PLoS ONE: Inhibin Alpha-underenhed (Inha) Udtryk i binyrebark Kræft er knyttet til genetiske og Epigenetisk Inha Promotor Variation

Abstrakt

binyrebark carcinom (ACC) er en sjælden, men yderst ondartet svulst af ukendt oprindelse. Inhibin α-subunit (

Inha

) knockout-mus udvikler ACC’er efter Gonadectomy. Hos mennesket

Inha

ekspression varierer bredt inden ACC væv og dets cirkulerende peptid inhibin pro-aC er blevet beskrevet som en hidtil ukendt tumormarkør for ACC. Vi undersøgte, om genetiske og epigenetiske ændringer af

Inha

gen i human ACC forårsage tab eller variation af

Inha

udtryk. Med henblik herpå analyser af

inhA

sekvens, promoter methylering og mRNA-ekspression blev udført i humane adrenocorticale væv. Serum inhibin pro-aC niveauer blev også målt i ACC patienter.

Inha

genetisk analyse i 37 unikke ACC’er afsløret 10 roman, heterozygote sjældne varianter. Af de 3 kodning baser ramt, den ene variant var synonyme og to var missense varianter: S72F og S184F. Den mindre allel af rs11893842 ved -124 bp blev observeret ved en lav frekvens (24%) i ACC prøver og blev forbundet med nedsat

Inha

mRNA-niveauer: 4,7 ± 1,9 arbitrære enheder til AA, sammenlignet med 26 ± 11 for AG /GG genotyper (P = 0,034). Den methylering af fire proximal

Inha

promoter CpG’er blev afvigende øget i fem ACC (47,7 ± 3,9%), sammenlignet med normale binyrer (18,4 ± 0,6%, P = 0,0052), mens de øvrige 14 ACC’er undersøgte viste formindsket promotor-methylering (9,8 ± 1,1%, P = 0,020). CpG-methylering blev omvendt korreleret til

Inha

mRNA-niveauer i ACC (r = -0,701, p = 0,0036), men ikke forbundet med serum inhibin pro-aC-niveauer. Afslutningsvis afvigende methylering og fælles genetisk variation i

Inha

promotor forekomme i human ACC’er og er forbundet med nedsat

Inha

udtryk

Henvisning:. Hofland J, Steenbergen J , Voorsluijs JM, Verbiest MMPJ, de Krijger RR, Hofland LJ, et al. (2014) Inhibin Alpha-underenhed (

Inha)

Expression i binyrebark Kræft er knyttet til genetiske og Epigenetisk

Inha

Promotor Variation. PLoS ONE 9 (8): e104944. doi: 10,1371 /journal.pone.0104944

Redaktør: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Marts 18, 2014 Accepteret: 17 juli 2014; Udgivet: 11 August, 2014

Copyright: © 2014 Hofland et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data er til stede i manuskriptet og supplerende tabel

Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten

Konkurrerende interesser:. Prof. Wouter de Herder er en PLoS ONE Editorial board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

binyrebark carcinom (ACC) er en sjælden malignitet med en dårlig overlevelse [1], [2] . Forekomsten af ​​ACC har en kvindelig overvægt og en bimodal fordeling med en øget forekomst hos børn og voksne over 60 år [3]. Familiær ACC forekommer i forbindelse med genetiske syndromer, såsom Beckwith-Wiedemann syndrom [4] og Li-Fraumeni syndrom [5]. Mutationer i gener for disse sygdomme har også været forbundet med sporadisk ACC dannelse, især i tilfælde af

TP53

[6]. Den hyppigste ændring findes i ACC er overekspression af maternelt præget IGF-II locus [7]. Senere har mutationer i Wnt /β-catenin pathway blevet vist at forekomme under adrenokortikal tumorprogression [8]. Genetiske årsager og rolle kromosomforandringer i binyrebark tumorigenese stort set ukendt.

inhibin α-subunit (kodet af

Inha

) danner inhibin A eller B ved at koble til inhibin βA- eller pB-subunits hhv. Dets ekspression er begrænset til gonaderne, placenta og binyrebarken. Den væsentligste virkning af cirkulerende inhibiner A og B er inhibering af lokal activin-induceret follikelstimulerende hormon (FSH) sekretion i hypofysen [9]. I en murin knockout model, blev inhibin α-underenheden sig at have en tumor undertrykkende rolle for gonadal væv [10], og efter Gonadectomy, for binyrebarken [11]. Ninety-ni procent af

Inha

– /- mus udviklede adrenocorticale steroid-secernerende carcinomer efter Gonadectomy [11]. Pathways involveret i denne effekt omfatter differentiering til granulosa celle-lignende celler med udtryk af føtale eller gonadale markører såsom

Gata4

,

Lhr, FSHR

Cyp17a1

[12 ].

