PLoS ONE: Sammenligning af Microarray Platforme til måling Differential MicroRNA Expression i parret Normal /Kræft Colon Tissues

Abstrakt

Baggrund

Microarray teknologi, der anvendes til microRNA (miRNA) profilering er et lovende redskab i mange forskningsområder; alligevel, har uafhængige undersøgelser, der kendetegner den samme patologi ofte rapporteret dårligt overlappende resultater. miRNA analysemetoder er først for nylig blevet systematisk sammenlignet men kun i få tilfælde brug af kliniske prøver.

Metode /vigtigste resultater

Vi undersøgte inter-platform reproducerbarhed af fire miRNA microarray platforme (Agilent, Exiqon , Illumina, og Miltenyi), sammenligner ni parrede tumor /normal colon væv. De mest overensstemmende og udvalgte disharmoniske miRNA blev yderligere undersøgt ved kvantitativ RT-PCR. Globalt blev en fattig overlap blandt differentielt udtrykte miRNA identificeret ved hver platform fundet. Men for otte miRNA høj aftale i differential udtryk blandt de fire platforme og sammenlignelighed til QRT-PCR blev observeret. Endvidere er de fleste af de miRNA sæt identificeret ved hver platform er sammenhængende beriget med data fra andre platforme, og langt størstedelen af ​​tyktarmskræft associeret miRNA sæt afledt fra litteraturen blev valideret i vores data, uafhængigt af platformen. Computational integration af miRNA og genekspressionsprofiler foreslog, at anti-korreleret forudsagt målgener af differentielt udtrykte miRNA er almindeligt beriget i kræftrelaterede veje og i gener involveret i glykolysen og næringsstof transport.

Konklusioner

Teknisk og analytiske udfordringer i at måle miRNA stadig og yderligere forskning er nødvendig for at øge sammenhængen mellem de forskellige microarray-baserede metoder. Men blev fundet, en bedre aftale inter-platform ved at se på miRNA sætter i stedet for enkelte miRNA og gennem en miRNA – genekspression integration tilgang

Henvisning:. Callari M, Dugo M, Musella V, Marchesi E, CHIORINO G, Grand MM, et al. (2012) Sammenligning af Microarray Platforme til måling Differential MicroRNA Expression i parret Normal /Cancer Colon Væv. PLoS ONE 7 (9): e45105. doi: 10,1371 /journal.pone.0045105

Redaktør: Yujin Hoshida, Mount Sinai School of Medicine, USA

Modtaget: 31 marts 2012; Accepteret: 14. august 2012; Udgivet: 13 september, 2012 |

Copyright: © Callari et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cariplo Foundation (2007.1215 /10,4890 MAP), Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC IG-10302 2010 til SC og AIRC 5 × 1000 n. 12162 til SC) og Sundhedsministeriet (ACC tilskud til MGD), og ved støtte fra regionen Lombardiet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mikroRNA (miRNA) er små ikke-kodende RNA-molekyler af 18-24 nukleotider lange, der er bredt bevaret i alle eukaryote organismer og fungerer som regulatorer af genekspression. miRNA er involveret i alle større cellulære processer og er impliceret i en lang række menneskelige sygdomme, herunder kræft [1] – [3].

Gennem det seneste årti, mikromatrice teknologi er blevet en stadig mere omkostningseffektiv metode der er i stand til hurtigt at generere high-throughput data, hvilket banede vejen for at genom-dækkende (GW) analyse af gen-ekspression, genomisk kopi nummer variationer, SNPs, og epigenetiske ændringer. Microarray-baserede teknikker er blevet flittigt brugt i flere områder af forskning og molekylære assays under anvendelse af mønstre af genekspression og forudbestemte matematiske algoritmer, såsom Mammaprint®) [4], der i øjeblikket er under validering af potentielle multicentrisk kliniske undersøgelser i brystkræft.

