PLoS ONE: undergrave ER-Stress mod apoptose ved Nelfinavir og Curcumin samtidig dosering øger Docetaxel Effekt i kastrationsresistent prostatacancerceller

Abstrakt

På trods af dens bivirkninger, docetaxel (DTX) er fortsat en første-linie behandling mod kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Derfor strategier til at øge sin anti-tumor effekt og mindske dens bivirkninger er kritisk behov. Målretning af den konstitutive endoplasmatiske reticulum (ER) stress i kræftceller bliver undersøgt som en chemosensitization tilgang. Vi antager, at den samtidige induktion af ER-stress og undertrykkelse af PI3K /AKT overlevelse vej vil være en mere effektiv metode. I en CRPC cellelinie, C4-2B observerede vi signifikant (p 0,005) forøgelse af DTX-induceret cytotoksicitet efter samtidig dosering til thapsigargin og en AKT-inhibitor. da disse to stoffer ikke er klinisk godkendt, vi undersøgte Men om en kombination af nelfinavir (NFR) og curcumin (CUR), er kendt for at målrette begge disse metaboliske veje, kan ligeledes øge DTX cytotoksicitet i CRPC celler. Inden for 24 timer efter eksponering for fysiologiske koncentrationer af NFR (5 uM) og CUR (5 uM) en signifikant (p 0,005) forøget cytotoksicitet var tydelig med lav koncentration af DTX (10 nM). Dette 3-lægemiddelkombination hurtigt forøget apoptose i aggressive C4-2B celler, men ikke i RWPE-1-celler eller i den primære prostata epitelceller (Prec). Komparative molekylære undersøgelser viste, at dette 3-lægemiddelkombination forårsagede en mere udtalt undertrykkelse af phosphoryleret-AKT og højere induktion i phosphoryleret-eIF2α i C4-2B celler, sammenlignet med RWPE-1-celler. Akut eksponering (3-9 timer) til denne 3-drug kombination intensiveret ER-stress inducerede pro-apoptotiske markører, dvs. ATF4, CHOP, og TRIB3. Ved meget lavere koncentrationer, kroniske (3 wks) engagementer med disse tre agenter drastisk reduceret kolonidannende enheder (CFU) ved C4-2B celler.

In vivo

undersøgelser ved hjælp af mus indeholder C4-2B tumorxenoplantater viste signifikant (p 0,05) enhancement af DTX s (10 mg /kg) anti-tumor effekt efter samtidig dosering til NFR (20 mg /kg) CUR (100 mg /kg). Immunhistokemisk (IHC) analyser af tumorsektioner angivne faldt Ki-67-farvning og forøget TUNEL intensitet i mus udsat for kombinationen 3-drug. Derfor undergrave ER-stress mod apoptose ved hjælp adjuverende behandling med NFR og CUR kan chemosensitize de CRPC celler til DTX terapi

Henvisning:. Mathur A, Abd Elmageed ZY, Liu X, Kostochka ML, Zhang H, Abdel- Mageed AB, et al. (2014) undergrave ER-Stress mod apoptose ved Nelfinavir og Curcumin samtidig dosering øger Docetaxel Effekt i kastrationsresistent prostatacancerceller. PLoS ONE 9 (8): e103109. doi: 10,1371 /journal.pone.0103109

Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA

Modtaget: Januar 27, 2014 Accepteret: 12 jun 2014; Udgivet: 14 August, 2014

Copyright: © 2014 Mathur et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra det amerikanske forsvarsministerium, at DM (# PC080811) og til A.B.A. (# PC081598), og midler fra Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt mænd i USA. Indledende behandling af lokaliserede tumorer består af kirurgi og strålebehandling, efterfulgt af androgen deprivation terapi (ADT). Men ADT er kun effektiv i gennemsnitligt 18-24 måneder, og en gentagelse af kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) dikterer morbiditet og mortalitet hos patienter [1]. Selvom de nyere og mere potente androgen receptor (AR) antagonister, fx MDV-3100 (enzalutamide), har vist en vis løfte, modstand er allerede stødt på i klinikken [2]. Derfor kemoterapi med taxaner stadig det stof valg for patienter med aggressive og metastatiske CRPCs. Men en sikker og effektiv strategi til at øge effektiviteten af ​​taxaner repræsenterer en udækket behandlingsbehov.

