PLoS ONE: DNA Skader Enhanced af dæmpningen af ​​SLD5 Forsinkelser Cell Cycle Restoration i normale celler, men ikke i Cancer Cells

Abstrakt

SLD5 er medlem af genever kompleks sammensat af PSF1, PSF2, PSF3 og SLD5 , spiller en kritisk rolle i dannelsen af ​​DNA-replikation gaffel med CDC45 i gær. Vi havde tidligere, isoleret et PSF1 ortholog fra en murin hæmatopoietisk stamcelle DNA-bibliotek og kunne derefter identificere orthologer af alle de andre genever medlemmer af gæren to hybrid tilgang med PSF1 som lokkemad. Disse gin orthologer kan også fungere i DNA-replikation i mammale celler, fordi de danner tetramere komplekser som observeret i gær og gen deletionsmutanter af både PSF1 og SLD5 resultat i manglende epiblasten proliferation og tidlig embryonisk letalitet. Vi fandt imidlertid, at PSF1 også er involveret i kromosomal segregering i M-fasen, i overensstemmelse med nylige forslag, homologer af gener associeret med DNA-replikation i lavere organismer også regulerer andre end DNA-replikation i pattedyrceller cellulære begivenheder. Her analyserede vi funktionen af ​​andre end DNA-replikation SLD5 og fandt, at den er aktiv i DNA-beskadigelse og reparation. Dæmpning af SLD5 ekspression resulterer i markant DNA-skader i både normale celler og cancerceller, hvilket antyder, at det beskytter mod DNA skader. Dæmpning af SLD5 forsinker DNA-reparation respons og cellecyklus restaurering i normale celler, men ikke i cancerceller. Disse resultater antyder, at SLD5 kan udgøre et terapeutisk målmolekyle handler på niveau med stromale tumorceller snarere end cancercellerne selv, fordi udvikling af tumormikromiljøet kan blive forsinket eller forstyrres af undertrykkelse af dets ekspression i de normale celletyper inden for tumor

Henvisning:. Gong ZY, Kidoya H, Mohri T, Han Y, Takakura N (2014) DNA Skader Enhanced af dæmpningen af ​​SLD5 Forsinkelser Cell Cycle Restoration i normale celler, men ikke i kræftceller. PLoS ONE 9 (10): e110483. doi: 10,1371 /journal.pone.0110483

Redaktør: Ryuichi Morishita, Osaka University Graduate School of Medicine, Japan

Modtaget: August 12, 2014 Accepteret: September 15, 2014; Udgivet 21. oktober, 2014

Copyright: © 2014 Gong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af det japanske ministerium for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi og Tilskud-i-Aid for Videnskabelig Forskning (KAKENHI) fra Japan Society for fremme af Science. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Nobuyuki Takakura er nu en akademisk redaktør af dette tidsskrift. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Celler er konstant udsat for genomisk DNA skader forårsaget af interne og eksterne midler, såsom oxidativ stress og UV, henholdsvis. Fejl i DNA-skader reparation kan resultere i cancer celleudvikling [1], [2]. At forhindre oncogen transformation, normale celler overvåge og reparere DNA-skader i deres genom ved at indstille cellecykluskontrolpunkter [3]. Men cancerceller er i stand til at tolerere DNA-beskadigelse, således at replikation fortsætter uden reparation, hvilket resulterer i akkumulering af abnorm mutant genekspression [4]. Denne begivenhed er blevet foreslået som en af ​​årsagerne til kemo- og radio-resistens udvikling i maligne cancerceller.

SLD5 er medlem af genever kompleks sammensat af PSF1, PSF2, og PSF3. Dette kompleks regulerer DNA-replikation gaffel i knopskydende gær [5]. I initieringen af ​​DNA-replikation, oprindelsen anerkendelse kompleks (ORC) binder til autonomt replikerende sekvens (ARS), der fungerer som en DNA-replikation starte domæne. Efterfølgende celledeling cyklus (CDC) 6 og Cdc1 binder til ARS styret af ORC og fremkalde binding af mini-kromosom vedligeholdelse (Mcm) proteiner onto ARS. Disse betegnes præ-replikationskomplekser (pre-RC) [6] – [8]. Endvidere Cdc45 og genever rekrutteres til at pre-RC og danne aktiveret CMG (Cdc45-Mcm-gin) helicase på DNA replikation gaffel [9] – [12].