på det seneste er microarray teknologi blevet anvendt på miRNA profilering og er ved at blive en lovende teknik i mange forskningsområder, såsom translationel forskning i onkologi, og kan give nyttige oplysninger om den rolle, miRNA i både tumorigenese og progression af kræft [2]. Alligevel uafhængige undersøgelser kendetegner samme patologi har ofte dårligt overlappende resultater. Dette kan skyldes lille test, høj tumor variabilitet og heterogenitet, men også tekniske årsager. En væsentlig fordel ved den mikroarray fremgangsmåde består på high-throughput samtidig screening af op til flere tusinde molekyler i et enkelt assay, men dette kræver hybridiseringsbetingelser til at være den samme for alle prober på arrayet. Dette er ikke trivielt for miRNA microarrays fordi GC indholdet af miRNA er meget variable og mulighederne for sonde design er mere begrænsede end for mRNA på grund af deres korte længde. For en komplet gennemgang af generelle begreber og særlige udfordringer, der er relevante for miRNA profilering refererer til Pritchard et al [5]. Et væld af platforme for miRNA profilering er kommercielt tilgængelige, og hver producent har udviklet sine egne tekniske procedurer for at maksimere sensitivitet og specificitet i måling miRNA ekspressionsniveauerne. Som følge heraf forventes probesignaler til stort set variere blandt platforme, og en direkte sammenligning ikke mulig. På trods af dette, de almindelige mønstre af differentielt udtrykt (DE) miRNA sammenhængende måde bør detekteres af alle platforme. Først for nylig sammenligning af intra- og inter-platform reproducerbarhed miRNA mikroarrays er blevet analyseret i mere end tre forskellige platforme (se tabel S1 for detaljer) [6] – [11]. Tilsammen disse undersøgelser dokumenterer, at miRNA microarray platforme viser fremragende intra-platform reproducerbarhed, men begrænset inter-platform konkordans. Faktisk sammenligner miRNA identificeret som DE inden for hver platform, en betydelig variation i det totale antal samt i fold-ændring af miRNA er blevet bemærket. Tre af disse [6] undersøgelser; [8]; [9] baseret deres konklusioner på en sammenligning af væv eller puljer af væv af helt anden oprindelse. Sah et al. analyseret udtryk for syv syntetiske miRNA spiked i kendt koncentration ind i en RNA fra placenta væv og hybridiseret på fem platforme [11]. For at være tættere på en miRNA microarray ansøgning i kræftforskning, Git et al. analyseret en pulje af normale brystvæv og to brystcancercellelinier [7] og Dreher et al. sammenlignet untrasfected og HPV-transficerede humane keratinocytter [10]. Men selv om de tidligere fire sammenligninger repræsenterer et nyttigt system til at løse tekniske problemer, og de senere to undersøgelser er uden tvivl mere realistisk, at spørgsmålet om overensstemmelse mellem forskellige platforme, når der anvendes klinisk prøver, har ikke været behandlet.

i den foreliggende undersøgelse, vi sammenlignede miRNA udtryk profiler af ni kolorektal cancer og normal colon mucosa prøver fra de samme patienter ved hjælp af fire forskellige kommercielle platforme (Agilent, Exiqon, Illumina og Miltenyi). Ekspressionen af ​​de mest overensstemmende og udvalgte diskordante miRNA blandt platforme blev derefter bedømt med kvantitativ real time PCR (QRT-PCR). Endelig integrativ analyser af miRNA i forbindelse med genekspression og litteratur blev udført som et bevis på princippet om gyldigheden af ​​microarray miRNA-analyse i at få indsigt i den biologiske rolle af disse miRNA.

Resultater

Eksperimentel Setting

for at fremhæve indflydelsen af ​​prøven oprindelse og undersøgelsen design på de opnåede resultater, vi gjorde en beregningsmæssige sammenligning af udtryk data fra fire microarray studier. Vi valgte de fremkomne data om en fælles miRNA platform, dvs. Agilent, fra de to miRNA platform sammenligning undersøgelser (detaljer i tabel S1) hvis udtryk data på humane prøver er offentligt tilgængelige (GSE13860 [6] og E-mtab-96 [7] ) og fra to undersøgelser udvalgt som eksempler på eksperimentelle applikationer i et klinisk miljø, dvs. profiler associeret med tumorgenese af prostata [12] og gastrisk [13] cancer (GSE21036 og GSE28700, fig detaljer i Fig.S1 legende). Som vist i figur S1, antallet af DE miRNA og de tilhørende fold ændringer er betydeligt højere i cross-platform analyse end i profiler ser på tumorigenese. Indførelse af en ensartet og vilkårlig tærskel (| log

2 gange ændring | 1), 88,5% (GSE13860) og 25,9% (E-mtab-96) af miRNA til stede i arrays blev differentielt udtrykt i cross-platform datasæt; på den anden side, kun 6,9% (GSE21036) og 6,7% (GSE28700) af miRNA blev identificeret som DE på samme tærskel i de kliniske datasæt.

