PLoS ONE: histon-deacetylasehæmmerne Lette dihydroartemisinin-induceret apoptose i leverkræft In vitro og in vivo

Abstrakt

Leverkræft rangerer i prævalens og dødelighed blandt top fem kræftformer i hele verden. Akkumulerende interesser er blevet fokuseret i at udvikle nye strategier for leverkræft behandling. Vi har tidligere vist, at dihydroartemisinin (DHA) udviste antitumoraktivitet i retning leverkræft. I denne undersøgelse, vi viste, at histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) væsentligt forøgede den antineoplastiske effekt af DHA via øget apoptose

in vitro

in vivo

. Inhibering af ERK-phosphorylering bidrog til DHA-induceret apoptose, på grund af det faktum, at inhibitor af ERK-phosphorylering (PD98059) steg DHA-induceret apoptose. Sammenlignet med DHA alene, den kombinerede behandling med DHA og HDACi reducerede mitokondrier membranpotentialet, udgivet cytochrom

c

i cytoplasma, øget p53 og Bak, faldt Mcl-1 og p-ERK, aktiveret caspase 3 og PARP, og inducerede apoptotiske celler. Desuden viste vi, at HDACi forbehandling lettet DHA-induceret apoptose. I Hep G2-xenograft transporterer nøgne mus, intraperitoneal injektion af DHA og SAHA resulterede i signifikant inhibering af xenotransplantattumorer. Resultater af TUNEL og H Accepteret: 28. maj 2012; Udgivet: 28 juni 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.172.345 og nr 30.973.506). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Liver cancer er den femte mest almindelige cancer verdensplan og den tredje mest almindelige dødsårsag af kræft [1]. Mere end 75% af nye tilfælde er diagnosticeret i udviklingslandene; dog forekomst stigende i økonomisk udviklede regioner, herunder Japan, Vesteuropa og USA [2], [3]. Selvom kirurgisk resektion og levertransplantation er de to store terapeutiske muligheder med helbredende potentiale, kirurgi er kun muligt for omkring 20% ​​af leveren kræfttilfælde da patienterne oftest diagnosticeret på et fremskredent stadium [4], [5]. Til dato, kemoterapi for leverkræft er ikke tilfredsstillende, og overlevelsen af ​​patienter liver cancer langsigtet er stadig dårlig [4], [6]. Derfor udvikler nye og effektive terapeutiske strategier for leverkræft er af stor behov og betydning.

histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) er i øjeblikket stor fokus på interesse som antineoplastiske midler [7], [8]. HDACi er en klasse af midler, der fungerer via blokering histondeacetylering derved modificere chromatin struktur og gentranskription [9]. Især HDACi inhiberer acetylering af lysinrester på histon N-terminale hale, som resulterer i at løsne sammenslutning af histoner med DNA, for derved at tillade ekspression af gener relateret til tumor suppression [10]. Kendskabet til sammenhængen mellem HDAC aktiviteter og forskellige kræftformer fået mange forskere til at overveje HDAC-inhibitorer som potente midler, som kan forstyrre cancercelleproliferation og /eller overlevelse gennem modulering af cellecyklusprogression, differentiering eller ved at fremme celledød. For eksempel Kim et al. rapporterede, at CG0006 eksponering i brystcancer celle resulterede i celledød via nedregulering HDAC6 [11]. Bommi et al. viste, at natriumbutyrat apoptose i cancerceller ved transkriptionel nedregulering af BMI1 [12].

Selvom HDACi alene kan være klinisk nyttige, vil de sandsynligvis være af værdi i kombination med andre antitumormidler. SAHA er blevet godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA) til behandling af kutant T-celle lymfom og andre HDACi nu gennemgår fase I /II kliniske forsøg som enkeltstof eller i kombination med andre midler [13], [14 ]. Akkumulerende rapporter er blevet angivet synergistisk effekt på dødelighed af kombination af HDACi og andre kemoterapeutiske stoffer. Kretzner et al. viste, at kombinationen af ​​HDACi og Aki forbedret lymfom celledød gennem undertrykkelse af c-myc, hTERT, og microRNA niveauer [15]. Nguyen et al. rapporterede, at samtidig administration af HDACi synergistisk øget KW-2449 dødelighed som følge af inaktivering af Bcr /Abl [16]. Sidst, en fase II undersøgelse viste, at behandling af vorinostat kombineret med tamoxifen signifikant forlænget overlevelse af patienter med brystcancer [17]. Men sådan en synergistisk effekt er sjældent blevet påvist i leverkræft,.

