PLoS ONE: D-vitamin-bindende protein-makrofag Aktivering Factor Direkte Hæmmer spredning, Migration, og uPAR Expression af prostatakræft Cells

Abstrakt

Baggrund

D-vitamin bindende protein-makrofag aktiverende faktor ( DBP-MAF) er en potent hæmmer af tumorvækst. Dens aktivitet, dog er blevet tilskrevet indirekte mekanismer såsom styrke immunresponset ved at aktivere makrofager og hæmme væksten nødvendige blodkar for væksten af ​​tumorer.

Metoder og Resultater

I denne undersøgelse viser vi for første gang, at DBP-MAF udviser en direkte og potent virkning på prostata tumorceller i fravær af makrofager. DBP-MAF demonstreret hæmmende aktivitet i spredning studier af både LNCaP og PC3 prostata cancer cellelinjer samt metastatiske kloner af disse celler. Flowcytometri studier med annexin V og propidiumiodid viste, at denne inhiberende aktivitet ikke skyldes apoptose eller celledød. DBP-MAF også havde evnen til at hæmme migration af prostata kræftceller

in vitro

. Endelig blev DBP-MAF vist sig at forårsage en reduktion i urokinaseplasminogenaktivatorreceptorfunktion (uPAR) ekspression i prostata tumorceller. Der er tegn på, at aktivering af denne receptor korrelerer med tumormetastaser.

Konklusioner

Disse undersøgelser viser stærk hæmmende aktivitet af DBP-MAF på prostata tumorceller uafhængig af dens makrofag aktivering.

Henvisning: Gregory KJ, Zhao B, Bielenberg DR, Dridi S, Wu J, Jiang W, et al. (2010) D-vitamin protein-makrofag Aktivering Factor Direkte Hæmmer spredning, Migration, og uPAR Expression af prostatacancerceller. PLoS ONE 5 (10): e13428. doi: 10,1371 /journal.pone.0013428

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, USA

Modtaget: Januar 21, 2010; Accepteret: 10. september 2010; Udgivet: 18 oktober 2010

Copyright: © 2010 Gregory et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Department of Defense (DOD) tilskud PC030286 og forskning for at forebygge blindhed Challenge Grant. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

D-vitamin-bindende protein (DBP) er den vigtigste transportør af vitamin D i blodet. Det har en molekylvægt på mellem 52-59 kDa og findes i blodstrømmen i et niveau mellem 300-600 pg /ml [1], [2]. DBP er modermolekylet af DBP-MAF [3]. DBP-MAF er produktet af selektiv deglycosylering af DBP og har vist sig at være en potent antiangiogenisk og antitumorigenic molekyle [4] – [6]. Vi har vist tidligere i en xenotransplantat musemodel at DBP-MAF er en potent hæmmer af humane pancreatiske tumorer, og at dets evne til at inhibere tumorvækst

in vivo

skyldes til dels, at dens antiangiogeniske egenskaber [4] . I denne undersøgelse blev det vist, at DBP-MAF er antiangiogenisk baseret på reduktion af skibe i kyllingechorioallantoinmembranen, og baseret på reduceret mikrokar tæthed i tumorer. Det er blevet foreslået i andre undersøgelser, at dens primære antitumor mekanismer er immunologisk, på grund af sin aktivering af makrofager. Nylige kliniske undersøgelser fra Yamamoto