Vi identificerede en mus ortholog af PSF1 i et DNA-bibliotek afledt af hæmatopoietiske stamceller under embryogenese, hvor denne cellepopulation prolifererer aktivt [13]. Efterfølgende identificerede vi SLD5 anvendelse af et gær-to-hybrid system med PSF1 som agn [14]. Desuden identificerede vi alle medlemmer af gin i mus og bekræftede, at de danner komplekser som observeret i gær [15]. Vi har tidligere rapporteret, at mutant mus mangler for PSF1 eller SLD5 viser tidlige embryonale dødelighed forårsaget af væksten anholdelsen af ​​epiblasts på embryonale dag 6,5 [13], [16]. Disse resultater antydede, at PSF1 og SLD5 er funktionelle i pattedyr og afgørende for celleproliferation, muligvis associere med DNA-replikation som observeret i gær.

Høj udtryk for genever gener er blevet observeret i kræft og en korrelation af deres niveau af ekspression med malignitet er blevet foreslået [17] – [19]. Vi rapporterede også, at cancerceller udviser højere PSF1 promotoraktivitet er kræft igangsættende /stamceller i en murin tumorcelle transplantation model [20]. En funktion af maligne cancerceller er kemo- og radio-resistens. Højniveauekspression af genever gener kan inducere ikke kun cellevækst men også resistens mod kemoterapi. Det er imidlertid ikke blevet fastslået, om funktionen af ​​genever gener er involveret i DNA-skader eller reparation. Ved at observere knoglemarvscellulariteten i mutante mus, vi tidligere vist sig, at haploinsufficiency af PSF1, men ikke SLD5, reducerer cellevækst [13], [16]. Det er derfor kompliceret at analysere funktionen af ​​PSF1 i DNA-skade ved at banke ned PSF1 ekspression fordi cellevækst selv også er påvirket af manglen på denne faktor. I tilfælde af SLD5, heterozygote SLD5

+/- mus, som var sund og frugtbar, blev født på Mendelsk frekvens og udstillet normal vækst. Desuden er der ingen stor forskel på knoglemarvscellulariteten mellem vilde og SLD5

+/- mus [16]. Derfor brugte vi SLD5

+/- muse embryonale fibroblaster (MEF’er) at analysere DNA-skader reparation og cellevækst efter DNA-skader. Desuden har vi sammenlignet funktionen af ​​SLD5 i DNA-skader reparation hjælp siRNA knock-down eksperimenter i kræftceller.

Materialer og metoder

Cell kultur og narkotikabehandling

MEF, B16-celler (muse-melanomceller), og colon26 celler (muse colon cancer celler) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Sigma) med 10% føtalt bovint serum (FBS, Sigma), og penicillin /streptomycin (Sigma) ved 37 ° C under en atmosfære af 5% CO

2. MEF’er blev fremstillet fra vildtype (WT) eller SLD5

+/- mus ved embryonisk dag (E) 15.5 ifølge den sædvanlige metode [16]. B16-celler og colon26 celler blev indkøbt fra Riken cellebank (Tsukuba, Japan). Cellerne blev behandlet med 1 pM eller 10 pM etoposid (Sigma). For at fremkalde DNA-skader kraftigt, brugte vi 10 pM etoposid. Men 10 pM etoposid alvorligt induceret celle apoptose. Derfor brugte vi 1 pM etoposid at observere cellecyklus restaurering. Dyrene blev opstaldet i miljømæssigt kontrollerede værelser på dyreforsøg facilitet på Osaka University. blev udført Alle eksperimenter henhold til gældende love og retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr i Forskningsinstitut for Mikrobiel sygdomme, Osaka University, der er godkendt af dyreforsøg udvalg af Forskningsinstitut for Mikrobiel sygdom, Osaka University (Permit nummer 3239- 6). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