For nylig har vi rapporteret, at dihydroartemisinin (DHA), den vigtigste aktive metabolit af artemisinin derivater, udstillet anticancer aktivitet mod leverkræft [18]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at (a) DHA induceret apoptose via nedregulering ERK-phosphorylering, der blev yderligere bekræftet ved de data, inhibitoren af ​​ERK-phosphorylering (PD98059) steg DHA-induceret apoptose, (b) HDACi

in vitro

bemærkelsesværdigt forbedret DHA-induceret celledød, ledsager med reduktion af mitokondrier membranpotentialet, frigivelse af cytochrom

c

i cytoplasma, øget p53 og Bak, og fald i Mcl-1 og p-ERK, ( c) kombinationen af ​​HDACi og DHA

in vivo

betydeligt standset væksten af ​​leverkræft tumor xenograft. Vores data kan foreslå kombinationen af ​​HDACi og DHA som en lovende strategi for leverkræft kemoterapi.

Materialer og Metoder

Cell kultur

Menneskelig leverkræft cellelinjer (Hep G2 og PLC /PRF /5) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 mg /ml penicillin, og 100 mg /ml streptomycin i en befugtet atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft ved 37 ° C.

Antistoffer og reagenser

Antistoffer for Mcl- 1, PARP, Bak, og actin blev købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer til caspase 3, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, og p-JNK blev leveret af cellesignalering (Danvers, MA). Dihydroartemisinin (DHA, opløst i DMSO), natriumbutyrat (NaB, opløst i H

2O), suberoylanilid hydroxamsyre (SAHA, opløst i DMSO) og p-ERK inhibitor (PD98059, opløst i DMSO) blev erhvervet fra Sigma ( St. Louis, MO).

MTT

Cellelevedygtighed blev vurderet ved 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazo-Trifolium (MTT) assay. Kort fortalt, 8 × 10

3 af celler blev podet i 96-brønds plader i 24 timer, efterfulgt af inkubation med forskellige doser af DHA for angivne tid. Efter tilsætning af 100 pl /brønd af MTT-opløsning blev cellerne inkuberet i yderligere 2 timer. Supernatanter blev derefter fjernet, og formazankrystallerne blev opløst i 100 pl /brønd DMSO. Absorbansen ved 570/630 nm af hver prøve blev målt ved anvendelse multilabel pladelæser (PerkinElmer). Der blev udført tre uafhængige forsøg.

Kolonidannelse

Et hundrede af celler blev podet i 6-brønds plader og dyrket i 7 dage. Og derefter blev mediet erstattet med frisk indeholdende DHA. Efter at være blevet inkuberet i yderligere 7 dage blev koloni dannet af leverkræft celler farvet med 0,05% krystalviolet (Sigma, St. Louis, MO) i 8 min. Antallet af koloni blev derefter kvantificeret.

Western blot-

Cellelysater blev kogt med 6x natriumdodecylsulfat (SDS) ladningsbuffer og derefter fraktioneret ved SDS-PAGE. Proteinerne blev overført til PVDF-membran, som derefter blev inkuberet med et primært antistof hos 5% af fedtfri mælk, efterfulgt af en peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret anti-muse eller anti-kanin andet antistof. ECL detektionsreagens (Amersham Life Science, Piscataway, NJ) blev anvendt til at demonstrere resultaterne.

Annexin V /PI assay

Apoptose blev vurderet ved anvendelse Annexin V-PI dobbelt farvning. Efter behandlingerne blev celler trypsiniseret og farvet med 0,5 mg /ml Annexin V i bindingsbuffer (10 mM HEPES fri syre, 0,14 M NaCl og 2,5 mM CaCl

2) i 30 min. Bagefter blev PI (5 ug /ml slutkoncentration) tilsat og inkuberet i yderligere 15 minutter. Celler blev påført på et flowcytometer til dataindsamling.