Docetaxel (DTX), en anti-mikrotubuli middel, blev godkendt af FDA i USA som grundpillen behandling mod CRPC [3 ]. Selvom oprindeligt effektiv, har DTX-baserede regime kun vist en median overlevelse på 18-20 måneder, og respons på kun 50%. Derudover DTX udviser betydelige negative virkninger hos patienter med komorbide tilstande, som reduktion mandat dosis, som øger muligheden for selektion for resistente kloner. Nylige undersøgelser har vist, at modstanden udvikling efter langtidsbehandling med DTX kan forekomme på grund af opregulering af PI3K /AKT signalering i CRPC celler [4], [5]. Derfor bør nedregulering af PI3K /AKT-signalering i CRPC celler forøge effektiviteten af ​​denne kemoterapeutisk middel [6].

Aggressive cancerceller er også i stand til at undslippe kemoterapi ved at modulere mester regulatoriske veje, som dikterer deres overlevelse eller død beslutning gør evner. I denne henseende har vist bekæmpelse af proteintranslation via udsøgt regulerede ER-stress kaskade til fremme tumorcelleoverlevelse og flygte fra apoptose [7]. En direkte forbindelse mellem aggressiv tumor fænotype og forøget ekspression af ER-stress markering, BiP /Grp78, er blevet dokumenteret [8] – [10]. Faktisk har flere nylige rapporter fastslået, at ER-stress kan lette vedvarende tumorvækst og deres terapeutiske modstand. Derfor har forskere foreslået, at målretningen af ​​ER-stress kan være en potent kemosensibiliserende strategi [11] – [13]. Wu et al, (2009) viste, at ER-stress inducer methylseleninic acid (MSA) sensibiliserer PC-3-celler over for de cytotoksiske virkninger af paclitaxel og DTX [11]. Naturlige forbindelser som epigallocatechingallat, en polyphenolisk forbindelse i grøn te, kan forbedre kemoterapi virkningsfuldhed i glioblastomceller ved at øge ER-stress [14]. Imidlertid er effekten af ​​samtidig nedregulering af PI3K /AKT overlevelse vej og opregulering af ER-stress induceret apoptose som en potent chemosensitization fremgangsmåde ikke blevet testet.

Undersøgelser giver klare beviser på tværs af samtaler mellem flere signaltransduktionsveje, der regulerer beslutninger celle skæbne efter ER-stress induktion i cancerceller [7], [15] (se fig. 1A for en detaljeret beskrivelse). En mild grad af ER-stress aktiverer en overlevelse reaktion kaldet den udfoldede Protein Response (UPR). Men alvorlig ER-stress undergraver denne UPR mod en pro-apoptotiske vej, der er dikteret af ekspression af ER-stress induceret transkriptionsfaktorer ATF4 og CHOP, og ER-stress induceret død sensor TRIB3. Interessant, under mild ER-stress, lavt TRIB3 niveauer virke som en negativ regulator af ATF4 og CHOP som begunstiger celleoverlevelse. Men i alvorlige ER-stress, høje niveauer af ATF4 og CHOP forøge TRIB3 udtryk og en parallel undertrykkelse af AKT, der favoriserer apoptose [16] – [18]. Derfor TRIB3 synes at fungere som en mester ‘molekylær switch “for overlevelse

vs.

Død signalering i cancerceller undergår ER-stress (fig. 1B). Således farmakologiske midler, der inducerer høje TRIB3 niveauer bør sensibilisere cancerceller for kemoterapi.