Inhalation

beslægtet carcinogenese i mus er også blevet tilskrevet formindsket activin signalering potentiale og afvigende ekspression og virkninger af TGF-β2 [13], [14].

Hos mennesket funktionen af adrenale inhibiner er ukendt, selv om der er beskrevet dens modstykke activin A for at være involveret i den zone regulering af binyrebark steroidgenesen [15]. Beviset for

Inha

som en tumor suppressor i humant ACC er modstridende. Adskillige mRNA og protein analyse undersøgelser har vist mangel på

Inha

ekspression i en andel af patienter med ACC samt

Inha

overekspression i en anden undergruppe [16], [17], [18] [19], [20]. For nylig rapporterede vi, at serumniveauer af det frie peptid formen af ​​α-underenheden, inhibin pro-aC blev forøget hos patienter med adrenokortikale carcinomer og at disse niveauer kan anvendes som en tumormarkør [21]; inhibin pro-aC-niveauer kan være nyttige for differentieringen mellem maligne og benigne adrenocorticale tumorer samt for opfølgning af individuelle patienter. Selvom størstedelen af ​​ACC patienter viste øget serumniveauer af inhibin pro-aC en undergruppe af patienter havde normale niveauer, eventuelt repræsenterer tumorer, der ikke udtrykker

Inha

[21].

Flere DNA ændringer vides at påvirke genekspression under tumorigenese. Bortset fra de genetiske ændringer, som forårsager afvigende eller fraværende ekspression, epigenetiske ændringer, såsom chromatin remodeling og CpG-methylering, kan påvirke gentransskription og ofte forekommer i cancer [22]. Methylering af CpG-øer i genet promotorregioner kan resultere i transkriptionel nedregulering og tab af genekspression på grund af interferens med bindingen af ​​transkriptionsfaktorer [23].

Indsigt i den regulatoriske kontrol af

inhA

udtryk kunne kaste yderligere lys over den rolle,

Inha

i human adrenal tumorigenese og variabiliteten af ​​serum frie cirkulerende inhibinniveauer, der kunne fungere som serum tumormarkør i ACC patienter. For at opklare dette undersøgte vi de regulatoriske mekanismer i

Inha

udtryk i menneskelig ACC. Sekventering af

Inha

genet blev forpligtet sig til at søge efter genetiske varianter, der kan påvirke gen funktion eller ekspressionsniveauerne. Endvidere blev kvantitativ methylering analyse af

Inha

promotor udført for at undersøge, om methylering af CpG’er bidrager til forskellene i ekspression. Disse analyser blev koblet til tumor mRNA niveauer af inhibin a-subunit og serumkoncentrationer af inhibin pro-aC.

Materialer og metoder

prøvetagning

paraffinindstøbt væv blokke blev indsamlet fra de patologiske arkiver Erasmus MC. Vævsprøver stammede fra patienter opereret mellem 1991 og 2010 i dette hospital. Diagnosen binyrebark karcinom blev lavet, hvis van Slooten indekset oversteg 8 [24]. Tumor iscenesættelse blev udført i overensstemmelse med det europæiske netværk for Studiet af adrenal tumorer (ENSAT) iscenesættelse systemet [1]. Haematoxylin og eosin-farvede objektglas blev evalueret af en patolog og afsnit med en høj procentdel af levedygtige tumorceller blev mikrodissekeres til yderligere analyse. Væv skåret før 2007 blev indsamlet fra de patologiske arkiver Erasmus MC. Informeret samtykke til sekundær anvendelse af overskud væv blev opnået fra alle patienter verbalt før kirurgi. Patient afslag på at give væv til forskning blev registreres skriftligt og disse prøver blev ikke medtaget i denne undersøgelse i overensstemmelse hermed. Fra 2007 og frem blev prøver indsamlet i et prospektivt studie af adrenale tumorer og informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle deltagere. Disse prøver indeholdt også adrenale væv fra patienter, som gennemgik adrenalektomi grund renalcellecarcinom, adrenal hyperplasi og adenom. Tumorsnit blev indsamlet fra levedygtige tumor dele og lynfrosset i flydende nitrogen eller tøris kort efter resektion. Præoperative serumniveauer af inhibin pro-aC blev målt i patientundergrupper under anvendelse af et enzymbundet immunometrisk assay (Diagnostic Systems Laboratory, Webster, TX, USA). Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med de hollandske regler om brug af resterende væv og godkendt af Medical Ethics Committee af Erasmus MC.