TUNEL assay

Apoptose assay blev udført under anvendelse af Apo-Direct TUNEL Assay kit (Millipore). Celler blev høstet og fikseret i 4% PFA i 60 minutter ved 4 ° C, efterfulgt af en anden fiksering i 70% (v /v) ethanol natten over ved -20 ° C. Celler blev derefter behandlet med forskellige reagenser til en konstrueret periode ifølge producentens instruktion. Endelig blev cellerne analyseret ved flowcytometri under anvendelse af FACS Vantage maskine (Becton Dickinson). The Cell Quest software (Verity Software House) blev anvendt til at analysere data.

In situ

afsløring celledød

Mærkning af fragmenteret DNA til at vurdere apoptose blev udført med TUNEL farvning (grøn fluorescens), ved hjælp af

In situ

Cell Død Detection Kit (Roche, LA), som beskrevet i vores tidligere undersøgelse [19].

Måling af caspase 3-aktivitet

aktiviteten af ​​caspase 3 induceret af DHA behandling blev bestemt ved caspase-3 Activity Assay Kit (Merck, Darmstadt).

Måling af mitokondrisk membranpotentiale (Δψ

m) ved flowcytometri

Fyrre nM DioC6 (Sigma-Aldrich, MO) blev inkuberet med behandlede celler på angivne tidspunkter i 15 minutter ved 37 ° C. De høstede celler blev vasket med iskoldt PBS og analyseret ved flowcytometri under anvendelse Becton Dickinson FACS Vantage maskine (Becton Dickinson, NJ). Celler med lav Δψ

m blev præsenteret som en procentdel af den totale cellepopulation. Den CellQuest software (Verity Software House) blev anvendt til at analysere data.

Dyreforsøg

Alle eksperimenter dyr blev udført i henhold til de relevante nationale og internationale retningslinjer og er blevet godkendt af Institute Research Medicinsk etiske komité af Sun Yat-Sen University Cancer center. 1 × 10

7 af Hep G2 celler blev suspenderet i sterilt PBS og injiceret subkutant i den højre flanke af musene. Mus blev kontrolleret dagligt for xenograft /tumorudvikling. Mus blev randomiseret i tre grupper på 6 mus /gruppe. DHA (5 mg /kg mus legemsvægt) blev givet til ‘DHA’ gruppe, SAHA (1,5 mg /kg mus legemsvægt) blev givet til ‘SAHA’ gruppe, blev kombinationen af ​​SAHA og DHA givet til ‘DHA + SAHA ‘gruppe, én gang dagligt i fem på hinanden følgende dage om ugen i 24 d. DMSO gruppe modtog samme volumen kontrol opløsningsmiddel. Efter behandling ved forskellige tidsintervaller blev musenes kropsvægt og tumorstørrelse målt. Endelig blev tumorer udskåret, vejet og fikseret i 4% PFA. Paraffinindstøbte væv blev derefter sektioneret ved 4 nm og klar til H . E farvning og TUNEL assay

Immunhistokemi

formalin-fikseret og paraffinindstøbte leverkræft sektioner med en tykkelse på 4 um blev afvokset i xylen og graduerede alkoholer, hydreret og vasket i phosphatpufret saltvand (PBS). Efter forbehandling i en mikrobølgeovn, blev endogen peroxidase inhiberet af 3% hydrogenperoxid i methanol i 20 min, efterfulgt af avidin-biotin blokering under anvendelse af et biotin-blokerende kit (DAKO, Tyskland). Objektglas blev derefter inkuberet med antistoffer i 4 timer i et fugtigt kammer ved stuetemperatur, vasket i PBS og inkuberet med biotinyleret gede-anti-kanin /murine antistoffer. Slides blev udviklet med Dako Liquid 3, »3-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) + Substrat Kromogen System og modfarvet med hæmatoxylin.

Statistisk analyse

Forskel mellem grupper blev bestemt for statistisk signifikans ved hjælp af en way ANOVA eller Students

t

-test. Alle

P

-værdier er to-sidet og

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle statistiske beregninger blev udført med SPSS software (SPSS, Inc., Chicago, IL). Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra mindst tre uafhængige forsøg.