et al

har vist potent antitumoraktivitet, samt aktivitet mod HIV [7] – [10]. Denne aktivitet blev målt som en funktion af reducerede serumniveauer af enzymet α-N-acetylgalactosaminidase (nagalase). Nagalase deglycosylering af DBP forhindrer den i at aktivere makrofager og undertrykker derfor immunresponset [11]. Den grundlæggende mekanisme foreslås i alle tilfælde er i vid udstrækning aktivering af makrofager og de efterfølgende immunreaktioner. I HIV er det blevet foreslået, at defekte antigenpræsentation er en faktor i immundefekt [12]. Tilstedeværelsen af ​​forhøjet nagalase i plasmaet hos HIV-patienter tyder på, at makrofagaktivering kan inhiberes hos disse patienter [13]. Desuden har nagalase vist sig at være en iboende del af et kappeprotein fremme fusion til at indlede infektion [11]. Koncentrationen af ​​nagalase hos patienter med systemisk lupus erythematosus plasma blev også fundet at være forhøjet. I lupus, autoantistoffer danne patogene immunkomplekser og deponeres i væv. Clearance af disse komplekser af makrofager inhiberes hvis makrofagaktivering er forstyrret [14]. Kræftceller har vist sig at producere nagalase [15], og forhøjede koncentrationer i serum er blevet registreret i en række kræftpatienter, der lider af melanom [16], prostata, kolorektal, og metastatisk brystkræft [7] – [9]. En grundig forståelse af DBP-MAF aktivitet er endnu ikke nået, men dens potentiale som en antiangiogen og immunogen terapi er klar

Fire prostatakræft-cellelinier blev anvendt i denne undersøgelse for at medtage.; androgen følsomme (LNCaP) og ufølsomme (PC3M) linjer, samt yderst metastatiske linier (LNCaPLN3 og PC3MLN4) afledt af hver parental linie, hhv.

evne DBP-MAF at have en direkte effekt på tumorceller er ikke blevet rapporteret. Dette studie undersøgte rolle DBP-MAF i direkte hæmning af aktiviteter såsom spredning, migration, og ekspressionen af ​​uPAR der er relateret til tumorvækst og metastase.

Materialer og metoder

Syntese af DBP-MAF

(a) Fremstilling af (1-3) β-D-galactosidase-agaroseperler.

Fremstilling af perler blev udført ved anvendelse af en modifikation af metoden ifølge Yamamoto

et al

[17]. Cyanogenbromid-aktiverede perler (0,5 g) blev vasket med 1 mM HCI (3X, 10 ml per vask) ved anvendelse af sugefiltrering. Perlerne blev derefter vasket med DDI vand og resuspenderet i 2 ml koblingsbuffer (0,1 M NaHCO

3, 0,5 M NaCl, pH 8,3). (1-3) β-D-galactosidase (1000 enheder) blev tilsat til perlerne /koblingspuffer og derefter rystet med en over og under blander i 2 timer ved stuetemperatur. Perlerne blev derefter vasket med koblingsbuffer og resuspenderet i blokeringsbuffer (koblingsbuffer plus 0,2 M glycin). Suspensionen blev rystet natten over ved 4 ° C. Perlerne blev derefter vasket med koblingsbuffer efterfulgt af 0,1 M natriumacetat, 0,5 M NaCl, pH 4,0, og vaskene blev gentaget i alt fire gange. Perlerne blev vasket med en endelig vask af koblingsbuffer derefter spundet ned og resuspenderet i 1,0 M NaCl.

(b) Bestemmelse af (1-3) β-D-galactosidase-agaroseperle aktivitet.

Bestemmelse af perle-aktivitet blev udført ved anvendelse af en modifikation af metoden ifølge Yamamoto

et al

[17]. For at bestemme aktiviteten af ​​de (1-3) β-D-galactosidase-agaroseperler blev 50 pi af perlen suspension tilsat til 0,95 ml assaybuffer /kromogent substrat (PBS, 3 mM 2-nitrophenyl-β- D-galactopyranosid blev 10 mM MgCl

2, 0,1 mM β-mercaptoethanol), og suspensionen omrystes ved stuetemperatur i 15 minutter. Reaktionen blev standset med 33 pi af 1 M natriumcarbonat, og absorbansen blev målt ved 405 nm. Aktivitet blev udtrykt som enheder /ml perlesuspension, hvor 1 enhed defineres som antallet af pmol p-nitrophenol dannet per minut. En molær absorptionsevne på 18380 l /mol cm, og en vejlængde på 0,25 cm svarende til et volumen 200 pi i en plade med 96 brønde blev anvendt til at beregne koncentrationen af ​​p-nitrophenol.

(c) Deglycosylering af DBP med (1-3) β-D-galactosidase-agaroseperler.