DNA-sekventering

DNA blev isoleret med en DNA mini kit ( Qiagen, Venlo, Holland) ifølge producentens protokol og opløst i H

2O. Dens koncentration blev målt ved anvendelse af en NanoDrop dispenser (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

inhibin α-subunit-genet, placeret på 2q35, er sammensat ud fra to exoner (figur 1). Til DNA-analyse af paraffinindlejrede væv blev primerpar udvalgt til amplifikation regioner på 200-250 bp. For frisk frosne væv regioner op til 500 bp kan med held forstærkes. Primer steder er opsummeret i tabel 1. Primerne omfattede kodende region op til -331 bp fra ATG-startstedet (indeholdende cAMP-binding, SF-1 respons og GATA elementer på -151 til -112 bps [25], [ ,,,0],26]) og mindst 153 bps af intronen ved siden af ​​exon-intron-grænserne (figur 1).

Placeret på 2q35,

inhA

er sammensat af to exoner adskilt af en 2 kb intron. Den kodende sekvens er sammensat af 1101 bps. De regioner sekventeret i denne undersøgelse er indikeret med de kontinuerlige pile. De undersøgte for methylering områder er vist med de punkterede pile; CpG dinukleotider karakteriseret succes er vist som åbne cirkler.

PCR amplifikation blev udført i en 30 pi volumen på 0,05 U /pl FastTaq polymerase (Roche Applied Science, Almere, Holland), 1 ng /pl DNA, 250 nM forward og reverse primere, 200 uM dNTP’er (Amersham Biosciences, Uppsala, Sverige) og puffer indeholdende MgCl

2 (Roche) i en GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan den IJssel, Holland) under følgende betingelser: 7 minutter ved 95 ° C, efterfulgt af 40 cykler af 1 minuts intervaller ved 95 ° C, 56-63 ° C og 72 ° C, slutter med 10 minutter ved 72 ° C. PCR-produkter blev oprenset ved High Pure PCR Product Purification Kit (Roche).

fremadgående og tilbagegående PCR primere blev anvendt i separate sekvens reaktioner med BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Tre pi oprenset PCR-produkt blev anvendt med 500 nM af primer i en reaktion af 1 minut ved 96 ° C og 25 cykler af 30 sekunder ved 96 ° C, 15 sekunder ved 50 ° C, og 4 minutter ved 60 ° C. Sekvensen Reaktionsprodukterne blev oprenset under anvendelse af Dye-Ex 96 Purification Kit (Qiagen) og Micro-Bio-Spin oprensningssøjler (Bio-Rad, Veenendaal, Holland). Sequence Detection blev udført under anvendelse af ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Sequencher software (Genes Koder Corporation, Ann Arbor, MI, USA) blev anvendt til DNA-analyse.

Methyleringsanalyse

Et pg DNA, opnået fra frosne prøver blev behandlet med bisulfit hjælp af EZ DNA-methylering kit (Zymo forskning, Irvine, CA, USA), elueret i 100 pi H

2O og opbevaret ved -80 ° C. Bisulfit behandlede DNA i promotorregionen af ​​

inhA

blev amplificeret ved PCR, mens en T7-promotor blev indført i den reverse primer. Brug EpiDESIGNER software leveret af Sequenom (San Diego, CA, USA) to primer sæt blev konstrueret, at dækket flere CpG-dinukleotider opstrøms for

Inha

starte (figur 1); primersekvenserne er beskrevet i tabel 1.