(A). Under normale homeostatiske betingelser, er den ATF6, IRE1 og kvikke proteiner bundet til BiP /Grp78 på ER-membran. En udfoldet protein respons (UPR) frigiver disse ER-stress transducere fra BiP. Frigivet ATF6 translokerer til kernen at forøge XBP-1-genekspression. Parallel aktivering af IRE1 muliggør splejsning af XBP-1 mRNA, som koder for en transkriptionsfaktor, som stimulerer flere inducerbare gener. Udgivet PERK aktiverer eIF2α, som så hæmmer oversættelse af cap-afhængige proteiner for yderligere at beskytte celler fra UPR progression. Således cross-samtaler mellem disse ER-stress transducere virker via parallelle veje til at lette celle overlevelse og genoprette cellulære homeostase efter en mild og forbigående ER-stress. Men under langvarig eller svær ER-stress, hætten-uafhængige oversættelse af ATF4 fortsætter,. Nuclear ATF4 niveauer deregulere cellulære homeostase ved at øge ekspressionen af ​​ER-stress død sensorer, CHOP og TRIB3. (B). TRIB3 fungerer som “molekylær switch”, der dikterer celle overlevelse eller celle død beslutninger efter ER-stress. Lave niveauer af TRIB3 funktioner via en negativ feedback-loop til at undertrykke ATF4 og CHOP ekspression, således at celleoverlevelse (venstre panel). Men høje niveauer af TRIB3 nedregulerer AKT overlevelse vej, men ikke undertrykke ATF4 og CHOP som fortsætter med at producere ukontrollerede niveauer af TRIB3. Denne ubalance undergraver UPR og ER-stressreaktioner fra en overlevelse mode mod apoptose (højre panel).

thapsigargin (Tg), en velkendt ER-stress inducer, kan sensibilisere PC-3 celler til både paclitaxel og DTX [11]. Desuden kan den AKT-inhibitor (AKTI-IV) sensibilisere både HeLa og SKOV3 cellelinjer til cisplatin og etoposid [19]. Men disse eksperimentelle forbindelser kan ikke anvendes til patienter, eftersom de manifesterer betydelige

in vivo Salg toksiciteter [11], [19]. Desuden klinisk godkendelse af nye stoffer, som sikkerhedsmål AKT og ER-stress ville være en dyr og tidskrævende proces. I denne henseende er lægemidlet repositionering blive en meget givende anti-cancer og kemosensibiliserende strategi [20]. Vi undersøgte, om to godkendte farmakologiske midler, dvs. nelfinavir og curcumin, kendt for at målrette ER-stress og AKT pathways, kan øge DTX anti-tumor effektivitet over for CRPC celler.

Nelfinavir (NFR) er en af ​​den første HIV-1 proteasehæmmere (HPI) at være klinisk godkendt [21], [22] og er ved at blive repositioneret som et anti-cancer middel, samt (ClinicalTrials.gov). Talrige undersøgelser har vist, at NFR kan både chemosensitize og radiosensitize en række forskellige tumorceller [23] – [28]. Dens sensibiliserende virkninger er blevet forbundet med induktion af ER-stress og inhibering af AKT pathway [28]. Faktisk, ritonavir, anden HPI med samme virkningsmekanisme, viste sig også at øge anticancer effekter af DTX i en særdeles aggressiv PCa cellelinie, DU-145 [29]. Dog er den allergifremkaldende effekt ved NFR kun udstillet ved koncentrationer på ≥10 uM, hvilket er højere end dens sikre og fysiologisk opnåelige niveauer, dvs. 4,5-6 uM [30], [31]. Derfor kan kombinationen af ​​NFR med en anden sikker forbindelse, der ligeledes er rettet mod ER-stress og AKT pathways være mere effektive.

Curcumin (CUR) er den aktive bestanddel af

Curcuma longa

, en øst -Indiske plante. Denne fytokemiske har kendt anti-inflammatoriske og anti-cancer egenskaber og en række laboratorier undersøger sin nytte som et supplement til kemoterapi [32]. Faktisk CUR har vist inhiberer PI3K /AKT pathway og inducerer lave niveauer af ER-stress specifikt i cancerceller [33], [34]. I lungecancerceller, CUR udviste synergistiske antitumorvirkninger, når de kombineres med DTX [35]. For nylig, CUR blev også vist at udløse celledød i colon cancerceller via ER-stress induceret autofagi [36]. Imidlertid ligner NFR,

in vitro

kemosensibiliserende virkninger af CUR var kun tydelig ved høje koncentrationer (≥10 uM), hvilket er vanskeligt at opnå

in vivo

[37], [38 ]. Derfor vi hypotese, at CUR og NFR kombination kraftigt bør øge deres individuelle kemosensibiliserende evner.

