PLoS ONE: Cirkulerende tumorceller beriget af Udtømmelse af leukocytter med Bi-antistoffer i ikke-småcellet lungekræft: Potentiel Clinical Application

Abstrakt

Baggrund

Det er blevet overvejet, at metoder til påvisning af cirkulerende tumorceller (CTCs) baseret på epitel celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) undervurderer antallet af CTCs og kan gå glip af en metastatisk subpopulation med kræft stamceller (CSC) egenskaber. Derfor undersøgte vi EpCAM-positive og -negative CTCs i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter på forskellige stadier, vurderede den kliniske værdi af disse CTCs og udforskede deres kapacitet i den følgende CSC-modellen.

Metoder

CTCs blev beriget ved udtømning af leukocytter med bi-antistoffer under anvendelse af en magnetisk perle adskillelsesteknik og derefter identificeret ved ekspressionen af ​​EpCAM og cytokeratin 7 og 8 under anvendelse af multi-parameter flowcytometri. Vi bestemt fordelingen af ​​CTCs klassificeret af ekspressionen af ​​EpCAM i 46 NSCLC patienter med trin I-IV, vurderede den diagnostiske værdi af disse CTCs ved langsgående overvågning i 4 indeks patienter under adjuverende behandling og karakteriserede stemness af disse CTCs ved ekspression af CXCR4 og CD133 10 patienter.

Resultater

EpCAM-negative (E-) CTCs blev påvist at være væsentligt højere end EpCAM-positive (E +) CTCs i stadie IV (

s

= 0,003). Patienterne med procentdelen af ​​E-CTCs mere end 95% (

r

95%) blev påvist at være steget markant fra 13,3% i fase I-II til 61,1% i stadie IV (

p

= 0,006). Kaplan-Meier analyse viste, at patienter med

r

95% havde signifikant kortere overlevelsestid end dem med

r

≤ 0,95 (

s

= 0,041). Langsgående overvågning af CTCs viste, at de patienter med en høj procentdel af E-CTCs i blodet ikke var reagerer på enten kemoterapi eller målrettet terapi. Yderligere karakterisering af CTCs afslørede, at en stilk-lignende underpopulation af CXCR4 + CD133 + CTCs blev påvist at være væsentligt mere udbredt i E-CTCs end i E + CTCs (

s

= 0,005).

konklusioner

berigelse af CTCs ved udtømning af leukocytter med bi-antistoffer er en værdifuld metode til estimering af antallet af CTCs, som kan potentielt anvendes til at forudsige prognosen, overvågning den terapeutiske virkning af NSCLC-patienter og yderligere analysere biologi CTCs

Henvisning:. Yin J, Wang Y, Yin H, Chen W, Jin G, Ma H, et al. (2015) cirkulerende tumorceller beriget af Udtømmelse af leukocytter med Bi-antistoffer i ikke-småcellet lungekræft: Potentiale Clinical Application. PLoS ONE 10 (8): e0137076. doi: 10,1371 /journal.pone.0137076

Redaktør: Huei-Wen Chen, Graduate Institute of Toxicology, TAIWAN

Modtaget: Januar 24, 2015; Accepteret: August 12, 2015; Udgivet: 28 August, 2015

Copyright: © 2015 Yin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde er støttet af Jiangsu Natural Science Foundation (BK20141435); Indførelse af Talent Foundation (2011RC11); Medicinsk Videnskab og Teknologi Development Foundation, Nanjing Department of Health (YKK13088); Nøglen Program for National Natural Science Foundation of China (81230067); National Key Basic Research Program Grant (2013CB911400)

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft. -relaterede dødsfald [1], og ca. 85% af lungekræft tilfælde er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Selvom systematisk behandling er blevet forbedret, er den samlede 5-års overlevelse er kun 10-20% [2]. Den primære årsag til den lave overlevelse er fjernmetastaser af tumorceller. I metastatiske kaskade, har cirkulerende tumorceller (CTCs) blevet anset for at være centrale deltagere i dannelsen af ​​fjernmetastaser [3]. En tidligere undersøgelse viste, at CTCs udtrykker epitelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) er påviselige i trin IV NSCLC-patienter og er en hidtil ukendt prognostisk faktor for denne sygdom [4]. Det er imidlertid blevet foreslået, at de metoder baseret på ekspressionen af ​​EpCAM undervurdere antallet af CTCs og kan gå glip af en metastatisk subpopulation af CTCs med cancer stamcelle (CSC) egenskaber [5, 6]. En nylig undersøgelse rapporterede, at der påvises CTCs 2 gange mere effektivt af ISET (isolering ved størrelsen af ​​epiteliale tumorceller) end ved CellSearch, og at en subpopulation af CTCs, som ikke udtrykte EpCAM (dvs. E-CTCs), kan være detekteres i blodet hos NSCLC-patienter [7]. En anden undersøgelse har også vist, at opregningen af ​​disse celler er meget højere end for CTCs fanget af CellSearch [8]. Indtil nu har den kliniske værdi og biologi af disse E-CTCs været uklar, og en nylig publikation har indikeret, at fremtidige undersøgelser bør omfatte påvisning af E-CTCs [9].