PCR blev udført i en 5 pi volumen indeholdende 0,04 U /pl Hotstar Taq polymerase (Qiagen), 200 uM dNTP’er, 200nM af begge primere, 1 pi bisulfit -behandlet DNA, Hotstar PCR buffer og H

2O. Efter 10 minutter ved 95 ° C blev 35 cykler udført på 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 53 ° C og 45 sekunder ved 72 ° C. Reaktionen sluttede med en 7 minutters annealing ved 72 ° C. Efter bekræftelse af PCR-produkt på en 2% agarose-gel, blev produktet behandlet med 0,3 U Shrimp Alkaline phosphatase i 20 minutter ved 37 ° C og 5 minutter ved 85 ° C.

Dernæst

In vitro

transkription og base-specifik spaltning blev udført i en 7 pi blanding indeholdende 20 U T7 R A, -63A G og -56G T) i 5’UTR, mens en heterozygot variant direkte efter stopkodonen (* 1G A) blev påvist i en anden ACC. Vi lokaliseret tre intron varianter, som ligger 179, 72 og 9 bp opstrøms for intron 1-exon 2 grænse. I den kodende region af

Inha

opdaget vi en synonym nukleotid ændring (75C T, Ala25Ala) og 2 missense varianter i tre særskilte ACC’er. Sidstnævnte både omfattede heterozygote C → T varianter, på bps 215 og 552, hvilket fører til serin til phenylalanin ændringer på aminosyrer 72 og 184 henholdsvis

I vores komplet serie af ACC prøver, den -124A g. SNP, rs11893842, var den mest udbredte genetiske variation med en mindre allel frekvens (MAF) på 24%, sammenlignet med 44% i en reference population (www.1000genomes.org [27]). Desuden den mindre allel af intronisk SNP IVS1-87G A (rs116399602) var til stede i 16% af ACC prøver, tilsyneladende højere end hos raske individer (2,8% MAF). Rs7588807 (IVS1-314G T) blev kun målt i delmængde af frosne DNA-prøver. Den mindre T-allel er tidligere rapporteret at forekomme i 48% i kontrolindivider; Den ACC’er viste en lavere MAF på 29%. Rs35118453 (16C T) og rs12720063 (532C T) var til stede ved lave frekvenser, der kan sammenlignes med referere [27]: 9% og 12%, hhv. Rs144941390, rs374972575 og rs148455844 inden for

Inha

gen blev hver påvist i én ACC prøve.

Methyleringsanalyse

Den første serie, hvor

Inha

promotor methylering blev undersøgt, omfattede DNA fra 3 normale binyrer og 12 ACC. For de 4 CpG-dinukleotider 558, 599, 719 og 751 bp opstrøms for

Inha

startstedet lav methylering nøgletal blev opnået i alle testede prøver: 4,4 ± 1,1%, 4,5 ± 0,8%, 1,7 ± 0,7% og 2,5 ± 0,6% (middel ± SEM), hhv. Endvidere var der ingen forskelle mellem normale adrenale væv og ACC (data ikke vist). De CpG’er i nærhed til startstedet blev methyleret til en højere grad i en delmængde af prøver; derfor vi analyseret yderligere 7 ACC med nedstrømsprimeren eneste par.

Resultater af methylering analyse af CpG’er ved -285, -241, -203 og -149 er afbildet i figur 2. Fem ACC havde aberrerende høj methylering satser for alle fire proksimale CpG’er undersøgte i

Inha

promotor. Gennemsnitlig methylering Forholdet mellem disse ACC var 47,7 ± 3,9% sammenlignet med 18,4 ± 0,6% for normale binyrer (P = 0,0052) og 9,8 ± 1,1% for den anden ACC (P 0,0001). Forskellen i methylering mellem normale binyrer og den anden ACC var også statistisk signifikant (P = 0,020). Procentdelen af ​​

Inha

promotor methylering i ACC prøverne var ikke associeret med tumor egenskaber, såsom hormonel overproduktion, van SLOOTEN indeks eller ENSAT fase (data ikke vist).

Kvantitativ methylering analyse af fire CpG dinukleotider i

Inha

promotor blev udført i 3 normale binyrer og 19 ACC. Individuelle CpG’er er angivet på x-aksen ved bp nummer placeret 5 ‘fra ATG-startstedet. 0 angiver ingen methylering af DNA henviser 1 angiver, at alle testede i vævsprøven DNA methyleres. Individuelle datapunkter er sammensat af en middelværdi for tredobbelte målinger.