Resultater

Aktiveringer af MAP-kinaser var involveret i DHA-induceret apoptose

DHA har vist sig at inducere celledød i humane kræftformer [20], [21]. Vi først vurderes DHA-induceret apoptose i liver cancer cellelinjer, under anvendelse af Annexin V assay. Resultaterne indikerede, at procentdelen af ​​Annexin V-positive celler blev dramatisk forøget ved DHA behandling (fig. 1A), hvilket tyder på DHA er en potent apoptoseinducer i lever cancerceller. Sammenlignet med kontrollen efter eksponering i 10 pM DHA i 24 timer blev procentdelen af ​​apoptotiske celler bemærkelsesværdigt forøget fra 5,3% og 4,9% til 16,6% og 13,5%, henholdsvis i Hep G2 og PLC /PRF /5-celler (fig. 1B).

A. DHA induceret apoptose i lever kræftceller. Celler behandlet med enten DMSO eller 10 uM DHA i 24 og 48 timer blev farvet med både Annexin V og propidiumiodid (PI) i 45 minutter. Apoptose induceret af DHA blev derefter vurderet ved flowcytometer analyse. B. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev vist, efter at kvantitativ analyse af PI /Annexin V assay. Data er præsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. *

P

0,05, versus DMSO gruppen. C. MAP-kinaser blev aktiveret ved DHA. Celler blev behandlet med 10 pM DHA for angivne tid. Phosphoryleringen af ​​p38, ERK og JNK blev bestemt. D. Kvantitative data fra tre uafhængige forsøg blev vist at indikere den relative ekspression af p-p38, p-JNK, og p-ERK.

apoptoseinduktion normalt associerer med aktivering af MAP-kinaser. En tidsforløbet analyse blev udført på phosphoryleringsniveauerne af tre MAP-kinase medlemmer, herunder ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) og p38 (Fig. 1C). Protein- niveauerne af alle 3 MAP-kinaser forblev uændret. Imidlertid blev p38 phosphorylering steg efter DHA behandling i begge testede celler. Niveauet af JNK phosphorylering forblev den samme som kontrol i Hep G2-celler, men blev markant forøget i PLC /PRF /5-celler (Fig. 1d). Niveauerne af p-ERK dukkede faldende i både leveren cancerceller behandlet med DHA. Disse data kan antyde, at inaktivering af ERK bidrager til DHA-induceret apoptose.

Hæmning af ERK fosforylering blev tilskrevet DHA-induceret apoptose i leveren kræftceller

For at teste vores antagelse, at inaktivering af ERK var involveret i DHA-induceret apoptose, vi forbehandlet celler med PD98059, en inhibitor af ERK-phosphorylering. For det første blev cytotoksiciteten af ​​PD98059 testet. Resultater viste, at PD98059 alene forårsagede ikke betydelig apoptose i begge celler (data ikke vist). Derefter bestemte vi effekten af ​​PD98059 på DHA-induceret cellevækst dæmpning. Som angivet af MTT resultat, PD98059 signifikant reduceret lever- cancercellelinier levedygtighed sammenlignet med DHA grupper (fig. 2A).

PD98059, en inhibitor af ERK-phosphorylering, forstærkede DHA-inducerede fald i cellelevedygtighed. Celler blev forbehandlet med 10 pM PD98059 i 2 timer, og derefter inkuberet med 10 pM DHA i yderligere 24 timer. Den tilbageværende cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet. Dataene er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg, *

P

0,05. B. PD98059 behandling øget produktion af apoptotiske krop. Celler forbehandles med 10 pM PD98059 i 2 timer, og derefter inkuberet med 10 pM DHA i yderligere 24 timer blev farvet med Hoechst 33342 farvestof. DNA-fragmentering (angivet med en asterisk) og kernekondensering (angivet med pile) blev observeret under et fluorescensmikroskop. C. PD98059 behandling forbedret DHA-induceret apoptose. TUNEL-assayet blev udført for at bestemme apoptose. Antallet af apoptotiske celler blev bestemt, og procentdelen blev indikeret ved histogram. *

P

0,05. D. PD98059 plus DHA behandling førte til spaltning af PARP og caspase 3. Proteiner opsamlet fra celler behandlet med PD98059 og DHA i 24 timer blev underkastet western blot at detektere spaltning af PARP og caspase 3. Actin blev anvendt som en loading kontrol.