Deglycosylering af DBP blev udført ved anvendelse af en modifikation af metoden ifølge Yamamoto

et al

[17]. DBP (Calbiochem, San Diego, CA) blev tilsat til en slutkoncentration på 0,05 mg /ml i PBS pH 6,0, 10 mM MgCl

2, med 0,007 U (1-3) β-D-galactosidase-agarose og 0,004 U af neuraminidase-agarose (Sigma, St. Louis), og rystet ved stuetemperatur i 4 timer. Det samlede reaktionsvolumen var 1 ml. Perlerne blev derefter sedimenteret ved centrifugering og fjernes. DBP-MAF blev opbevaret i portioner ved -20 ° C.

DBP-MAF peptid

En 14 aminosyre DBP-MAF peptid blev syntetiseret (Ana Spec, Fremont, CA) med amino -sekvens: Ac-TPTELAKLVNKRSE. Renhed var . 90%

Cell kultur

PC3M, PC3MLN4, LNCaP, og LNCaPLN3 celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Curtis Pettaway og Dr. Esajas J. Fidler (MD Anderson Cancer Center ). Den PC3M cellelinie blev isoleret fra levermetastaser produceret i nøgne mus efterfølgende til milten injektion af androgen-ufølsom PC3 humane prostatacarcinom-cellelinie [18]. De metastatiske underlinjer, PC3MLN og LNCaPLN, blev skabt ved at injicere de parentale celler orthotopisk i den dorsale lap af prostata af nøgne mus og dyrkning af cellerne, som havde metastaseret til sentinel (paraaortic) lymfeknude. Efter dyrkning i 3-5 passager blev disse celler re-injiceres i prostata af efterfølgende nøgne mus. Denne proces blev gentaget i 3 cyklusser for at skabe den metastatiske linie, LNCaPLN3 og i fire cyklusser for at skabe den metastatiske linie, PC3MLN4 [18]. Alle tumorceller blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U /ml) /streptomycin (100 ug /ml) og L-glutamin og inkuberet ved 37 ° C, 10% CO

2.

acid fosfatase kolorimetrisk assay

Ved afslutningen af ​​hvert forsøg blev cellerne vasket i PBS og derefter 450 pi syrephosphatase buffer (10 mM p-nitrophenol fosfat, 0,1 M natriumacetat, 0,1% Triton X-100, pH 5,8) blev tilsat til hver brønd. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 45 minutter. Halvtreds pi af 1 N NaOH blev tilsat til hver brønd for at standse reaktionen, og absorbansen blev målt ved 405 nm [19], [20]. Celle antal af hver celletype blev kalibreret med absorbans ved anvendelse af et hæmacytometer at sikre, at sur phosphatase-niveauer korrelerede lineært med celleantal. Analyser og plotte for alle assays blev udført under anvendelse af Origin Pro 8 (Northampton, MA).

cellemigrering assays

Migration assays blev udført under anvendelse af en modificeret Boyden kammer Millicell kultur indsatser (Millipore, Billerica, MA) med 8 um porer [20] – [22]. Øvre membraner blev præ-inkuberet natten over med fibronectin (10 pg /ml i PBS), som blev aspireret fra brøndene den følgende morgen. Celler (150.000 celler /brønd) blev udpladet i basalt medium with.010% gelatine med eller uden DBP-MAF eller DBP. Nogle prøvebrønde blev farvet ved afslutningen af ​​inkubationsperioden at sikre, at celleadhæsion på de øverste membraner var ensartet under alle forhold. Basalt medium blev tilsat til bundbrønde med eller uden 10% FBS. Celler blev inkuberet i seks timer ved 37 ° C, 10% CO

2. Celler, som ikke migrerer blev fjernet fra toppen af ​​membranen og de migrerede celler blev kvantificeret under anvendelse af en sur phosphatase kolorimetrisk assay.