Med disse lokaler, besluttede vi at vurdere indbyrdes platforme reproducerbarhed i en klinisk indstilling ved at vurdere tumor og de normale modstykke miRNA profiler i prøver indsamlet fra ni patienter, som gennemgik kirurgisk resektion for tyktarmskræft (se tabel S2 til kliniske og patologiske egenskaber). RNA portioner fra disse prøver blev hybridiseret på fire microarray platforme: Agilent SurePrint G3 menneske miRNA Microarray Exiqon miRCURY LNA microRNA Array, Illumina Human_v2 microRNA udtryk Beadchips, og Miltenyi miRXplore Microarray. Hovedtrækkene i de fire platforme er beskrevet i tabel 1.

Det skal bemærkes, at platformen fra Illumina blev trukket tilbage siden marts 2010; Men vi besluttede at medtage det i vores forhold på grund af sin omfattende brug i laboratorier verden over, herunder i vores institut. Derfor kan de spørgsmål i den aktuelle undersøgelse være af interesse for brugere af Illumina platform til bedre fortolke deres resultater og til at muliggøre en mere rationale skifte til en anden platform.

Agilent, Exiqon, og Illumina arrays blev udført i ét-farve. Miltenyi blev hybridiseret i to farver: vævsprøver blev mærket med hY5, og en syntetisk henvisning købt af Miltenyi med Hy3. Da den syntetiske henvisning designet på miRBase 9.2 og dækkede kun en del af miRNA til stede på de arrays designet på miRBase 14,0, kun hY5 data blev behandlet og anvendt til normalisering for at muliggøre en mere direkte sammenligning med de øvrige tre platforme.

Agilent, Exiqon, og Illumina platforme indeholdt sonder enten er designet på virale miRNA-sekvenser eller på formodede miRNA endnu ikke kommenteret i miRBase, afledt af litteratur og Next-generation sequencing undersøgelser. Da disse sekvenser er kun til stede i en platform, blev de udelukket fra vores analyser.

miRBase database er den primære opbevaringssted for alle miRNA sekvenser og anmærkninger anvendes af alle producenter til udformning af proberne. Men den hyppige opdatering af miRBase resulterer i annotation problemer. For at undgå mulig bias, valgte vi arrays designet på tætte miRBase versioner, og sonderne af de fire testede platforme designet på enten v12.0 eller v14.0 miRBase. Vi kontrolleret, at navne og sekvenser af miRNA til stede i v12.0 ikke ændre sig i den nyere miRBase versionen, mens et sæt nye miRNA blev tilføjet. Forskellen i det samlede antal miRBase kommenteret miRNA i de fire platforme var relativt lille (6%).

Evaluering af data Distribution og Detection Rate

Ikke-normaliserede signalintensiteter viste en platform afhængig fordeling afspejler de unikke metoder udviklet af producenter for mærkning, hybridisering stringens og dataopsamling (fig. 1A). For alle platforme, dækket signalerne meste af det dynamiske område til rådighed for 16-bit scannere; Agilent, Exiqon, og Miltenyi signal distributioner tendens til at have en positiv skævhed (en højre side lang hale), og adskilte sig fra Illumina distributioner hvor mange flere sonder viste mellemliggende til høje ekspressionsniveauer.

(A) Global ikke-normaliseret intensitet fordeling. (B) Grafisk fremstilling af miRNA detektion; blå = opdaget, gul = uopdaget, grå = ikke til stede. (C) Box-plot af procentdelen af ​​GC-indhold i modne miRNA sekvenser; blå = opdaget, gul = uopdaget.