siRNA transfektion

SLD5 udtryk i B16 og Colon26 celler blev forbigående slået ned med små interfererende RNA (siRNA) . Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) blev anvendt til transfektion af plasmid og siRNA i celler, ifølge producentens protokoller, og eksperimenter blev udført 48 timer efter transfektion. Vi anvendte to forskellige siRNA oligonukleotider specifikke for SLD5; Mål siRNA-sekvenser var: 5′-GGA CCA CAC GGA GAC CCA CUU UAA A-3 ‘(# 1); 5’-GAU GAG CAG AGA GAC UAC GUG AUU G-3 ‘(# 2).

Trypan test blå udelukkelse for cellernes levedygtighed og genvækst efter behandling med etoposid

5 × 10

3-celler blev podet i hver brønd i en 24-brønds kulturplade (BD Falcon) i 500 pi medium. Efter 24 timer blev brøndene eksponeret for 1 pM etoposid i 12 timer. Efter at lægemidlet blev fjernet, blev celler høstet straks (0 h). Cellelevedygtighed blev evalueret ved trypanblåt-eksklusion. Det samme antal levende celler blev resuspenderet i frisk medium, og cellerne blev dyrket i 24, 48 eller 72 timer. De blev derefter løsgøres ved tilsætning af 100 pi Trypsin-EDTA til hver brønd; Cellerne blev derefter vasket og resuspenderet i 400 pi medium. 20 pi resuspenderede celler blev blandet med 20 pi af 0,4% opløsning af trypanblåt (Life Technologies) i 1 min. Celler blev straks talt under anvendelse af et Neubauer mikrokammeret med et lysmikroskop. Alle tællinger blev udført ved hjælp af fire tekniske dubletter af hver prøve. Gennemsnit og standardafvigelser blev beregnet for hver subkultur.

Western blotting

Celler blev opsamlet og lyseret i SDS-prøvebuffer (50 mM Tris-HCI, pH 6,8, 2% natriumdodecylsulfat, 6 % 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0,003% bromphenolblåt) indeholdende en cocktail af proteaseinhibitorer. Proteiner blev separeret på 10% eller 15% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Efter blokering i 1 time i TBST (25 mM Tris, pH 7,5, 1,37 M NaCl, 27 mM KCI, 0,05% Tween 20) indeholdende 2% fedtfri tørmælk, membraner blev inkuberet med anti-SLD5 (1:1000; Iwaki) , anti-γ-H2AX (1:500; Cell Signaling), anti-RAD51 (H-92; 1:1000; Santa Cruz) eller muse-anti-β-actin-antistof i blokeringsbuffer natten over. Membraner blev derefter vasket med TBST og inkuberet med HRP-konjugeret anti-rotte, kanin eller gede-antistoffer (1:10000) i 1 time. Bundne antistoffer blev påvist med ECL kit (Amersham). De immunreaktive proteiner blev visualiseret ved anvendelse af ECL Prime Western Blotting Detection System (GE Healthcare, Buckinghamshire). Blottene blev scannet under anvendelse af billeddannende densitometer Las-300 mini (Fujifilm, Tokyo, Japan).

Statistical Analysis

Resultater udtrykkes som middelværdi ± SD. Studerendes

t

test blev anvendt til statistisk analyse. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når

s

. 0,05

Resultater

Forbedret DNA-skader ved dæmpningen af ​​SLD5 udtryk i MEF’er

For at vurdere, om SLD5 angår DNA beskadigelse respons sammenlignede vi forskellen mellem DNA-skader under anvendelse MEF’er fra WT mus og SLD5