Proliferationsassay

Tumorceller blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen) med 10% FBS, penicillin /streptomycin og L-glutamin og inkuberet ved 37 ° C, 10% CO

2. Celler blev trypsinbehandlet og tilsat til plader med 24 brønde (5000 celler /brønd) i 0,5 ml dyrkningsmedium. Celler blev serum-udsultet natten over, derefter blev mediet erstattet med RPMI 1640, 1% FBS, penicillin /streptomycin og L-glutamin og inkuberet i 72 timer med eller uden DBP-MAF eller DBP [23]. Celleproliferation blev vurderet ved anvendelse af en sur phosphatase kolorimetrisk assay [4], [23].

Flowcytometri

Celler blev dyrket til -80% konfluens i 100 mm

2 retter. Celler blev behandlet med eller uden DBP-MAF (1 ug /ml) og inkuberet ved 37 ° C i 48 timer. Celler blev trypsinbehandlet, centrifugeret, alikvoteret i rør og mærket med annexin V og propidiumiodid under anvendelse af en apoptose afsløring kit (APOAF, Sigma, St. Louis, MO). Annexin V og PI-farvning blev udført ved at følge producentens anbefalinger. Flowcytometri-analyse blev udført under anvendelse af en Cytomation MoFlo cellesorterer overensstemmelse med producentens anbefalinger.

revers transkription og real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (RTQPCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra humane celler under anvendelse af Trizol reagens (Invitrogen) ifølge producentens anbefalinger og blev behandlet med RNase-fri DNase (Ambion). RNA integritet og kvalitet blev vurderet via 1% agarose gelelektroforese og koncentrationerne blev bestemt spektrofotometrisk (NanoDrop 1000 spektrofotometer V3.7, ThermoFisher Scientific). Totalt RNA (1 ug) blev revers transkriberet som beskrevet tidligere [24] ved brug qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences). RT produkter (cDNA) blev forstærket af real-time kvantitativ PCR (Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-Time PCR-system) med Power SYBR grøn Master Mix. Oligonukleotidprimere specifikke for menneskers uPAR variant 1 (Genebank tiltrædelse n ° NM-002.659, frem 5’CAACGAGGGCCCAATCCT -3 “og omvendt 5′-GTAACACTGGCGGCCATTCT -3), uPAR variant 2 (Genebank tiltrædelse n ° NM-001.005.376, frem 5 ‘- CAACGAGGGCCCAATCCT -3 «og omvendt 5’CACTGGCGGCCATTCTG -3), uPAR variant 3 (Genebank tiltrædelse n ° NM-001.005.377, frem 5’GCCGTTACCTCGAATGCATT -3« og omvendt 5’GGCCCCTCTCACAGCTCAT -3), og 18S rRNA (fremadrettet 5’-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3 ‘og revers 5′-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3’) blev anvendt. QPCR cyklingsbetingelser var 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cykler af en totrins-amplifikation program (95 ° C i 15 s og 58 ° C i 1 min). Ved afslutningen af ​​amplifikationen blev smeltekurveanalyse påføres efter dissociation protokollen fra Sequence Detection system til at udelukke kontaminering med uspecifikke PCR-produkter. PCR-produkterne blev også bekræftet ved agarose-gel og viste kun én bestemt bånd med den forudsagte størrelse. For negative kontroller blev der ikke RT produkter, der anvendes som skabeloner i qPCR og ingen bånd blev detekteret på gelen.

Relative udtryk for målgener blev bestemt ved 2

-ΔΔCt metode [25]. De ubehandlede celler blev valgt som kalibratorerne.

immunblotting

Immunoblotting blev udført under anvendelse af en modifikation af metoden ifølge Besch