Dernæst vi undersøgt, om PD98059 behandling forbedret DHA-induceret celle væksthæmning gennem induktion af apoptose. Vi vurderede DHA-induceret apoptose i leveren kræftceller forbehandlet med 10 pM PD98059 i 2 timer af Hoechst 33342 farvning. Resultaterne viste flere celler med karakteristiske funktioner, herunder chromatinkondensation og apoptotisk organ præsenteret i PD98059-forbehandlede celler (fig. 2B). Dette blev yderligere bekræftet ved TUNEL undersøgelser, som viser, at de procentdele af TUNEL-positive celler blev forøget i leverkræft celler behandlet med både PD98059 og DHA (Fig. 2C). Desuden niveauer af spaltet PARP og spaltes caspase 3 blev mærkbart forøget ved ERK inhibitor i de 2 leverkræft cellelinjer (fig. 2D). Disse resultater tyder på, at DHA-induceret apoptose kan være relateret til ERK fosforylering.

HDACi lettet DHA-induceret apoptose i leveren kræftceller

I betragtning af, at HDACi er i stand til at forbedre dødelig virkning af kemoterapeutiske stoffer [22], [23], beregnet vi at undersøge, om DHA kombineret med HDACi resulterede i mere celledød i leverkræft. NaB og SAHA blev anvendt i MTT-analyse. Ifølge resultaterne, en kombination af DHA og HDACi signifikant reduceret celle levedygtighed i leverkræft celler, sammenlignet med behandling med enkelt middel (fig. 3A). Den øgede cytotoksicitet af kombination af DHA og HDACi blev også bestemt ved kolonidannelse assayet. Celler i DMSO grupper dannet en række synlige kolonier i 15 d. Antallet af koloni udgøres af celler dyrket med både DHA og HDACi var signifikant mindre end den med DHA alene (fig. 3B).

Kombinationsbehandling med HDACi og DHA øget celledød. Celler blev behandlet med 4 mM NaB, 1,25 pM SAHA, 10 uM DHA eller en kombination af NaB /SAHA og DHA i 24 timer. Cell levedygtighed blev målt ved MTT-assayet. B. Den inhiberende effekt af HDACi og DHA i kombination på leverkræft cellevækst blev yderligere bekræftet ved kolonidannelse assayet. Et hundrede af celler blev podet i plader med 6 brønde i 7 dage, og derefter dyrket med enten HDACi eller DHA for en anden 7 d. Kolonier blev farvet med 0,05% krystalviolet. Antallet af koloni i hver brønd blev talt og blev udført statistisk analyse. Data er præsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. C. Effekten af ​​HDACi på DHA-induceret apoptose blev målt ved TUNEL-assay under anvendelse af

in situ

påvisning celledød kit. Hep G2-celler behandlet som beskrevet i A blev underkastet TUNEL assay. Apoptotiske celler blev observeret under fluorescerende mikroskop. D. Virkningen af ​​HDACi og DHA i kombination blev yderligere bekræftet ved TUNEL-assay under anvendelse af flowcytometri. Procentdel af apoptotiske celler blev beregnet. E. Caspase 3 aktivering var involveret i HDACi-medieret apoptose i celler behandlet med DHA. Aktiviteten af ​​caspase 3 i celler behandlet som beskrevet i A blev bestemt, og relevant ændring blev vist. For A, B, D og E, *

P

0,05, **

P

. 0,01, versus DHA-gruppe på Airbnb

Næste vi bestemmes den pro-apoptotiske aktivitet af kombineret behandling med DHA og HDACi. DHA behandling kraftigt induceret apoptose i lever cancerceller, men mere apoptose blev induceret ved kombineret behandling med begge midler, som vist ved TUNEL assays indikerer en mærkbar stigning i TUNEL-positive celler (fig. 3C). Statistisk, DHA i kombination med NaB eller SAHA forøget apoptotiske celler med 1,9 eller 2,8 gange, respektivt i Hep G2-celler, og ved 3,0 eller 3,5 gange henholdsvis PLC /PRF /5-celler (fig. 3D). I tråd med den øgede apoptose, caspase 3-aktivitet var højere i celler behandlet med både DHA og HDACi (fig. 3E).