Expression analyse

Inha

mRNA ekspression blev målt i normal binyre (n = 10), adrenokortikalt hyperplasi (n = 20), adenom (ADA, n = 11) og ACC (N = 25) væv. Den kohorte omfattede 10 normal binyrer, 4 adrenal hyperplasi og 14 ACC prøver, hvor

Inha

niveauer blev rapporteret før [16]. Den foreliggende analyse viste fravær af

Inha

ekspression i 3 ACC hvorimod den anden ACC demonstreret en lang række ekspression fra 0.080 til 220 arbitrære enheder (A.U.). Samlet set var der ingen signifikante forskelle mellem niveauerne for

Inha

udtryk i alle grupper undersøgt (figur 3A). Også mRNA niveauer af

Inha

i ACC’er var ikke relateret til tumor egenskaber (data ikke vist).

(A) Kvantitativ

Inha

mRNA analyse var sammenlignelig i normale binyrer (Nl, n = 10), adrenokortikalt hyperplasi (Hyp, n = 20), adenomer (ADA, n = 11) og carcinomer (ACC, n = 25). ACC prøve huser S184F variantis vises som en åben cirkel. Bar repræsenterer middelværdien. (B) Variation i rs11893842 (-124A G) var forbundet med ændringer i

Inha

genekspression. Søjler repræsenterer midler, * P 0,05. (C) Negativ sammenhæng mellem promotor methylering af

Inha

gen og

Inha

mRNA-ekspression (r = -0,701, P = 0,0036). (D) Manglende sammenhæng mellem

Inha

mRNA-ekspression og serum inhibin pro-aC Z-scores i ACC patienter (r = -0,473, p = 0,10).

Af de 3 ACC prøver med sjældne genetiske varianter i

Inha

exons, kun var tilgængelig for ekspression analyse; denne ACC huser S184F ændring viste et normalt niveau på

Inha

mRNA (15 A.U., 3A, åben cirkel). Når stratificeret for de fem almindelige SNPs, blev kun rs11893842 gen variation i forbindelse med ændringer i

Inha

mRNA: betyde udtryk i væv med AA genotypen var 4,7 ± 1,9 A.U., sammenlignet med 26 ± 11 A.U. for AG /GG genotyper (P = 0,034, figur 3B).

Kombineret mRNA og methylering analyser var tilgængelige for 15 væv. Samlet set var der en signifikant negativ sammenhæng mellem den gennemsnitlige methylering forholdet mellem de proksimale CpG øer og

Inha

mRNA-ekspression (figur 3C, r

s = -0,701, p = 0,0036).

Serum inhibin pro-aC niveauer var tilgængelige i en undergruppe af patienter. Der var ingen signifikante forhold mellem serum inhibin pro-aC Z-score på den ene side og methylering forholdet (n = 9, r

s = -0,10, P = 0,81, data ikke vist) eller mRNA ekspression (n = 13, r

s = -0,47, P = 0,10, figur 3D) på den anden. Inhibin pro-aC niveauer var kun tilgængelig for en ACC patient med sjældne

Inha

varianter: denne præmenopausale kvindelig patient med tre sjældne varianter i 5’UTR i

Inha

havde meget øget inhibin pro- aC niveauer på 3000 ng /l. (normal 780 ng /l)

diskussion

inhibin α-subunit har været impliceret i binyrebark tumorgenese, da det blev konstateret, at gonadectomized

Inha

– /- mus udviklede adrenokortikale carcinomer med næsten fuldstændig penetrans [11]. Tab af

Inha

udtryk er blevet påvist i kun en lille undergruppe af human ACC [16], [17], [18], [20], [28], [29], bønfaldt mod væsentlige tumor suppressor rolle

Inha

i human binyrebark carcinogenese. Dette er den første undersøgelse, der viser, at den store variation i

Inha

udtryk i ACC’er er delvist forårsaget af methylering og fælles genetiske variation af

Inha

promotor og skyldes ikke sjældne genetiske varianter.