Undersøgelser ved hjælp C4-2B celler (en CRPC cellelinje) viste signifikant forøget anti-tumor effekt af DTX efter samtidig dosering til NFR og CUR . Mekanistisk Dette 3-drug kombination synergieffekt at undertrykke AKT og fremkalde ATF4, CHOP og TRIB3 niveauer. Begge vores

in vitro

in vivo

resultater klart implicerer potentialet i adjuverende behandling med fysiologisk opnåelige koncentrationer af NFR og CUR at forøge effekten af ​​DTX i CRPC patienter.

Materialer og metoder

Cell kultur

C4-2B celler, en knogle metastatisk CRPC sublinie stammer fra LNCaP, var en slags gave fra Dr. Leland Chung laboratorium (Emory University) [39] . Disse celler blev dyrket i RPMI-1640 medie (Cellgro, Manassas, VA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) fra Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA) og 1% penicillin /streptomycin antibiotisk opløsning (Cellgro). Den RWPE-1-celler, en ikke-tumorigen human prostata epitelcellelinie immortaliseret med human papillomavirus (HPV-18), blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; # CRL-11609). Disse celler blev dyrket i keratinocyt serumfrit medie (K-SFM) suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF) og ekstrakt fra bovin hypofyse, alle opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Primære humane prostata epitelceller (Prec) blev opnået fra ATCC (# PCS-440-010) og blev dyrket i prostata epitelcelle basalt medium og supplementer (ATCC; # PCS-440-030 og # PCS-440-040). Knoglemarven mesenchymale stamceller (BM-MSC’er) blev opnået fra stamcellen core facilitet på Tulane University (New Orleans, LA) og blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 20% FBS og antibiotika. Alle celler blev holdt ved 37 ° C, i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2.

Reagenser

nelfinavirmesylat (NFR) pulver blev ekstraheret og oprenset fra 250 mg tabletter ( Agouron lægemidler, San Diego, Californien). Curcumin (CUR) blev opnået fra Acros Organics (Fair Lawn, NJ). Docetaxel (DTX) og thapsigargin (Tg) blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO) og AKT-inhibitor (AKTI-IV; katalog nr 124.005.) Blev opnået fra Calbiochem (Billerica, MA). For

in vitro

undersøgelser blev alle stoffer opløst i dimethylsulfoxid (DMSO). Primære antistoffer mod total-AKT og phospho-AKT, total eIF2α og phospho-eIF2α, og mod human BiP /Grp78, PARP og CHOP, blev alle købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Antistoffer mod human TRIB3 og ATF4 var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), antistof mod humant β-actin fra Fisher Scientific (Waltham, MA) og mod Ki-67 var fra Spring Biosciences (Pleasanton, CA). Alle sekundære antistoffer, såsom gede-anti-muse, gede-anti-kanin og bovint anti-ged, blev alle indkøbt fra Santa-Cruz Biotechnology.

Cellelevedygtighed assay

MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid] assay blev anvendt til bestemmelse af cellelevedygtighed efter udsættelse for testforbindelserne [40]. Kort fortalt blev celler udpladet i plader med 96 brønde og lodes adhærere natten over. Ønskede koncentrationer af forbindelser, alene eller i forskellige kombinationer, blev tilsat til cellerne i 3 replikatbrønde. Efter 24-72 timers inkubation blev MTT (Sigma) tilsat til hver brønd og inkuberet i 3 timer og formazankrystaller blev påvist ved lilla farve. Procent overlevelse blev beregnet ved at måle absorbansen ved 540 nm under anvendelse af en μQuant pladelæser fra Bio-Tek (Seattle, WA).