P

-værdier blev beregnet ved Students t-test.

For Agilent og Illumina platforme, vi fulgte afsløring opkald, som anbefales af producenterne. Illumina software giver en afsløring

P

-værdi, der anslår, i hvilket omfang et signal er større end den støj, repræsenteret ved negative kontroller; på samme måde, Agilent software giver et flag (gIsPosAndSignif), der vurderer, om funktionen signalet er positiv og signifikant sammenlignet med baggrunden. I modsætning til Exiqon og Miltenyi platforme en detektionskriterier opkald blev ikke defineret; for disse platforme, vi etableret en tærskel procentdel af pixels for hver plet i array hvis intensitet var lavere end baggrunden. Under hensyntagen til disse filtrering procedurer, 675 (78% af miRBase kommenteret miRNA på array’et), 775 (87%), 808 (94%) og 376 (41%) unikke miRNA kunne påvises i mindst én af prøverne i Agilent, Exiqon, Illumina, og Miltenyi platforme, henholdsvis (fig. 1B). Der var 233 miRNA, der blev delt af alle platforme, bliver stærkt begrænset af den lave opdagelse sats i Miltenyi platformen.

For at vurdere, i hvilket omfang GC-indhold påvirket påvisning kald af hver platform, vi beregnede GC procentdel af miRNA analyseret og sammenlignet for hver platform, indholdet GC mellem detekteret og uopdagede miRNA. Trods hver fabrikant har justeret probe design og hybridisering procedurer for at overvinde uoverensstemmelser i den termodynamiske stabilitet probe /target anerkendelse, GC-indhold var signifikant højere i opdaget end i de uopdagede miRNA i alle platforme, og denne forskel var særlig tydeligt for Miltenyi platform (fig. 1C).

Normalisering og klasse Sammenligning Resultater

Flere normalisering og databehandling procedurer er til rådighed, mest oversat af gen-ekspression undersøgelser og med lidt konsensus blandt laboratorier. I betragtning af de unikke karakteristika for hver platform, er det usandsynligt, at den samme normalisering procedure kunne udføre ligeligt i alle platforme til at korrigere systematiske forskelle.

For at vælge den bedste normalisering for hver platform, vi evaluerede evne til fire forskellige metoder (løss, fraktil, rank invariant, og Robust spline normalisering) for at reducere det intra-class variabilitet i normale og tumorprøver ved hjælp af relativ Log Expression (RLE) (se fig. S2). Desuden forventes det, at den bedste normaliseringsmetode bør øge fold ændringer og antal differentielt udtrykte miRNA mellem tumor og normalt væv. Ifølge disse kriterier, vi valgte RSN for Illumina og Agilent, løss for Exiqon og fraktil for Miltenyi.

I figur S3 tumoren /normale klasse sammenligninger i de 4 platforme, udtrykt som histogrammer af log

P

-værdi og FDR, rapporteres. Sammenligningen er identificeret ved en tærskel

P

0,005, 29 miRNA, der blev moduleret på Agilent, 4 på Exiqon, 42 om Illumina, og 3 på Miltenyi-platformen, svarende til 4,3%, 0,5%, 5,2 %, og 0,8% af miRNA opdaget henholdsvis.

Inter-platform aftale af klasse Sammenligning Resultater

for at vurdere inter-platform konkordans, vi undersøgte miRNA, der var dE på

P

0,005 i mindst én platform; ved at kombinere disse miRNA blev en konsensus liste over 68 miRNA genereret. For at fremhæve konkordans blandt de fire platforme,

P

-værdier og fold-ændringer af konsensus liste miRNA er vist i en farvemaalingsskala i figur 2A og B henholdsvis. Indførelse af en

P

0,005 på alle fire platforme, ingen miRNA var almindeligt DE. På

P

0,05, HSA-miR-378, HSA-miR-375, HSA-miR21 *, HSA-miR-145 blev påvist som DE af alle platforme og yderligere 4 miRNA (HSA-miR -96, HSA-miR21, HSA-miR147b, og HSA-miR-143) var DE på alle, men en platform; i virkeligheden, på Miltenyi platform, HSA-MIR-96 og HSA-MIR-147B blev ikke påvist, mens HSA-MIR-21 og HSA-MIR-143 ikke nåede en signifikant tærskel. Tolv, 2, og 25 miRNA viste sig at være udelukkende DE på Agilent, Exiqon, og Illumina platforme hhv. De resterende 29 miRNA var DE i mindst to platforme. De fold ændringer er overensstemmende på tværs af platforme med den eneste undtagelse af to miRNA (HSA-miR-218 og HSA-miR-302a), der var DE på

P

0,05 i Illumina og Exiqon, men med uharmonisk fold -changes (fig 2B.)