+/- mus [16]. Vi bekræftede, at niveauet for SLD5 i SLD5

+/- MEF’er var ca. halvdelen af ​​det i WT MEF (figur 1A og B). For at undersøge DNA-skader, vi udfordrede MEF’er med etoposid, en topoisomerase Π inhibitor, der inducerer DNA dobbelt-strenget pauser [21], [22]. Celler blev behandlet med 0,01% DMSO som kontrol eller med 10 pM etoposid i 1 time. I steady state (udsættelse for DMSO), niveauet af phosphorylering af kromatin histon H2AX (γ-H2AX), som er en kvantitativ markør for DNA beskadigelse respons ved stedet for dobbelt-strenget pauser [23], [ ,,,0],24], var ligeledes lav i både WT og SLD5

+/- MEF’er (figur 1C og D). Udsættelse for etoposid ført til en stigning i niveauet af γ-H2AX i både WT og SLD5

+/- MEF’er, men betydeligt mere i sidstnævnte (fig 1C og D).

(A) Western blot analyse af SLD5 udtryk i WT og SLD5

+/- MEF. β-actin var den interne kontrol. (B) Kvantitativ evaluering af SLD5 udtryk som åbenbaret i (A) baseret på densitometrisk analyse. Resultaterne er repræsenteret som fold-ændring i forhold til niveauet i WT MEF. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD. *,

P

0,05 (n = 3). (C) Western blot-analyse af γ-H2AX ekspression i WT og SLD5

+/- MEF’er efter behandling med etoposid (ETO) eller vehikelkontrol (DMSO). β-actin var den interne kontrol. (D) Kvantitativ evaluering af γ-H2AX udtryk som åbenbaret i (C). Resultaterne er fold-ændringer i forhold til det niveau, set i WT MEF’er behandlet med DMSO. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD. *,

P

. 0,05 (n = 3)

Forsinkelse af cellecyklus restaurering af dæmpningen af ​​SLD5 udtryk i MEF’er efter DNA-skader

Til belyse, om mærket DNA skader forårsaget af dæmpningen af ​​SLD5 udtryk vedrører DNA-skader reparation, vi målte niveauet af RAD51 protein, som er nøglen komponent til homolog rekombination [25]. Som beskrevet ovenfor blev MEF’er behandlet med 1 pM etoposid i 12 timer, og RAD51-proteinekspression blev derefter analyseret ved 0, 24, 48 og 72 timer efter fjernelse (figur 2A, B). Niveauet af RAD51 udtryk var tilsvarende i WT og SLD5

+/- MEF’er før behandling med etoposid. I WT MEF, niveauet af RAD51 steget markant hurtigt efter udsættelse for etoposid, men i mindre grad i SLD5

+/- MEF’er, og gradvist faldet på 24, 48 h, næsten tilbage til baseline efter 72 timer. I modsætning hertil RAD51 protein i SLD5

+/- MEF’er steget langsommere end i WT MEF’er og blev opretholdt i længere tid. Dette antyder, at en længere periode er nødvendig for DNA-reparation efter omfattende DNA skader i SLD5

+/- MEF. Forlænget DNA repair i SLD5

+/- MEF’er igen antyder forsinket cellecyklus restaurering efter DNA beskadigelse. Vi derfor tælles antallet af levedygtige celler efter behandling med etoposid som beskrevet ovenfor. Celleproliferation blev bestemt ved trypan udelukkelse test blå. Der var ingen signifikant forskel mellem WT og SLD5

+/- MEF proliferation efter eksponering for DMSO-kontrol (figur 3A), hvilket antyder, at halveret SLD5 ekspression i MEF’er ikke påvirker cellevækst selv. Derimod ved udsættelse for etoposid, SLD5

+/- MEF’er vises betydeligt forsinket cellevækst sammenlignet med WT MEF’er (figur 3B).