Frigivelse af cytochrom

c

i cytoplasmaet og nedregulering af Mcl-1 og p-ERK bidrog til apoptose forårsaget af den kombinerede behandling med HDACi og DHA

Vi har tidligere påvist, at DHA-induceret apoptose forbundet med Mcl-1 nedbrydning og Bak-aktivering [18]. Vi undersøgte derefter, om Mcl-1 og Bak var involveret i HDACi-medieret berigelse af apoptose i DHA-behandlede celler. Som anført i resultaterne af western-blot blev Mcl-1 faldt dramatisk, mens Bak markant forøget i Hep G2 celler behandlet med både DHA og NaB /SAHA. Ændringerne af Mcl-1 og Bak i PLC /PRF /5 celler delte en lignende tendens med dem i Hep G2-celler (fig. 4A). Desuden blev vildtype p53 i Hep G2-celler opreguleres, mens mutant p53 i PLC /PRF /5-celler næppe påvirket, efter behandlingen (fig. 4A).

Kombinationsbehandling med HDACi og DHA resulteret i nedregulering af Mcl-1 og opregulering af Bak. liver cancer celler blev udsat for 4 mM NaB, 1,25 pM SAHA, 10 uM DHA eller en kombination af NaB /SAHA og DHA i 24 timer. Ekspression af Mcl-1, Bak og spaltes PARP blev undersøgt ved western blot. Øvre panel: et repræsentativt resultat blev vist. Bundplade: den relative ekspression af Mcl-1 og Bak normaliseret til Actin blev indikeret ved histogram. B. Ekspressionen af ​​p-ERK blev reduceret i celler behandlet med HDACi og DHA. Proteiner indsamlet fra leverkræft celler behandlet med SAHA, DHA eller de kombinerede lægemidler blev udsat for western blot at undersøge p-ERK udtryk. Øvre panel: et repræsentativt resultat blev præsenteret. Bundplade: den relative ekspression af p-ERK /ERK blev vist. C. Reduktion af mitochondriemembranpotential (MMP) blev induceret i HDACi /DHA-behandlede celler. Hep G2 og PLC /PRF /5-celler blev behandlet som beskrevet i A. MMP sammenbrud (Δψ

mL) blev målt ved flowcytometri efter farvning af cellerne med DioC6 og kvantitativ analyse af Δψ

m blev vist. Dataene repræsenteret middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. D. cytochrom

c

blev frigivet til cytosolen i behandlede celler. Cellerne blev behandlet som beskrevet i A. Fraktioner af cytosol blev isoleret for at undersøge fordelingen af ​​cytochrom

c

. p-actin blev anvendt som markør for cytosol. E. HDACi forbehandling sensibiliserede celler til DHA-induceret apoptose. liver cancer celler forbehandlet med 4 mM NaB eller 1,25 pM SAHA i 2 timer blev yderligere udsat for 10 uM DHA i yderligere 24 timer. TUNEL assays blev udført for at bestemme apoptose. Procentdelen af ​​TUNEL-positive celler blev vist. For B, C og E, *

P

. 0,05, versus DHA-gruppe på Airbnb

I lyset af nye data, som ERK fosforylering blev hæmmet i DHA-behandlede og HDACi- behandlede celler. Vi undersøgte dernæst niveauet af phosphoryleret ERK. Resultaterne viste et hurtigt fald af p-ERK i leverkræft celler behandlet med både DHA og SAHA, især i PLC /PRF /5-celler (fig. 4B).

Siden DHA-induceret apoptose blev tilskrevet depolarisering mitochondriel ydre membran [18], vi undersøgte dernæst reduktion af mitokondrielle membranpotentiale (MMP). Resultaterne viste, at den kombinerede behandling bemærkelsesværdigt sænkede mitokondrielle transmembranpotentiale (fig. 4C), efterfulgt af en indlysende frigivelse af cytochrom

c

fra mitokondrier til cytoplasma (Fig. 4D).