(a)

P

-værdier af tumoren /normal klasse sammenligning visualiseret i en blå-hvid zonekort.; se skala i figuren. (B) Log

2 fold ændringer i tumor /normal klasse sammenligning visualiseret i en rød-grøn varme map; rød = opreguleret; grøn = nedreguleret i tumorer.

For at verificere, at det begrænsede antal almindeligt DE miRNAer var ikke et resultat af normalisering metoder, vi beregnet antallet af differentielt udtrykte miRNA i hver platform og for hver af de fire normaliseringsreferencerne metoder. For 256 (= 4

4) mulige kombinationer, vi identificeret en liste over fælles DE miRNA. Foreningen af ​​alle disse lister ufarligt fire miRNA (HSA-MIR-378, HSA-MIR-375, HSA-MIR-145, HSA-MIR-21 *), hvilket antyder, at forskellige normaliserings- metoder kan være værre end eller i bedste fald svarende til vores valg (fig. S4A). Bemærkelsesværdige blandt de 4 fælles miRNA HSA-miR-378 blev identificeret i alle de mulige kombinationer (fig. S4b).

Den overordnede platform sammenlignelighed med hensyn til nøjagtighed og evne til at identificere DE miRNA blev evalueret med fokus henholdsvis på fold ændringer og t-værdier opnået i tumoren /normal sammenligning for de 233 miRNA almindeligt opdaget af de 4 platforme. Efter clustering analyse, den bedste korrelation mellem log blev observeret

2 fold ændringer mellem Agilent og Exiqon (Pearsons korrelation = 0,63), mens Illumina viste det mest andet mønster og bredere fold ændringer (Fig. 3A og fig. S5A). På samme måde, kun en delvis lighed i t-værdier (Pearsons korrelation; område = 0,28 til 0,48; gennemsnit = 0,40) er til stede blandt de 4 platforme, men denne gang Miltenyi viste den mest afvigende adfærd (figur 3B og fig.. S5B)

Hierarkisk klyngedannelse (afstand = Pearson korrelation;. kobling = gennemsnit) af log2 fold ændringer (A) og t-værdier (B) opnået for hver platform ved at sammenligne tumor og normale prøver i undergruppen af ​​almindeligt fundne miRNA. t-værdier blev beregnet ved hjælp af en t-test med tilfældige varians model.

Inter-platform Aftale hjælp miRNA Indstiller

Tidligere studier, der sammenligner ydeevnen af ​​genekspression microarray platforme foreslog, at, på trods af en relativt lav overlapning blandt lister over DE-gener blev opnået med forskellige platforme, der blev fundet en god overensstemmelse, når man ser på biologisk beslægtede gensæt stedet for enkelte gener [14]. For at teste, om lignende konklusioner kan drages for miRNA microarray platforme, vi udførte en miRNA sæt berigelse analyse på vores test-data to serier af miRNA sætter: 1) DE miRNA identificeret ved hver platform i vores undersøgelse, at vurdere deres berigelse blandt op eller nedreguleret miRNA på de andre platforme; 2) miRNA identificeret som op- eller ned- reguleres mellem tyktarmskræft og normal slimhinde i andre microarray baserede undersøgelser fra litteraturen (Tabel S3). De fleste af de miRNA sæt identificeret ved hver platform er sammenhængende beriget med data fra andre platforme, med Miltenyi miRNA sæt viser de nederste berigelser (Fig. 4A). Desuden blev det store flertal af tyktarmskræft associeret miRNA sæt afledt fra litteraturen også valideret i vores data, i det mindste delvist uafhængigt af den testede platform (fig. 4B).