DNA fragmentation assay

DNA fragmentation assay blev udført ifølge tidligere offentliggjorte undersøgelser [41]. Kort fortalt blev celler i 10 cm vævs-petriskåle behandlet med de ønskede koncentrationer af DTX, NFR og CUR, alene og i kombination. Celler blev høstet efter 24 timer i en celle lysis buffer {0,2% Triton-X 100, 10 mM Tris-CI (pH 7,4) og 10 mM EDTA (pH 8,0)}, efterfulgt af behandling med 100 ug /ml RNAse A (Sigma ) og 0,5 mg /ml proteinase-K (Sigma). Den lavmolekylære DNA blev ekstraheret ved tilsætning af lige store volumener af phenol, chloroform og isoamyl-alkohol (25:24:1) og yderligere ved chloroform og isoamylalkohol (24:1). Ekstraherede DNA blev ethanolfældet (300 mM NaCl og 100% iskold ethanol), genopløst i 1X TE (Tris /EDTA) buffer og elektroforesebehandlet i en 2% agarosegel indeholdende ethidiumbromid (0,1 ug /ml). DNA-fragmentering blev visualiseret under UV-lys ved hjælp af Mængde One-software (Bio-Rad, Hercules, CA).

Caspase-3 assay

EnzChek Caspase-3 assay Kit (Molecular Probes; Eugene, OR) detekterer apoptose ved at måle proteolytisk spaltning af en amino-methylcoumarin (AMC) afledt fluorescerende substrat, Z-DEVD-AMC. Kort beskrevet blev celler i 10 cm petriskåle behandlet med DTX, NFR og CUR, alene og i kombination. Celler blev høstet efter 24 timer, lyseret, og caspase-3-assayet blev udført ifølge producentens protokoller. Mean fluorescensintensiteter blev målt ved hjælp af en Flx800 mikropladelæser (BioTek) med excitation og emissionsbølgelængder fastsat til 360 ± 20 nm og 460 ± 20 nm.

vestlige immunpåvisning

Hele cellelysater blev høstet på forskellige tidspunkter (30 minutter til 9 timer) efter udsættelse for DTX, NFR og CUR behandlinger ved hjælp 1X cellelyse-buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Proteiner blev kvantificeret under anvendelse af BCA protein assayreagens (Thermo Scientific, Rockford, IL). Ca. 30 ug protein blev fraktioneret på 10% SDS-PAGE geler fra Bio-Rad (Hercules, CA) og overført til en PVDF-membran. Ikke-specifik binding blev blokeret ved at inkubere membraner med en blok-CH kemiluminescerende blokker (Millipore) og hybridiseret med de ønskede primære antistoffer (1:1,000 fortynding) natten over ved + 4 ° C og derefter med HRP-mærkede sekundære antistoffer (1:5,000 fortynding) i 1 time ved stuetemperatur. Bånd blev påvist under anvendelse af forøget kemiluminescens (ECL) og SuperSignal West Pico substrat (Thermo Scientific). Band intensiteter blev kvantificeret ved hjælp af Image-J software (NIH) og densitometrisk værdi for hvert protein blev normaliseret til de tilsvarende p-actin niveauer i hver prøve.

Colony Forming Units assay

C4 2B celler blev podet i 6 cm skåle med 200 celler /skål. Narkotika, alene eller i kombination, blev tilsat efter 48 timer og behandlinger blev udført i 3 replikatbrønde. Både NFR og CUR blev genopfyldes to gange om ugen og DTX var genopfyldes gang om ugen sammen med frisk vækstmedium. Efter tre uger blev kolonierne fikseret med 100% ethanol og farvet med methylenblåt, og kolonidannende enheder (CFU) blev optalt ved hjælp af mængden One software (Bio-Rad). Salg

Tumor xenografundersøgelser

Alle forsøgsprotokoller med laboratoriedyr blev udført i overensstemmelse med NIH retningslinjer og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Tulane University (IACUC; protokol # 4295).

in vivo

antitumorvirkningen af ​​DTX, alene eller i kombination med NFR og CUR, blev bestemt i tumorxenotransplantater i athymiske nøgne mus (NCI, Frederick, MD). For hver mus (4 uger gamle), C4-2B celler (2 x 10

6) blev resuspenderet i 100 pi serumfrit medium og blev injiceret subkutant (sc) sammen med 100 pi Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). Når tumorerne nåede et volumen på 50-75 mm

3 (ca. 2 uger efter injektion) blev dyrene randomiseret til behandling med enten vehikel, DTX (10 mg /kg), eller med DTX (10 mg /kg) + NFR (20 mg /kg) + CUR (100 mg /kg) ved intraperitoneal (ip) injektion. Før hver injektion blev narkotika frisk opløst i deres respektive køretøjer [23], [43], [44]. DTX blev administreret en gang om ugen, og NFR og CUR blev administreret 5 dage /uge. Tumorstørrelser blev målt to gange om ugen ved hjælp af en skydelære og tumorvolumener blev beregnet ved anvendelse af formlen, 0,5 x længde x bredde

2 [45]. Vægt af hver mus blev målt og forhold mellem tumor-volumen til total-vægt blev beregnet for hvert tidspunkt. Tumorer blev udskåret ved afslutningen af ​​behandlingsperioden (4 wks), paraffin-indlejret og snittet til immunhistokemisk (IHC) farvning.