et al

[26]. Celler blev dyrket i 100 mm

2 skåle og dyrket til -80% konfluens derefter serum-udsultet natten over. Medium blev erstattet med RPMI (1% FBS). DBP eller DBP-MAF blev tilsat ved angivne koncentrationer. Celler blev inkuberet i 24 eller 72 timer ved 37 ° C, derefter lyseret under anvendelse HTG puffer (20 mM HEPES, pH 7.4,10% glycerol, 1% Triton X-100) og høstet med en celleskraber. Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) blev tilsat (100 uM). Lysater blev separeret under anvendelse af SDS-PAGE. Banerne blev normaliseret ved hjælp lige protein belastning (40 pg /bane). Proteinniveauer blev bestemt ved anvendelse af et BCA-assay (Pierce, Rockford, IL). Bånd blev overført til en PVDF-membran. Membranen blev blokeret natten over i 10% pulveriseret fedtfri mælk og 0,10% Tween 20 i PBS. Membranen blev hybridiseret med et anti uPAR-antistof (Santa Cruz, CA), efterfulgt af hybridisering med en peberrodsperoxidase-bundet sekundært antistof og fremkaldes med kemiluminescens. Vinculin blev brugt som en belastning kontrol.

Statistisk analyse

Effekten af ​​DBP-MAF blev testet separat for celle migration og proliferationsassays. En ensidig t-test blev anvendt til måling af den statistiske signifikans af reduktioner af tumorvækst på forskellige niveauer. En to-sidet Z-test blev anvendt til at måle effekten af ​​DBP-MAF i apoptose eller nekrose. Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS Statistisk softwareversion 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina) og en

P

-værdi ≤0.01 blev brugt til at identificere statistisk signifikans.

Resultater

DBP-MAF hæmmer migration af tumorceller

invasion og migration af tumorceller er vigtige skridt i tumorvækst og metastase. DBP-MAF blev testet for dens virkning på celle migration i fire tumor linjer-to forældrenes prostatakræft linjer (LNCaP og PC3M) og to metastatiske kloner af disse linjer (LNCaPLN3 og PC3MLN4), ved hjælp af en modificeret Boyden kammer. Det basale niveau af vandring mellem hver parental linie og dens respektive metastatisk klon forblev uændret. Ved alle testede doser, blev observeret inhibering af migration (figur 1).

LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) eller PC3MLN4 (D) celler blev tilsat (150.000 /brønd) til øverste kammer i et modificeret Boyden kammer (+/- DBP-MAF) med 10% FBS i nederste kammer. Efter 6 timer blev cellerne fjernet, ikke havde migreret og de resterende celler blev kvantificeret under anvendelse af en sur phosphatase assay. Resultater blev normaliseret til kontrol. Eksperimenter blev udført mindst tre gange, og fejl er vist som +/- SD. I forhold til cellevækst uden DBP-MAF, tilføjer DBP-MAF havde en statistisk signifikant samlet reduktion af celle migration på 30% (P = 0,0003) for de kombinerede fire tumor celletyper. Individuelle betydelige satser reduktion blev fundet med hver af disse tumor celletyper. Sammenlignet med kontrol blev signifikant reduktion set med DBP-MAF ved (A) 20% P = 0,0022 (B) 20% P = 0,0029 (C) 10% P = 0,0045 (D) 30% P = 0,0094. n = 3.

En DBP-MAF peptid hæmmer tumorcellemigration

Udarbejdelsen af ​​DBP-MAF involverer flere trin enzymatiske processer. Den selektive deglycosylering er et nødvendigt skridt i processen, fordi ekspressionen af ​​DBP-MAF i E. coli producerede et protein med nogen aktivitet [4]. En aktiv men lettere formuleret version af molekylet ville gøre fremstillingen af ​​DBP-MAF nemmere og billigere. Af disse grunde en DBP-MAF peptid blev syntetiseret under anvendelse af en sekvens fra det oprindelige molekyle, der havde udvist aktivitet i andre studier [27]. Peptidet blev testet for at bestemme dets potentiale til at hæmme tumor celle migration. Som vist i figur 2, peptidet udviste signifikant evne til at inhibere migrationen af ​​alle tumorlinjer. Den hæmmende effekt steg ikke ved højere doser, tyder på IC

50 blev lavere end dosisintervallet testet.

LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) eller PC3MLN4 (D) celler blev tilsat (150.000 /brønd) til den øverste kammer i et modificeret Boyden kammer (+/- DBP-MAF) med 10% FBS i nederste kammer. Efter 6 timer blev cellerne fjernet, ikke havde migreret og de resterende celler blev kvantificeret under anvendelse af en sur phosphatase assay. Resultater blev normaliseret til kontrol. Eksperimenter blev udført mindst tre gange, og fejl er vist som +/- SD. I forhold til migration uden DBP-MAF, tilføjer DBP-MAF havde en statistisk signifikant reduktion af migration på 40% (P 0,0001) for kombinationen af ​​alle fire tumor celletyper. Individuelle betydelige satser reduktion blev fundet med hver af disse tumor celletyper. Sammenlignet med kontrol blev signifikant reduktion set med DBP-MAF ved (A) 30% P = 0,0038 (B) 40% P = 0,0016 (C) 20% P = 0,0038 (D) 40% P = 0,0005. n = 3.

DBP-MAF hæmmer tumorcelleproliferation

De fire cellelinjer blev derefter testet for at bestemme deres følsomhed over for DBP-MAF i sprednings- studier. Som vist i figur 3A, DBP-MAF ved 1 mg /ml reduceret spredning til baseline niveau eller derunder i alle cellelinjer med undtagelse af PC3M. Det var interessant, at selv om PC3M cellerne ikke var følsomme for DBP-MAF i dette assay, den metastatiske klon PC3MLN4 havde udviklet følsomhed over for det.

LNCaP (A), LNCaPLN3 (B), PC3M (C) eller PC3MLN4 (D) celler blev podet i 24-brønds skåle natten over, derefter medium +/- DBP-MAF blev tilsat med 1% FBS. Efter 72 timer blev celler kvantificeret under anvendelse af en sur phosphatase assay. Resultater blev normaliseret til kontrol. Eksperimenter blev udført mindst tre gange, og fejl er vist som +/- SD. Sammenlignet med kontrol blev signifikant reduktion set med DBP-MAF ved (A) 50% P = 0,0001 (B) 50% P = 0,0001 (C) ingen signifikant reduktion (D) 40% P = 0,0073. n = 3.

På 1 pg /mL, DBP-MAF havde en statistisk signifikant reduktion af cellevækst ved 40% (P = 0,0073) for kombinationen af ​​alle tumor celletyper. Individuelle betydelige satser reduktion (uden DBP-MAF vs.1 mikrogram /ml) blev også fundet blandt disse tumor celletyper undtagen PC3M hvor nogen signifikant reduktion blev fundet (figur 3).

Spredning undersøgelser ved hjælp af DBP- MAF peptid viste ingen reduktion i proliferation med nogen af ​​cellelinierne (data ikke vist). Dette antyder, at evnen til at inhibere migrering og proliferation kan opholde sig i særskilte områder af proteinet, og at denne peptidsekvens kan have nogen rolle i inhibering af proliferation. Det er også muligt, at stedet er ansvarlig for fuld DBP-MAF aktivitet er mere kompleks og kræver den selektivt deglycosyleret sekvens af proteinet til stede.

For at afgøre, om inhibering af tumorcelleproliferation skyldtes celledød eller apoptose, blev flowcytometrianalyse udført under anvendelse propidiumiodid og annexin V markører. Disse undersøgelser viste ingen tegn på hverken betydelig celledød eller toksicitet som følge af DBP-MAF behandlede celler (tabel 1), og med undtagelse af PC3M forældrenes linje, viste en reduktion.