(A) Western blot-analyse af RAD51 ekspression i WT og SLD5

+/- MEF. β-actin var den interne kontrol. MEF’er blev behandlet med etoposid i 12 timer (-12~0) og lyseret på de angivne tidspunkter. (B) Kvantitativ evaluering af RAD51 ekspression som åbenbaret i (A) baseret på densitometrisk analyse. Resultaterne er fold-ændring i forhold til niveauet i WT MEF før behandling med etoposid. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD *,

P

. 0,05 (n = 3)

MEF’er blev behandlet med DMSO (A) eller etoposid (B) som angivet i. Figur 2 og det samme antal levende celler som indikeret blev dyrket med frisk medium i 72 timer. Celler blev talt på det angivne tidspunkt. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD. *,

P

0,05 (n = 3)

DNA skader er forbedret i kræftceller ved dæmpningen af ​​SLD5 udtryk

I normale celler sådanne. som MEF’er blev DNA beskadigelse kraftigt induceret af dæmpningen af ​​SLD5 ekspression. Vi næste testede, om cancerceller viser også lignende reaktioner på etoposid når SLD5 ekspression blev forhindret. Til dette formål blev SLD5 udtryk slået ned i B16 mus melanom celler og Colon26 mus tyktarmskræft celler ved transfektion siRNA (# 1 og # 2) rettet mod SLD5 (siRNA B16 og siRNA Colon26). Vi bekræftede, at SLD5 udtryk kunne effektivt bragt til tavshed af specifikke siRNA i B16 og Colon26 celler, men ikke af scrambled kontrol siRNA (SCR B16 og SCR Colon26) (Figur 4A-D). Ved hjælp af disse celler, vi kvantificeret DNA-beskadigelse ved at måle niveauet af γ-H2AX ved Western blotting. Efter opretholdelse i komplet medium i 48 timer blev celler behandlet med DMSO som kontrol eller 10 pM etoposid i 0,5 timer. Den oprindelige γ-H2AX ekspressionsniveauet var ikke høj i enten SCR B16 eller siRNA B16-celler (figur 5A, B). Udsættelse for etoposid førte til et øget niveau af γ-H2AX i både SCR B16-celler og siRNA B16-celler, men det var betydeligt højere i sidstnævnte (figur 5A, B). Tilsvarende i Colon26 celler, dæmpning af SLD5 ekspression forstærket DNA-beskadigelse ved etoposid (figur 5C, D). Samlet konkluderer vi, at SLD5 ekspression vedrører DNA-skader i normale celler og cancerceller.

B16 eller Colon26 celler blev transficeret med scrambled negativ kontrol (SCR) eller SLD5 siRNA’er (# 1, # 2) og høstet 48 timer efter transfektion. SLD5 protein ekspressionsniveauer i B16 (A, B) eller Colon26 (C, D) blev kvantificeret ved Western blotting. β-actin var den interne kontrol. Data blev kvantitativt evalueret baseret på densitometrisk analyse (B, D). Resultaterne er repræsenteret som fold-ændring i forhold til niveauet i siRNA-ubehandlede B16-celler (B) eller Colon26 celler (D), hhv. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD *,

P

. . 0,05 (n = 3)

Western blot analyse af γ-H2AX udtryk i SCR eller SLD5 siRNA-transficerede B16 (A, B) eller Colon26 (C, D) celler efter behandling med etoposid (ETO) eller vehikelkontrol (DMSO). β-actin var den interne kontrol. Data blev kvantitativt evalueret baseret på densitometrisk analyse (B, D). Resultaterne er fold-ændring i forhold til niveauet i SCR siRNA-behandlede B16-celler (B) eller Colon26 celler (D), hhv. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD. *,

P

0,05 (n = 3)

Dæmpning af SLD5 udtryk i cancerceller ikke forsinke cellecyklus restaurering efter DNA skader

Vi. forudsagt, at dæmpning af SLD5 udtryk ville forsinke DNA-reparation og cellecyklus restaurering i cancerceller som observeret i normale celler. Men selv om niveauet for RAD51 ekspression var den samme i SCR B16 og SLD5 siRNA B16-celler, og i SCR Colon26 og SLD5 siRNA Colon26 celler før behandling med etoposid, derefter blev en hurtig forøgelse af RAD51 ligeledes observeret i alle fire cellelinjer ( Figur 6A-D). Svarende til den markerede DNA-skader i siRNA B16 og siRNA Colon26 celler, blev forlænget højt niveau RAD51 udtryk observeret i disse linjer. Således en længere periode for DNA-reparation var fælles for normale celler og cancerceller, men formindsket hurtig reaktion på DNA skader som følge af dæmpning af SLD5 udtryk i normale celler blev ikke set i kræftceller.