Immunhistokemi

tumorer blev fikseret i 10% neutral bufret formalin i 24 timer efterfulgt af 70% ethanol og blev derefter indlejret i paraffin. Sektioner (-5 um) blev skåret og farvet med hematoxylin og eosin (H # H-3401). Permanent montering medium blev tilsat, og Ki-67-farvning blev visualiseret og fanget ved hjælp af en Eclipse E-400 mikroskop (Nikon Instruments, Melville, NY). I hvert dias, blev 5 forskellige områder visualiseret for Ki-67 farvede celler og kvantificeret ved hjælp af Image-J software

TUNEL assay

Dette deadend Kolorimetrisk TUNEL (Promega,. Madison, WI) blev anvendt til bestemmelse apoptotiske celler i tumorsnit, ifølge fabrikantens protokoller. Denne assay måler biotinyleret nukleotid inkorporering i DNA, som derefter visualiseret ved HRP-mærket streptavidin og DAB. Farvning blev visualiseret ved Eclipse E-400 mikroskop og billeder blev optaget med 4 forskellige felter i hver tumor sektion.

Synergy bestemmelse

CalcuSyn software (Biosoft, Cambridge, UK) blev anvendt til at beregne kombinationen (Cl) baseret på Chou-Talalay-metoden [46]. Denne metode er baseret på medianen-effekt ligning, som omfatter Michaelis-Menton, Hill og Henderson-Hasselbalch ligninger og giver en kvantitativ måling for additiv (CI = 1), synergistisk (CI 1) eller antagonistiske (CI 1) effekter.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med GraphPad Prism-version-4.00 Software (San Diego, CA, USA). Resultater er udtrykt som standardafvigelse midler (± SEM). Væsentlige ændringer fra kontroller blev bestemt ved en to-tailed t-test og p-værdier for 0,05 blev anset for signifikant

Resultater

Kombineret eksponering for thapsigargin og AKT-inhibitor sensibiliserer C4. 2b celler til DTX-induceret cytotoksicitet

for at løse vores centrale hypotese, at samtidig målretning af ER-stress og AKT veje vil resultere i chemosensitization af CRPC celler, vi først undersøgt, om Tg og AKTI-IV samtidig dosering kan bevidstgøre C4 2b celler til DTX-induceret cytotoksicitet (fig. 2A). Virkningerne af stigende lægemiddelkoncentrationer og tidspunktet for engagementer blev først overvåget ved MTT-assays. Ved 72 timer efter behandling, IC

50 værdier for DTX, Tg og akti-IV var 35,8 nM, 80,8 nM og 5,5 pM (tabel S1 i File S1). Mulige synergistiske virkninger af lægemiddelkombinationen blev derefter undersøgt ved anvendelse af koncentrationer lavere end deres respektive IC

50 værdier. Samtidig dosering undersøgelser viste klart, at kombinationen af ​​DTX (10 nM), Tg (25 nM) og AKTI-IV (2,5 uM) resulterede i en signifikant (p 0,0005) fald i C4-2B celleoverlevelse i sammenligning med DTX alene ( fig. 2B). Fremtidige undersøgelser blev udført for at undersøge, om samtidig dosering til to sikre og godkendte agenter, dvs. NFR og CUR, kan tilsvarende øge DTX sensibilisering af C4-2B celler.