Som vist i vores tidligere undersøgelse, at HDACi forbehandling sensibiliserede liver kræftceller etoposid [22]. Vi forbehandlede celler med NaB eller SAHA, og derefter vurderet den resulterende apoptose ved TUNEL assays. Sammenlignet med de fra unpretreated celler, blev procentdele af TUNEL-positive celler i HDACi-forbehandlede celler signifikant forøget (fig. 4E).

SAHA forbedret antitumorvirkning af DHA på Hep G2 xenograft tumor i mus

Efter at have demonstreret evne SAHA at øge DHA-medieret celledød

in vitro

, vi yderligere bestemmes synergi effekt af SAHA og DHA

in vivo

. Hep G2-celler blev injiceret subkutant i nøgne mus for at etablere tumor xenograft. Nøgne mus med tumorxenoplantater blev doseret med DHA (5 mg /kg /bud) og /eller SAHA (1,5 mg /kg /Bud) dagligt i 24 dage. Behandlingen syntes ikke at have en mærkbar virkning på kropsvægten hos mus. I gennemsnit kombinationsterapien inhiberede leverkræft tumorvækst med over 44,7%, mens enkelt middel behandling med enten DHA eller SAHA kun inhiberede tumorvækst med 17,6% og 4,6%, henholdsvis (fig. 5A). På dag 24 blev mus aflivet, og tumorvægte blev målt. Som forventet, at kombinationen af ​​HDACi og DHA reducerede signifikant vægten af ​​xenograft tumor, sammenlignet med DHA-udelukkende grupper (fig. 5B). Disse data viste, at kombinationsbehandlingen genereret en større anti-proliferativ effekt og cytotoksicitet end enten enkeltstof alene i leverkræft implanteret

in vivo

.

Kombination af SAHA og DHA mærkbart bremset væksten i Hep G2 xenograft tumor. Nøgne mus blev inokuleret med 1 x 10

7 af Hep G2-celler. Efter den dannede tumor var palpabel blev musene tilfældigt inddelt i fire grupper. DHA (5 mg /kg mus legemsvægt) blev givet til ‘DHA’ gruppe, blev SAHA (1 mg /kg mus legemsvægt) givet til ‘SAHA’ gruppe, blev kombinationen af ​​SAHA og DHA givet til ‘DHA + SAHA ‘gruppe, én gang dagligt i fem på hinanden følgende dage om ugen i 24 d. Tumorvolumenerne blev beregnet hver anden dag. Seks xenotransplantater blev udført i hver gruppe. Dataene er gennemsnit ± SD, *

P

0,05, versus DMSO gruppen. B. Kombination af Saha og DHA behandlinger resulterede i en dramatisk nedgang i tumor vægt. På dag 24 blev musene aflivet, og tumorvægte blev målt. C. Apoptose blev induceret

in vivo

. Tumorer blev snittet og apoptose blev bestemt ved hjælp af

in situ

celledød afsløring kit. Apoptotiske celler blev observeret under fluorescerende mikroskop. D. SAHA steg betydeligt apoptose i DHA-behandlede mus. Procentdele af apoptotiske celler blev målt ved at tælle antallet af grønne celler under fem tilfældige felter.

For at teste, om HDACi forstærkede den letale virkning af DHA via stigende apoptose, blev tumorvæv sektioneret og underkastet

in situ

påvisning celledød (fig. 5C). Resultaterne viste, at andelen af ​​apoptotiske celler var signifikant forøget fra 8,6 ± 2,4% i DHA-gruppe til 17,7 ± 3,3% i kombineret behandlingsgruppe (fig. 5D). Derudover undersøgte vi histologi af tumorer efter behandling under anvendelse af H & E farvning. Tumorer fra kontrolgruppen udviste typisk histologisk udseende leverkræft (fig. 6). De dele af DHA-behandlede tumorer viste, at cancerceller markant reduceredes, med tegn på apoptose, infiltration af inflammatoriske celler og fibrose. I den kombinerede behandlede gruppe, kunne apoptotiske regioner og omfattende nekrose med infiltrering af fagocytiske celler observeres temmelig ofte.