SCR eller SLD5 siRNA transficerede B16 (A, B) eller Colon26 (C, D) celler blev behandlet med etoposid i 12 timer (-12~0). Cellerne blev lyseret på de angivne tidspunkter. Western blot analyser af RAD51 ekspression er vist. β-actin var den interne kontrol. Data blev kvantitativt vurderet ud fra densitometrisk analyse. Resultaterne er fold-ændring i forhold til niveauet i SCR B16 (B) eller SCR Colon26 (D) før behandling med etoposid. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD *,

P

. . 0,05 (n = 3)

For at vurdere, hvordan den hurtige respons på DNA skader i SLD5 bankede-down kræftceller påvirker cellecyklus restaurering, vi opregnede cellerne efter behandling med etoposid. Celleproliferation selv var ikke påvirket af vælte SLD5 i enten siRNA B16 eller siRNA Colon26 celler i nærvær af kontrol DMSO behandling (figur 7A, C). Otteogfyrre timer efter etoposid-medieret DNA-skader, var der kun lille forsinkelse af cellecyklus restaurering i både siRNA B16 og siRNA Colon26 i forhold til den, der ses i SCR B16 og SCR Colon26. Men efter 72 timer blev cellevækst induceret i SLD5-tavshed cancerceller i samme omfang som i kontroller i både B16 og Colon26 celler (figur 7B, D). , Konkluderer derfor vi, at omfattende DNA-skader som følge af svækkelsen af ​​SLD5 udtryk alvorligt påvirker cellecyklus restaurering i normale, men ikke kræftceller.

SCR eller SLD5 siRNA transficerede B16 (A, B) eller Colon26 (C, D ) -celler blev behandlet med DMSO (A, C) eller etoposid (B, D) som angivet i figur 6 og det samme antal levende celler som indikeret blev dyrket med frisk medium i 72 timer. Celleantal blev registreret. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD *,

P

. 0,05 (n = 3)

Diskussion

Det er blevet rapporteret, at SLD5 danner en gin. kompleks med andre dele, såsom PSF1, PSF2, og PSF3 og er involveret i DNA-replikation i gær [5]. I nærværende rapport, foreslår vi, at SLD5 er involveret i DNA-skader og reparation i pattedyrceller. Dæmpning af SLD5 udtryk resulterede i markant DNA-skader ved midler, der fremmer DNA dobbelt strengebrud; dette var fælles for normale celler og cancerceller. En længere periode var nødvendig for genoprettelse af cellecyklussen, da DNA-skader var omfattende. Til denne reaktion, cellerne behøver at øge DNA-reparation. Da SLD5 ekspression blev reduceret i normale celler, blev ekspression af RAD51 forsinket, hvilket antyder, at SLD5 også er involveret i DNA-reparation proteinkonstruktionen. I modsætning hertil blev hurtig RAD51 ekspression induceres i cancerceller efter DNA beskadigelse og forsinkelse af cellecyklus restaurering var ikke så alvorlig som i normale celler. Roller genever gener i andre typer af kræft er blevet rapporteret [17], [26]. Den foreslår derfor, at funktionen af ​​SLD5 i DNA-skader og reparation også anvendes i andre typer tumorceller end melanom og colon cancerceller, der anvendes i vores eksperimenter. er behov for yderligere forsøg for at afklare dette

Som beskrevet ovenfor er gin kompleks involveret i DNA replikation.; dog behøver gin komponenter PSF1, PSF2, PSF3, og SLD5 ikke altid danne komplekser og kan have andre funktioner. For eksempel PSF1 regulerer mikrotubulus organisation i M-fase og er involveret i kromosom opdeling [20]. For nylig er det blevet rapporteret, at homologe molekyler associerer med DNA-replikation i lavere organismer også kan regulere andre end DNA-replikation [27] cellulære begivenheder – [29]. Derfor er det muligt, at SLD5, et molekyle involveret i DNA-replikation i gær, er også involveret i DNA beskadigelse reparation. En tidligere rapport foreslået, at DNA-skader er forhindret, når kromatin kondenseres med histon [30]. Men under DNA-replikation, er nøgent DNA adskilles fra histon og er truet af agenter, som inducerer DNA dobbelt streng pauser. Sådan SLD5 beskytter fra DNA dobbelt-strengbrud er hidtil uklart, men det kan være involveret i histon modifikation. Yderligere kræves præcis analyse for at belyse den mekanisme af DNA-skader beskyttelse, som SLD5.

