) for Huh-7 og 8401; 189 (187 plus

LRP2 /RYR2

) for Huh-7 og K562; og 190 (187 plus

ABL1, ColSA2, NAALAD2

) for 8401 og A549 (figur S4-A). GO analyse af de 187 almindelige gener efter de biologiske processer (figur S4-B), molekylære funktioner (Figur S4-C) og cellekomponenter (Figur S4-D) kategorier viste procentuelle fordeling svarende til amilorid-moduleret 495 gener af huh-7-celler (figur 5), hvilket indebærer, K562 og 8401-celler som i huh-7-celler, amilorid-moduleret AS forårsager lignende virkninger på cytoskeletale struktur, cytokinese og DNA-reparation, samt på apoptose mekanisme og det opløste stof transportsystem.

diskussion

Denne undersøgelse er baseret på vores indledende konstatering af, at amilorid ændret den alternative RNA splejsning af

BCL-X, HIPK3

RON /MISTR1

udskrifter fra onkogene mønstre mod normale mønstre i menneskelig hepatocellulært carcinom Huh-7 celler. I opfølgende eksperimenter, observerede vi hypo-phosphorylering af SR splejse faktorer, især SF2 /ASF, samt i de foregående proteinkinaser og fosfataser, tyder på, at amilorid kan påvirke den funktionelle tilstand af exon inklusion /eksklusion komplekser. Global exon analyse faktisk afsløret ændringer af AS i mange gen udskrifter af mobilnetværk. Som følge heraf amilorid-behandlede Huh-7-celler viste formindsket migration /invasion cytokinetic kapaciteter, retarderede cellecyklusprogression med mitotiske defekter, øget apoptotiske tegn, svære cellulære DNA skader og ultimativ celledød. Udforskning efterfølgende har vi nu opnået resultater, amilorid behandling kan producere lignende AS graduering og devitaliserende effekter på flere andre menneskelige maligne solide kræft og leukæmiske cellelinier foruden hepatocellulært carcinom Huh-7, men tilsyneladende ikke på et par dyrkede normale celler, vi testede (fig S3 og S4).

en distinkt egenskab ved amilorid ved modulering AS-medierede maligne fænotyper

amilorid, 3,5-diamino-6-chlor-N- (diaminomethylene) pyrazincarboxamid monohydrochlorid , blev udviklet i 1960’erne [36] og har været et lægemiddel klinisk til behandling ødem og hypertension baseret på dets natrium transport og flydende homeostase effekter [37]. Derfor vi oprindeligt troede, at dens virkninger på onkogen RNA splejsning ville være medieret af ændringer i intracellulær pH ​​og ion bevægelse. Men nogen tilsvarende AS ændringer blev påvist i Huh-7 celler behandlet med fire mere potente pHi-påvirker amiloridanaloger, herunder EIPA, som vi tidligere har vist at modulere den patogene

SMN2

udskrift i celler af spinal muskelatrofi patienter . Evnen til at ændre AS af onkogene RNA’er synes at være en distinkt egenskab ved amilorid.

Som AS styres af stærkt konserverede SR familie proteiner [1], [3], [5] og spiller en vigtig