SAHA udvidede den apoptotiske region forårsaget af DHA behandling i Hep G2 xenograft tumor. Tumorer blev udskåret og udsat for H & E-farvning til bestemmelse af patologisk evaluering. På den anden side, blev væv af xenotransplantater underkastet immunkemi at detektere ekspressionen af ​​Ki-67, p53, Mcl-1, p-ERK, og aktiv PARP. Original forstørrelse × 400.

Derudover har vi udført immunhistokemi til at opdage de proteiner, der er involveret i HDACi /DHA-induceret apoptose (fig. 6). Nedsat ekspression af Ki-67 er angivet reduktionen af ​​celleproliferation og sandsynligvis forøget celledød. Påviselig forskel i p53-ekspression blev observeret. Slående forøgelse af aktivt PARP, samt en overvejende fald i Mcl-1, og p-ERK, var til stede i HDACi /DHA-behandlede xenotransplantat. Tilsammen disse data viste, at HDACi kunne betydeligt forøge DHA-medierede antitumorvirkninger.

Diskussion

Nylige undersøgelser tyder på, at HDACi herunder NaB og SAHA interagere synergistisk med cytostatika, såsom fludarabin og etoposid, at dramatisk øge mitokondrie skade og apoptose i leukæmiske og epitelial cancerceller [24], [25]. De antitumorigenic egenskaber HDACi er særligt bemærkelsesværdige sandsynligvis skyldes, at deres cytotoksiske virkninger er sædvanligvis specifik for cancerceller, men ikke for normale celler. Men når det anvendes som et enkelt middel, måske HDACi udviser begrænset dødbringende aktivitet mod leverkræft, hvilket er tydeligt i denne undersøgelse, der viser, at både NaB og SAHA ved lave doser er i stand til at fremkalde en betydelig vækst hæmning

in vitro

og

in vivo

. Men når HDACi anvendes i kombination med DHA, et derivat af artemisinin, der anvendes klinisk i malaria behandling med god toksicitetsprofil [26], kan fremkalde meget mere apoptose, hvilket resulterer i en bemærkelsesværdig standsning af tumor xenograft i nøgne mus. Der er meget begrænset information om HDACi i kombination med andre anti-tumormidler mod leverkræft. Vore data for første gang har vist en synergistisk virkning af DHA og HDACi i hæmning af leverkræft.

Mange rapporter har vist, at tærsklen af ​​apoptose i cancerceller kan styres ved aktiviteterne i flere signaltransduktionsveje , hvoraf den ene er Raf-MEK1 /2-ERK1 /2-vejen [27], [28]. Denne vej er ofte dysreguleret i neoplastisk transformation, sammen med c-Jun NH2-terminal kinase (JNK1 /2) og p38 MAPK pathways [29]. Det har også været impliceret, at aktivering af ERK1 /2-vejen sædvanligvis er forbundet med overlevelse, men JNK1 /2 og p38 MAPK-vejen med apoptose [30]. I vores undersøgelse blev ERK1 /2 phosphorylering svagt inhiberet af DHA behandling men stærkt inhiberet af den kombinerede behandling med DHA og HDACi. Desuden, ved hjælp af ERK-specifikke inhibitor PD98059, demonstrerede vi, at aktiveringen af ​​ERK er antiapoptotisk eftersom ERK inhibitoren forbedret DHA-induceret apoptose i lever cancerceller.

En række anti-apoptotiske effektor proteiner er blevet identificeret nedstrøms for ERK1 /2-signalering, herunder Bd-xL og Mcl-1 [31], [32]. Ændringer af både phosphoryleret ERK og Mcl-1 ofte forekommer i den samme retning. Yuen et al. rapporterede, at silencing Ran kan medføre deaktivering af ERK og nedregulering af Mcl-1 i cancerceller [33]. Reeves et al. viste, at aktiveringen af ​​ERK og induktion af Mcl-1 blev observeret i myeloide celler inficeret med humant cytomegalovirus [34]. Calvino et al. rapporterede treatement med lonidamin plus arseniktrioxid medførte reduktioner på Mcl-1 og p-ERK [35]. I vores tidligere undersøgelse blev Mcl-1 nedreguleret i DHA-behandlede celler [ref].