(A). Samtidig induktion af ER-stress ved thapsigargin (Tg) og undertrykkelse af AKT ved en Akt-inhibitor (Akt-I) kan gøre cancerceller modtagelige for de cytotoksiske virkninger af kemoterapi. (B). Cytotoksiske virkninger af DTX, alene eller i kombination med Tg og /eller Akt-I, på C4-2B cellelevedygtighed. Samtidig dosering til Tg (25 nM) og Akt-I (2,5 uM) øget DTX (10 nM) induceret cytotoksicitet efter 72 timer efter eksponering (n = 3). Fejl søjler repræsenterer ± SEM værdier, og signifikante forskelle er vist som P-værdier (***, s 0,0005).

samtidig dosering til fysiologisk opnåelige koncentrationer af NFR CUR sensibiliserer C4-2B celler til DTX-induceret cytotoksicitet

IC

50 værdier for DTX, NFR eller CUR blev beregnet efter udsættelse for individuelle lægemidler for 24, 48 og 72 timer (tabel S1 i File S1 ). En koncentration og tidsafhængig suppression i celleoverlevelse (MTT-assay) blev observeret. I efterfølgende undersøgelser blev sub-IC

50 koncentrationer af lægemidler, der anvendes i 2- eller 3 lægemiddelkombinationer og celleoverlevelse blev overvåget i forskellige celletyper, (A) C4-2B, (B) RWPE-1, ( C) BM-MSC og (D) Prec (fig. 3). Selv ved 24 hrs IC

50 for DTX, NFR og CUR alene viste sig at være 590,5 nM, 30,3 uM og 59 uM, en signifikant stigning (p 0,0005) i C4-2B cytotoksicitet blev observeret, når DTX var anvendes i kombination med NFR og CUR. Interessant, den hurtige cytotoksicitet observeret i C4-2B celler var ikke tydelig i de ikke-tumorigene RWPE-1-celler eller i de primære celler, dvs. BM-MSC’er og PrECs. Kombinationen index (CI) analyse viste en værdi på 0,045 i C4-2B celler, hvilket tyder på en stærk synergistisk virkning af kombinationen 3-drug. Imidlertid blev Cl-værdier for RWPE-1-celler og BM-MSC fundet at være meget højere, dvs. henholdsvis 0,527 og 0,639,. Endvidere CI værdi i Prec celler var 2,074, hvilket antyder en antagonistisk virkning. Lignende studier i en anden aggressiv PCa cellelinje, PC-3, også indikeret signifikant (p 0,0005) stigning i DTX sensibilisering efter samtidig dosering til både NFR og CUR (tabel S1 i File S1 og fig S1A i File S1.). Interessant dog i modsætning til i C4-2B celler, drug synergisme i PC-3-celler blev kun observeret ved 72 timer efter behandling. Samlet set viser disse resultater tydeligt, at samtidig dosering til NFR og CUR hurtigt og synergistisk kan øge DTX-induceret cytotoksicitet i CRPC linje C4-2B, men ikke i den ikke-tumorigen linje, RWPE-1. Derfor blev molekylære mekanistiske undersøgelser gennemføres med afgrænse de differentielle virkninger af denne 3-lægemiddelkombination i begge cellelinier.

cytotoksiske virkninger af DTX (10 nM), alene og i kombination med NFR (5 uM) og /eller CUR (5 uM), er vist i de følgende fire celletyper, (A) C4-2B, (B) RWPE-1, (C) Prec og (D) BM-MSC’er. Celle levedygtighed assays blev udført ved 24 timer efter eksponering og procentvis ændring i celle overlevelse, sammenlignet med de ubehandlede celler (kontrol), blev bestemt. MTT-assays blev udført i 3 replikatbrønde og alle forsøg blev gentaget mindst tre uafhængige gange (n = 3). Fejl søjler repræsenterer ± SEM og betydelige forskelle mellem DTX-only og DTX + NFR + CUR gruppe er vist som P-værdier (***, s 0,0005, **, p 0,005)

Differential effekter af NFR CUR kombination på DTX-induceret apoptose i C4-2B og RWPE-1 celler

Vi overvåges, om forskellen cytotoksicitet i C4-2B

vs.