Sammendrag af miRNA sæt berigelse analyse udført under anvendelse GSEA. Anvende udtrykket data opnået med de 4 forskellige platforme, testede vi berigelsen af ​​miRNA DE (ved sammenligning kolorektal cancer og normal slimhinde) i vores undersøgelse (A) eller rapporteret i litteraturen (B). miRNA op- eller ned-regulerede blev testet hver for sig. For litteratur-afledte miRNA-apparater, firs forfatter og platformen anvendte var angivet (se også tabel S3). Falske Discovery Priser mindre end 5% eller 10% blev anset for væsentlig eller marginalt signifikant henholdsvis.

Sammenligning med QRT-PCR data

mikroarraydata regelmæssigt valideres af QRT-PCR. Forskellige systemer er kommercielt tilgængelige og som påpeget for microarray platforme, QRT-PCR producenter har også at beskæftige sig med den løbende opdatering af miRBase anmærkninger. Som en validering metode, afhængigt af tilgængeligheden af ​​udvalgte miRNA analyser på det tidspunkt blev udført forsøgene blev SYBR Green LNA analyser fra Exiqon eller Applied Biosystem Taqman analyser anvendes.

Vi fokuserede vores validering analyse på 18 miRNA som sammenfatte forskellige situationer, der findes i platformen sammenligning (tabel 2). Den 8 DE miRNA i mindst 3 af 4 array-platforme blev valideret som signifikant DE ved QRT-PCR. For disse 8 miRNA, blev høje korrelationer mellem QRT-PCR og array-udtryk værdier, og i parvise kontraster array-data observeret (tabel 3 og File S1) med to undtagelser; i tilfælde af HSA-MIR-21 *, selvom QRT-PCR data bekræfter den differentielle ekspression findes i alle array-platforme, blev dets korrelation med array-data begrænset (R koefficient sortiment 0,27-0,44); for HSA-miR-21, har værdierne på Illumina ikke korrelerer med andre værdier opnået på arrays eller ved QRT-PCR. Sidstnævnte uoverensstemmelse sandsynligvis henføres til miR-21 udtryk værdier på Illumina, der er tæt på mætning i alle prøver, og af denne grund, koncentreret i et begrænset område.

For bedre at forstå grundlaget for den fattige overlap af klasse sammenligning resultater i de fire platforme, målt vi udtryk for 10 yderligere miRNA (tabel 3 og File S1).

Seks af dem (HSA-miR-136, HSA-mir -139-5p, HSA-miR-182, HSA-miR-30a, HSA-miR-497, og HSA-miR-93) blev udvalgt blandt de 14 dE miRNA (

P

0,05) i henhold til både Agilent og Illumina. Vi valideret array data ved QRT-PCR for 5 af disse 6 miRNA, med den relevante undtagelse af HSA-miR-93. Korrelationskoefficienter mellem QRT-PCR og enten Agilent eller Illumina data varierede fra 0,65 til 0,87 for HSA-MIR-136, HSA-MIR-139-5p, HSA-MIR-30a, og HSA-MIR-497; for HSA-miR-182, hvis sonde intensiteter på Illumina var ved mellemliggende niveauer og DE på

P

0,005 og Agilent var tæt på baggrunden og DE på

P

0,05 , var 0,86 og 0,48, henholdsvis.

To andre miRNA, HSA-miR-886-5p og HSA-miR-886-3p, udvalgt til QRT-PCR validering var samstemmende i to af de fire platforme. Den differentielle ekspression af HSA-MIR-886-5p, DE på Illumina og Miltenyi platforme, blev bekræftet ved RT-qPCR, mens, som af HSA-MIR-886-3p, DE på Miltenyi og Agilent platforme, synes ikke at være DE ved QRT-PCR.

Endelig valgte vi to miRNA (HSA-miR-218 og HSA-miR-302a), der var DE på Exiqon og Illumina platforme, men med modsatte fold ændringer. HSA-MIR-218 reducerede ekspression i tumorer på Illumina blev bekræftet ved QRT-PCR mens den for HSA-MIR-302a blev ikke valideret ved anvendelse QRT-PCR.