RT-PCR viser reduktion af uPAR-ekspression i celler behandlet med DBP-MAF

ekspressionen af ​​urokinaseplasminogenaktivatorreceptorfunktion (uPAR) er blevet vist at korrelere med forøget metastase i tumorceller [28] – [30] og med lægemiddelresistens [31] (for gennemgang se [32]). RT-PCR blev udført på alle celletyper under anvendelse af tre kendte isoformer af uPAR forstadier, herunder opløselige receptor, isoform 2 (se fremgangsmåder). Som vist i figur 4D, blev reduceret RNA-ekspression observeret for LNCaPLN3 i nærværelse af DBP-MAF ved både 0,001 og 1 ug /ml DBP-MAF for både uPAR1 og uPAR2 isoformer. De isoformer uPAR2 og uPAR3 viste lignende reduktion af udtryk med DBP-MAF behandling af PC3M celler. Interessant, selvom PC3MLN4 celler viste ingen signifikant respons på DBP-MAF (figur 5D), var der en statistisk signifikant reduktion af uPAR2 med DBP ved 1 ug /ml. I næsten undersøgt alle forhold, efter 72 timer uPAR niveauer var vendt tilbage til kontrolværdier (data ikke vist). Peptidet blev også testet under anvendelse af cellelinje (LNCaPLN3), som var aktiv i alle assays og (PC3M), som var aktiv i migration, men ikke i proliferation. De viste ingen signifikant ændring i nogen af ​​uPAR isoform niveauer med peptidet (figur 6A og 6B). De tumorlinjer blev derefter testet for at observere effekten af ​​DBP-MAF på uPAR-ekspression på proteinniveauet. Celler blev høstet efter 24 timer og lysater blev immunblottet. Som vist i figur 4, har DBP-MAF ikke inhiberer ekspressionen af ​​uPAR i nogen cellelinjer efter 24 timer (figur 7A), men en reduktion blev set efter 72 timer kun i LNCaPLN3 celler (figur 7B). DBP behandlede celler viste ingen signifikant ændring i receptorekspression.

LNCaP og LNCaPLN3, celler blev behandlet med DBP eller DBP-MAF (0,001 og 1 ug /ml) og inkuberet i 24 timer og derefter høstet. RT produkter (cDNA), er identificeret som uPAR1, 2, og 3, blev forstærket af real-time kvantitativ PCR.

PC3M og PC3MLN4 celler blev behandlet med DBP eller DBP-MAF (0,001 og 1 ug /ml) og inkuberet i 24 timer og derefter høstet. RT produkter (cDNA), er identificeret som uPAR1, 2, og 3, blev forstærket af real-time kvantitativ PCR. p. 0,05

LNCaPLN3 (A) og PC3M celler (B) blev behandlet med DBP eller DBP-MAF (0,001 og 1 ug /ml) og inkuberet i 24 timer og derefter høstet. RT produkter (cDNA), er identificeret som uPAR1, 2, og 3, blev forstærket af real-time kvantitativ PCR. p. 0,05

LNCaP, LNCaPLN3, PC3M, og PC3MLN4 blev behandlet med DBP eller DBP-MAF og inkuberet i 24 timer (A) derefter høstet og immunblottet anvendelse af et anti-uPAR-antistof. LnCaPLN3 celler ved 72 timer (B). p. 0,05

Diskussion

D-vitamin bindende protein DBP-MAF, har vist sig at hæmme både tumor og blodkar vækst. Vi viser her, for første gang, en direkte virkning på prostata kræftceller i fravær af makrofager, øge omfanget af DBP-MAF ud over sine allerede demonstreret antiangiogeniske og immuno-modulerende egenskaber. DBP-MAF demonstrerede potent hæmning af både proliferation og migration af tumorceller.

Det er interessant at bemærke svaret fra de parentale PC3M celler sammenlignet med metastatisk klon. PC3M celler viste ikke følsomhed over for DBP-MAF i proliferationsassays, men deres migration blev hæmmet af DBP-MAF. Der var en reduktion af uPAR-ekspression som detekteret ved RT-PCR, men protein ekspression af uPAR isotyper testet optrådte uændret. Endelig DBP-MAF forårsagede en lille stigning i tab på grund af apoptose eller nekrose (tabel 1), mens de øvrige cellelinjer demonstrerede nedsat apoptose eller nekrose. Den metastatiske klon PC3MLN4 udviste en potent respons på behandling i både proliferation og migration selv ved lav dosis (1 ng /ml), men viste ingen reduktion i uPAR-ekspression enten på mRNA eller protein-niveau. Yderligere spredning undersøgelser blev udført for at bestemme, om uoverensstemmelsen i respons mellem de parentale og metastatisk klon skyldtes en generel ændring i celle følsomhed. Calcitriol viste potent og konsistent inhibering blandt alle celletyper inden identiske dosisområder. PC3M og PC3MLN4 celler blev også testet med etoposid og deres svar var ens (data ikke vist), hvilket antyder, at den metastatiske klon opnået følsomhed for DBP-MAF at den parentale linje ikke påvise. Virkningen af ​​DBP-MAF på PC3MLN4 celler forårsaget de højeste betydelige satser for proliferation og migration reduktion i forhold til de andre cellelinjer. Undersøgelser viste alle tumorcellelinier at være følsomme over for DBP-MAF i migration assays.