Det var at vente, at ville være behov for en længere periode for DNA-reparation i celler med dårligere DNA skade som følge af manglende SLD5. Vi antager, at hurtig RAD51 udtryk ville blive induceret i SLD5

+/- MEF’er sammenlignet med WT MEF til reparation stærkt beskadiget DNA. Imidlertid blev SLD5 dæmpning sig at forsinke RAD51 ekspression i MEF’er, har resulteret i alvorlig forsinkelse af cellecyklus restaurering. Disse resultater antydede, at SLD5 ikke kun beskytter mod DNA skader, men regulerer den hurtige DNA-reparation. For nylig er det blevet rapporteret, at PSF2, også et medlem af gins komplekset, phosphoryleres med ATM upon DNA strengbrud [31]. Derfor er det muligt, at PSF2 er involveret i DNA-reparation også. Endvidere er det blevet rapporteret, at de N-terminale og C-terminale domæner af Sld5 interagere med N-terminalen og de C-terminale regioner af Psf2 i krystalstrukturen af ​​humane gin komplekset [32], og Sld5 fandtes at interagere af to-hybrid med PSF2 i

Drosophila

[33]. Det vil være interessant at analysere interaktioner mellem SLD5 og phosphoryleret PSF2 under DNA-reparation.

Nylige undersøgelser har vist, at tumorvækst og metastase bestemmes ikke af cancerceller alene, men også af forskellige stromale celler. Stroma udgør en stor del af de fleste faste tumorer, og kræft-stromal celle interaktion bidrager funktionelt til tumorvækst og metastase [34], [35]. Tumorstroma indeholder mange forskellige typer af celler, herunder cancerassocierede fibroblaster (CAF), pericytter, endotelceller infiltreret immunceller. Blandt dem, CAF er den vigtigste celletype, som spiller en afgørende rolle i tumorgenese og metastase [36], [37]. Resultaterne af vores eksperimenter har vist, at dæmpning af SLD5 inducerede markant DNA-skader og undertrykt hurtig genopretning cellecyklus i MEF. Derfor vi forudsagde, at SLD5 inhibitorer kunne være kandidat kræftmedicin. Vi fandt, at i cancerceller, er DNA-skade kraftigt induceret ved lyddæmpende SLD5 ekspression, som observeres i MEF’er; dog RAD51 hurtigt vokset og cellecyklus restaurering blev ikke hårdt ramt. Dette antyder, at cancerceller har yderligere DNA-reparation maskiner, uafhængig af SLD5, og derved opretholde proliferativ kapacitet. Silencing SLD5 i kræftceller, kan derfor ikke være effektiv som en strategi til at hæmme tumorvækst. Men ikke kun kræftceller, men også normale celletyper såsom endotelceller og fibroblaster prolifererer i tumoren mikromiljø støtte væksten af ​​tumoren som stromale cellekomponenter [38] – [40]. Blokering angiogenese har vist sig at være en effektiv strategi til inhibering af tumorvækst og metastase [41]. Derfor silencing SLD5 ekspression eller suppression af SLD5 funktion ved en lille forbindelse eller en nukleosidanalog, såsom microRNA i stromale tumorceller kan hæmme udviklingen af ​​tumormikromiljøet og kunne være en lovende fremgangsmåde til at hæmme tumorvækst svarende til den strategi inhibere tumor angiogenese.

tak

Vi takker Ms K. Fukuhara, Ms Fujimoto til teknisk bistand.