RWPE1 celler efter behandling med kombinationen 3-drug skyldes forskelle apoptose (fig. 4). Cellulær apoptose blev vurderet ved flere teknikker såsom DNA-fragmentering (Fig 4A . 4B), caspase-3 induceret AMC produktion (Fig 4C . 4D) og PARP-spaltning (. Fig 4E 4F). DNA fragmentation assay viste, at de individuelle lægemidler ikke inducerede apoptose; imidlertid en stigning i laddering mønster var indlysende, når DTX blev kombineret med enten NFR eller CUR og apoptose blev yderligere forstærket med kombinationen 3-drug. Skønt tilsvarende DNA fragmenteringsmønstre var tydelige i RWPE-1-celler, AMC assayet klart vist en signifikant højere Caspase-3-aktivitet i C4-2B celler sammenlignet med RWPE-1-celler. Hverken NFR eller CUR alene fandtes at stige AMC produktion; men deres samlede eksponering øget Caspase-3 aktivitet, og det var tydeligt, selv i fravær af DTX samtidig behandling. Endvidere selvom NFR eller CUR alene kunne øge Caspase-3-aktivitet i DTX eksponerede celler, iagttoges de mest betydelige stigninger, når både NFR og CUR blev anvendt i kombination med DTX (sammenlign bane 5 og 8). Data fra PARP spaltningsprodukter analyser yderligere bekræftet denne differentieret effekt af kombinationen stof på apoptotisk celledød. I C4-2B celler blev en 9-dobling observeret inden for 9-timer efter eksponering; dog blev kun en stigning 2,3 gange ses i RWPE-1-celler. Derfor, eksponering for NFR og CUR dybt øger DTX-induceret apoptose af de C4-2B celler.

Induktion af apoptose i C4-2B (A, C, D) og RWPE-1 (B, E, F) celler efter behandling med DTX (10 nM), alene og i kombination med NFR (5 uM) og /eller CUR (5 uM) blev evalueret ved DNA-fragmentering (A og B), Caspase-3-assay (C og E ) og PARP spaltning (D og F). De DNA-fragmentering og caspase-3 assays afbilder apoptose efter 24 timer efter eksponering. Ændringer i PARP-spaltning blev målt til 9 timer efter eksponering. Den laddering mønster af fragmenteret DNA var tegn på apoptose, der blev yderligere bekræftet ved forøget AMC frigivet af aktiverede caspase-3 (n = 3) (*, p 0,05). Ekspression af både total og kløvet PARP blev bestemt ved Western blot-analyser. Pilene angiver spaltet PARP niveauer. Fold ændringer i PARP-spaltning i drug eksponerede celler (bane 2-8) sammenlignet med ubehandlede celler (bane-1) er vist efter normalisering med respektive p-actin niveauer.

kombinerede behandling med DTX, NFR CUR ophæver PI3K /AKT signalering i C4-2B celler

For at optrævle de underliggende mekanismer involveret i chemosensitization ved 3-drug kombination, blev vestlige immunodetektions undersøgelser udført for at overvåge både AKT aktivering og ekspression af flere ER- stress markører (fig. 5 og fig. S2 i File S1). Indledende undersøgelser blev udført for at overvåge den tid og dosisafhængige virkninger af DTX, alene eller i kombination med NFR og /eller CUR, i C4-2B celler (Fig. S2 i File S1). At bestemme deres tidsmæssige virkninger på AKT signalvejen, blev C4-2B cellerne først udsættes for narkotika fra 30 min til 6 timer og derefter stimuleret med insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF1; 10 ng /ml) i 15 min. Både total AKT (t-AKT) -niveauer og AKT phosphoryleret i serin-473 (p-AKT) blev bestemt. Sammenlignet med ikke-stimulerede celler, blev p-AKT steget med 3-4 gange efter IGF1 stimulering (ikke vist). I C4-2B celler, kunne p-AKT undertrykkelse ses inden for 30 minutter af eksponering, og var klart inden inden for 3 timer. Interessant, selvom DTX alene var i stand til at øge p-AKT niveauer inden for 30 min, denne stigning i AKT overlevelse vej blev ikke set i celler coexposed til NFR CUR. IGF-1-induceret p-AKT niveauer blev næsten afskaffet ved 6 timer eksponering post-lægemiddel (fig. S2a i File S1). Hverken koncentrationen eller eksponeringstiden stoffet var i stand til at ændre den samlede AKT (t-AKT) niveauer i enten celletype. (2).