Vores observationer i dyrkning af disse celler var, at de metastatiske kloner af både PC3M og LNCaP var mere følsomme over for trypsinisering end forældrenes linjer. Mange faktorer kan regulere migrationen af ​​celler og selvom uPAR er en mulig mediator, kan det ikke være den eneste mekanisme, ved hvilken DBP-MAF inhiberer migration. Peptidet var effektivt migrationstudier men viste ingen evne til at påvirke proliferation eller uPAR-ekspression. Da peptidet udgør kun en del af proteinet er det ikke besidder alle de domæner af native DBP-MAF, såsom vitamin D bindende region. Det er muligt, at evnen til at regulere migrering og proliferation bor i separate domæner i proteinet. Selv om alle cellelinierne reagerede på DBP-MAF i en eller flere af de assays, der kun LNCaPLN3 påvist reduktion af proteinniveauet uPAR. Det er imidlertid muligt, at antistoffet ikke genkender alle isoformer af uPAR.

Det er nu almindeligt accepteret, at tumormikromiljøet, og ikke blot tumorcellen alene udgør et effektivt mål for terapi. Foruden undersøgelsen af ​​antitumorvirkninger er fremgangsmåden ved levering af disse lægemidler blive undersøgt. Biotilgængelighed er et afgørende element i enhver terapeutisk strategi. Dårlig absorption, internalisering, kort halveringstid i kredsløbet og en række andre mangler kan gøre en terapi, der har vist sig meget lovende

in vitro

, ineffektive i klinikken. Den effektive

in vivo

doser for DBP-MAF (pg-ng) har haft en tendens til at være lavere end den

in vitro

doser (ng-ug rækkevidde) [4], [6] – [10]. Måske er det på grund af flere mekanismer af sin virksomhed. Potentialet til at påvirke blod vækst fartøj og tumorcellevækst samt stimulere en potent immunrespons gennem makrofag aktivering er vanskeligt at måle

i toto

bruge

in vitro

tilgange. De har dog en måde at karakterisere disse effekter individuelt.

Effekten af ​​DBP-MAF behandling på uPAR udtryk i prostata tumorceller tidligere var ukendt. uPAR-ekspression er blevet korreleret med tumormetastase i et antal tumorer [26], [28] – [30], [32]. Undersøgelser af esophageal tumorer viste PAI-1 og uPA blev udtrykt gennem tumorer, men ikke i normalt esophageal væv, og at uPAR blev udtrykt ved tumor grænser [33], [34]. Et link mellem bugspytkirtelkræft og uPA er blevet påvist, hvilket kunne forklare den potente effekt af DBP-MAF i vores tidligere pancreas tumor undersøgelser [33].

Forholdet mellem plasmin-relaterede proteiner PAI-1, uPA og uPAR er kompleks [35]. Selvom PAI-1 inhiberer ekspressionen af ​​uPA, som ville blive anset for at inhibere tumorudvikling, PAI-1 fremmer også tumorvækst og angiogenese på eget [36], [37]. I den forstand ville en behandling, som ville dæmpe uPAR-ekspression uden at fremme tumorvækst være værdifulde. Da metastaser er den primære dødsårsag hos kræftpatienter, kan uPAR følsomhed over for DBP-MAF repræsenterer en attraktiv vej til yderligere undersøgelse.

Tak

Forfatterne vil gerne takke Jayakrishna Ambati og Royce Mohan for deres nyttige diskussioner.