i den murine knockout model,

Inha

menes at prædisponere subkapsulær adrenocortikale celler til at gennemgå en fænotypisk skifte til gonadale-lignende celler [11], [12], [14]. Dette er blevet opstillet den hypotese, at være forårsaget af øget tilgængelighed af TGF-β type III receptoren betaglycan fører til forøget TGF-β2-signalering [13]. Den samtidige stigning i cirkulerende gonadotropinniveauer kunne sikre proliferation af adrenocorticale celler gennem en cyclin D2-afhængige vej [30]. Skønt histologi af disse tumorer ligner den for binyrebark carcinom hos mennesker [11] de funktionelt mere sammenlignelig med østrogen-secernerende gonadale-lignende celler [12]. Uanset om lokal knockdown af

Inha

i humane adrenocortikale celler bidrager til adrenokortikal tumorgenese er ukendt. Da forekomsten af ​​ACC viser overvægt hos postmenopausale kvinder, der har forøget gonadotropinniveauer, kan denne mekanisme forekommer i denne undergruppe af patienter.

foregående udtryk undersøgelser har vist, at inhibin α-underenheden ikke udtrykkes i en lille delmængde af ACC prøver [16], [17], [18], [20], [28], [29]. I modsætning hertil

in vivo Salg undersøgelser har afsløret forøgede niveauer af inhibin α-underenhed i serum af patienter med ACC [21], [31], [32]. Disse fund er sandsynligvis en konsekvens af den store variation i tumor

Inha

ekspressionsniveauer, i den aktuelle undersøgelse over en 1000 gange. Årsager til tabet af eller variation i

Inha

udtryk var ukendt.

En tidligere undersøgelse har undersøgt

Inha

genetiske varianter i ACC. Longui

et al.

[19] undersøgte pædiatriske ACC patienter med kimcellelinje

TP53

mutationer og fundet 3 sjældne, heterozygote

Inha

varianter i 6 ud af 46 (13%) patienter. Af disse tre nye varianter, blev en (G227A, rs12720061) efterfølgende vist sig at være en fælles SNP og forekom ikke i vores ACC kohorte. Konsekvenserne af de to andre genetiske varianter (P43A og A257T) er ukendte; de blev ikke fundet i den aktuelle undersøgelse af sporadisk ACC’er. Interessant, ovennævnte undersøgelse konstateret tab af heterozygositet (LOH) i nærheden af ​​

Inha

gen i otte ud af ni ACC’er undersøgte [19], hvilket tyder på, at LOH kunne forårsage nedsat ekspressionsniveauerne. Desuden komparativ genomisk hybridisering analyser af menneskelig ACC’er beskrevet sporadisk kromosomal tab af

Inha

region ved 2q33-36, med en overvægt i barndommen tumorer [33], [34], [35]. På den anden side blev inhibin α-underenhed tidligere vist at være overudtrykt i pædiatrisk ACC [21].

I den aktuelle undersøgelse blev to nye heterozygot missense genetiske varianter detekteret. Serin til fenylalanin substitutioner ved aminosyrer 72 og 184 kan påvirke aktiviteten af ​​det resulterende inhibin α-underenhed, men da funktionen af ​​inhibin i den menneskelige binyre er ukendt [36], er det vanskeligt at undersøge konsekvenserne af potentielt ændret aktivitet. Tumoren huser S184F ændring udtrykte et normalt niveau af

Inha

mRNA, men funktion eller protein nedbrydning kunne stadig være påvirket af indførelsen af ​​benzyl side ring. De genetiske varianter placeret 179, 72 og 9 bp opstrøms for intron-exon grænserne kan føre til alternativ splejsning af

inhA

gen. Vigtigt er det, blev der ikke homozygote varianter opdaget, bønfaldt mod total knockout af

Inha

fører til ACC-dannelse. Desværre havde vi kun én patient med

Inha

varianter og samtidigt tilgængelige serum inhibin pro-aC-niveauer. Her blev høje serumniveauer fundet trods tre varianter i promotorregionen hæve sandsynligheden for forøget promotoraktivitet. På grund af den lave frekvens af

Inha

genetiske varianter i sporadisk og familiær ACC [19], kan disse DNA-forandringer kun være involveret i binyrebark tumorigenese i en lille delmængde af ACC patienter. Flere fælles

Inha

SNPs blev fundet i vores patienter. Mindre alleler af rs11893842 og rs758807 fandtes at forekomme i ACC patienter ved lavere frekvenser end tidligere rapporteret i raske kohorter, der kunne antyde, at de store alleler af disse SNP’er spille en rolle i adrenal onkogenese. Interessant, den mindre allel af rs11893842, beliggende i promotorområdet i umiddelbar nærhed af vigtige regulatoriske sekvenser [25], [26], var forbundet med lavere niveauer af

Inha

mRNA-ekspression. Den lavere frekvens af denne SNP i ACC prøver synes at modsige den hypotese, at

Inha

er en tumor suppressor i menneskelig ACC.