Real time PCR data anvendes generelt til at bestemme følsomheden og specificitet af data opnået med mikroarrays. Til dette formål har vi sammenlignet vores resultater til dem, der opnås i et selvstændigt publiceret QRT-PCR undersøgelse, hvor 70 af 665 testede unikke miRNA blev fundet differentielt udtrykte i 40 parrede normal-kolon kræft prøver [15]. For hver platform udvalgte vi miRNA stede i qPCR datasæt (527 for Agilent, 596 for Illumina, 545 for Exiqon og 278 for Miltenyi) og beregnet ROC kurver ved hjælp af forskellige tærskler for

P

-værdi. (Fig. 5). Værdierne af arealet under ROC kurven (AUC) viste, at Agilent og Illumina er meget ens og er de mest præcise platforme mens Miltenyi er mindre effektiv.

I betragtning som guldstandard de miRNA identificeret som udtrykkes forskelligt i en qPCR undersøgelse af 40 parrede tumor-normal prøver, vurderet vi effektiviteten af ​​hver platform beregning sensitivitet og specificitet ved forskellige tærskler for

P

-værdi og plotte de resulterende værdier i ROC rummet.

Biologisk Insight

Når 68 miRNA dE på

P

0,005 i mindst én af de fire platforme blev sammenlignet med data fra litteraturen, fandt vi, at 25% af dem var samstemmende beskrevet i litteraturen som dereguleret i colorektal cancer i sammenligning med den ikke tumor modpart (tabel S4). Endvidere fandt vi, at 12 miRNA tilhører kendte co-udtrykkes familie klynger. De vigtigste biologiske data tilknyttet til de fire miRNA klynger er rapporteret i tabel 4. Ser man på deres udtryk, vi observeret, at: for miR 25-106b klynge, kun HSA-miR-25 og HSA-miR-93 er til stede på listen over 68 miRNA på de tærskler, vi anvendte; Den miR 182-96 klynge er særlig tydeligt i Illumina hvor HSA-miR-182, -182 *, -183, og -96 er blandt de mest up-regulerede miRNA i denne platform (fold ændringer tumor vs normal spænder fra 4,42 til 2,65 ); miRNA klynge 143-145 er sammenhængende dereguleret i alle fire platforme af vores undersøgelse, at være HSA-miR-143 mest nedreguleret miRNA i tumorvæv på Exiqon platform (fold ændring tumor vs normal tumor = 0,30; p = 0,036) og HSA-miR-145 mest nedreguleret i Agilent og Miltenyi (fold ændring tumor vs normal = 0,30 og 0,35; p = 0,0027 og 0,018 henholdsvis).

Gene udtryk profiler af de samme prøver analyseret af miRNA udtryk arrays var til rådighed. Således betragtet vi en integration tilgang til at vurdere, om lignende biologisk oplysninger kunne hentes fra de fire platforme, uanset overlapningen i DE miRNA. Til dette formål ved hjælp af MAGIA værktøj, negativt korreleret putative målgener af DE miRNA blev identificeret i hver platform (File S2) og en berigelse analyse blev udført ved IPA software. For at understrege overensstemmelsen mellem de fire platforme, berigelse

P

-værdier for alle kræftrelaterede veje betydeligt beriget med mindst én platform er vist i en farvemaalingsskala i figur 6A. Veje relateret til cellecyklus regulering og PTEN signalering blev samstemmende identificeret. Når vi kiggede på validerede targets ved TarBase software, antallet af miRNA-mRNA interaktioner negativt korreleret ved p 0,05 var meget begrænset (Agilent = 35, Exiqon = 2, Illumina = 45 og Miltenyi = 0) til hinder for en sammenligning på tværs af de fire platforme .

(A) Pathway berigelse analyse af anti-korreleret forudsagt målgener af differentielt udtrykte miRNA henhold til hver microarray platform. (B) Netværk mellem de øverste 8 differentielt udtrykte miRNA og deres anti-korrelerede målgener. De 250 bedste interaktioner blev anvendt til at generere netværket ved hjælp MAGIA værktøj.