Methylering af promotorområder af tumorsuppressorgener er en fælles mekanisme er involveret i carcinogenese [23]. Nedsat

Inha

udtryk i ACC’er kan skyldes øget methylering af

Inha

promotor. Methylering af follistatin, der er involveret i activin og inhibin signalvej som activin antagonist, er tidligere blevet fundet i den humane ACC cellelinie H295R [37]. Vi viser nu, at en delmængde af humant ACC (21%) har en forøget methylering forhold mellem adskillige CpG’er i

Inha

promotor, i modsætning til de fleste ACC, der viser en formindsket methylering af

Inha

promotor sammenlignet med normal adrenal væv. Denne brede vifte af methylering formentlig tegner sig for en del af den brede

Inha

udtryk rækkevidde, som det fremgår af det omvendte forhold mellem

Inha

promotor methylering og

Inha

mRNA-ekspression. Denne epigenetisk modifikation i

Inha

promotor og rs11893842 kan også være involveret i myndighedskontrol med

Inha

udtryk i den anden

Inha

udtrykkende væv, dvs. gonader og placenta.

niveauerne af methylering af

Inha

promotor og

Inha

mRNA-ekspression var ikke forbundet med serum inhibin pro-aC-niveauer. Desuden vi tidligere fundet nogen sammenhæng mellem pro-aC niveauer og tumor stadie eller størrelse [21]. Derfor kan disse niveauer primært afhængig af (post-) translationelle modifikationer, tumor celle aktivitet, eller clearance fra kredsløbet.

Undersøgelse begrænsninger omfatter den lille stikprøvestørrelse, usikkerhed om tilstedeværelsen af ​​LOH, og om romanen varianter er kønsceller eller somatisk. I betragtning af den meget lav forekomst af

Inha

genetiske varianter i denne betydelige sæt af 37 ACC’er, er det meget usandsynligt, at

Inha

mutationer spiller en væsentlig rolle i ACC dannelse i mennesket. Selvom LOH ikke blev undersøgt direkte i disse prøver, forekomsten af ​​heterozygote varianter i ACC påberåbt sig mod fuldstændig knockout af genet. Vigtigere er det, kun homozygote

Inha

knock-out mus udviklede adrenocortikale tumorer [11] bønfaldt mod tumorigent potentiale enkelt kopi nummer sletning. Endelig parret sekventering af normalt og tumorvæv kan afsløre, om de ikke tidligere beskrevet varianter har en kønsceller eller somatisk oprindelse, men dette var ikke tilgængelig for den aktuelle undersøgelse. Disse resultater afslører en hidtil ukendt forbindelse mellem methylering og ekspression af inhibin. Knockdown af inhibin α-subunit under ACC dannelse gennem methylering kan prædisponere til enstemmigt parakrin TGF-β eller activin handling på adrenokortikal proliferation eller steroidgenesen. Gendannelse inhibin og også follistatin [37] niveauer i ACC ved demethylering agenter kan bidrage til antiproliferative og steroidogene virkninger set med DNA methylering hæmmer 5-aza-2′-deoxycytidin i adrenocortikale celler [38]. Omvendt kan methylering af inhibin-promotoren også være en fælles mekanisme af inhibin ekspression i gonadal, binyre- og placentavæv og behandling med demethyleringsmiddel midler kunne spekuleret at påvirke inhibin produktion i disse organer.

Det kan konkluderes, afvigende methylering og fælles genetisk variation inden promotorregionen af ​​

inhA

gen er associeret med

Inha

mRNA-ekspression i human ACC. Disse genetiske og epigenetiske

Inha

ændringer kan bidrage til menneskers adrenocortical tumorigenese, svarende til situationen i murine

Inha

knockout model. Sjælden

Inha

varianter synes ikke at være involveret i patofysiologien af ​​sporadisk ACC.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Study datasæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104944.s001

(XLSX)