Endvidere ved at betragte QRT-PCR data for de 8 mest samstemmende miRNA og genekspressionsprofilerne, der er konstateret, den samme integration tilgang en alt 803 miRNA-negativt korreleret gen (forudsagt som miRNA mål) interaktioner (File S2). Den grafiske repræsentation af de øverste 250 vekselvirkninger fremhævet, at mange gener, der blev opreguleret i tumorer forudsiges mål af to eller flere nedreguleres miRNA (fig. 6B). I detaljer, der er 70 gener co-målrettet med mindst to miRNA og 84% af dem er reguleret af miR 143-145 klynge (tabel S5). Blandt disse gener dem, der vedrører glycolyse og transport af næringsstoffer veje syntes overrepræsenteret.

Diskussion

På trods af deres relativt nylige opdagelse, der er en hastigt voksende interesse i studiet af den rolle, miRNA i mange patologiske processer, herunder kræft. Følgelig blev højt gennemløb teknologier, oprindeligt udviklet til GW genekspression evaluering, hurtigt tilpasset GW måling af miRNA. Men som fremhævet i seneste anmeldelser [5]; [16]; [17], flere faktorer, herunder korte miRNA længde, høj grad af homologi i miRNA familier, den høje nye miRNA identifikation (det faktiske antal miRNA i miRBase 18, udgivet i november 2011 nærmer to tusinde), og den relativt høje procent (ca. 10%) af kulturgenstandsspor miRNA ikke bekræftet af resekventering eksperimenter, væsentligt komplicere deres analyse. Virkningen af ​​disse faktorer på de forskellige metoder, der anvendes af producenter af forskellige tilgængelige platforme skal ses i inter-platform sammenligning studier.

Spørgsmålet om intra- og inter- microarray platform reproducerbarhed har hovedsagelig været rettet ved hjælp af eksperimentelle indstillinger hvor væv eller cellelinjer af forskellig oprindelse sammenlignes, med den antagelse, at på grund af den brede vifte af forventede udtryk modulationer ved en sådan sammenligning, kan teknisk støj blive ubetydelig. Denne type tilgang afspejlede ene fulgte i sin første fase undersøgelse fra Microarray Quality Control (MAQC) konsortium, der sigter på at vurdere den inter-platform og inter-reproducerbarhed af gen-ekspression microarray data ved hjælp af to forskellige RNA (menneskelige hjerne og en universel menneskelig reference) [18]. Denne tilgang blev kraftigt spørgsmålstegn i 2007 for sin manglende sammenhæng med indstillinger reelle forskning [19]. Men i de fleste af miRNA inter-platform sammenligning undersøgelser, citeret i Aldridge Hadfield [16] og rapporteret i tabel S1, den eksperimentelle design var forudindtaget mod brugen af ​​prøver med stærk forskel i oprindelse. Bemærkelsesværdige, kun to undersøgelser [7]; [10] sammenlignede miRNA profilen af ​​biologiske meningsfulde prøver på mindst tre forskellige platforme, men selv i disse tilfælde prøverne er cellelinjer. Således er vores studie er det første forsøg på at sammenligne miRNA platform præstation i et klinisk miljø, hvor inter-prøve variation inden for samme klasse forventes at være højere end i cellelinjer.

De fleste af profilering undersøgelser ved hjælp kliniske prøver til formål at afsløre selv små forskelle i ekspression, men som er knyttet til en specifik klinisk sammenhæng. I disse indstillinger, tekniske gentagelser ofte ikke muligt på grund af RNA mængde og økonomiske overvejelser. I den foreliggende undersøgelse har vi fat på spørgsmålet om inter-platform sammenligning anvendelse af prøver, der tilhører to klasser (parret tumor og normale colon væv) som teoretisk kunne føre til ny indsigt i tumor biologi og kliniske anvendelser. [25]. [27]. RNA blev ekstraheret under anvendelse af miRNeasy Mini kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev 800 ng af total RNA revers transkriberet, mærket med biotin og amplificeret natten over (14 timer) under anvendelse af Illumina RNA TotalPrep Amplification kit (Ambion, Austin, Texas, USA) i overensstemmelse med producentens protokol.