CTCs undergår epitel-mesenkymale overgang (EMT) er blevet anset for at spille en vigtig rolle i dannelsen af ​​neoplasmer [5]. EMT kan generere celler med stamcelle egenskaber [10]. Under EMT, ekspressionen af ​​EpCAM i tumorceller vil blive nedreguleret. En tidligere undersøgelse rapporterede, at SDF-1 /CXCR4 akse spiller en vigtig rolle ved mediering af cellevandring og overlevelse efter et TGF-β-induceret EMT [11]. Men det er uklart, hvorvidt disse (eller nogen) CTCs med nedreguleret EpCAM har en øget metastatisk udsæd potentielle eller forhøjet resistens over for systemisk behandling, og, som det for nylig indiceret, en større prognostisk værdi [12]. Vores tidligere undersøgelse viste, at CXCR4-udtrykkende CTCs blev påvist i blodet hos patienter med solide tumorer [13]. En nylig undersøgelse rapporterede, at opregulering af CXCR4 er funktionelt afgørende for opretholdelsen af ​​stemness i lægemiddelresistente NSCLC celler [14]. Derfor er det nødvendigt at karakterisere stemness af E-CTCs.

CTCs er sjældne i blodet af tumor patienter, og undersøgelser om biologi CTCs er begrænset af den lave koncentration og udbytte af CTCs [9] . Skønt tidligere undersøgelser har vist, at ISET teknik er mere effektiv til fastholdelse af e-CTCs i NSCLC [7, 8], en nylig undersøgelse rapporterede, at lunge tumorer vokser hurtigere og kaste et betydeligt antal letale metastatiske celler i små størrelser [15]. Derfor er en “neutral” isolation metode til CTCs er ønskelig. Vi har tidligere etableret en negativ berigelse af CTCs [16], som er baseret på nedbrydning af leukocytter ved hjælp af en magnetisk perle adskillelsesteknik og efterfølgende påvisning af flere parametre af flowcytometri. I den foreliggende undersøgelse, vi forbedret denne teknik ved at nedbryde leukocytter med bi-antistoffer for at forbedre renheden af ​​CTCs for deres karakterisering og fremtidig anvendelse i molekylær analyse. Ved denne metode, vi bestemt fordelingen af ​​CTCs klassificeret af ekspressionen af ​​EpCAM i 46 NSCLC patienter med etaper fra I-IV, undersøgte deres diagnostiske værdi i systematisk behandling af langsgående overvågning af disse CTCs i 4 indeks patienter vurderede prognostiske værdi af disse CTCs og karakteriserede stemness af disse CTCs ved at måle ekspressionen af ​​CXCR4 og CD133.

Materialer og metoder

Etik Statement

skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter og raske frivillige før deltagelse i undersøgelsen. Blodprøve indsamling og analyser blev godkendt af den institutionelle gennemgang bestyrelse Nanjing Medical University. Design og udførelse af den aktuelle undersøgelse, der involverer mennesker var klart beskrevet i en forsøgsprotokol.

Undersøgelse befolkning og udarbejdelse af blodprøver

Perifere blodprøver fra 46 NSCLC patienter blev indsamlet fra januar til november 2013 i Nanjing Chest Hospital og Jiangsu Cancer hospital. Patienternes egenskaber er anført i tabel 1. Blod blev udtaget efter kassering de første 2 ml for at undgå potentiel forurening hudcelle fra venepunktur, og derefter bearbejdet inden for 4 timer efter indsamling. Blodprøverne fra 4 indeks patienter blev også indsamlet i slutningen af ​​hver periode af kemoterapi eller målrettet terapi straks, og de terapeutiske virkninger af patienter blev vurderet i henhold til respons evalueringskriterier i solide tumorer.

CTC berigelse

-løsninger fra blodprøver blev fremstillet som tidligere beskrevet [16]. CTCs blev derefter beriget af udtømning af leukocytter med bi-antistoffer i henhold til de følgende trin: først, baseret på leukocyt fælles antigen CD45, humant fuldblod CD45 Depletion Kit (EasySep, stamceller Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada) blev anvendt som det første skridt for leukocytdepletering; dels baseret på leukocyt overfladeantigen CD53, celler blev farvet ved PE muse-anti-humant CD53-antistof (BD Bioscience, USA), vasket med PBS og derefter yderligere depleteret med PE positiv selektion Kit (EasySep, stamceller Technologies, Inc., Vancouver , BC, Canada) som det andet trin til leukocytterne. Proceduren blev udført efter producentens anvisninger med mindre modifikationer.

Flowcytometri

Efter berigelse, CTCs blev fordelt ligeligt i 2 rør og farvet med humane anti-EpCAM, anti-CK7 /8 , anti-CD45 (BD Bioscience, USA) i det første rør og tilsvarende isotypekontrolantistoffer i det andet rør. At undersøge biologi CTCs i stemness blev de berigede celler sammen farvet med humant anti-CXCR4 (BD Bioscience, USA) og anti-CD133 (Miltenyi Biotec GmbH, Tyskland) (i det første rør), og de tilsvarende isotypekontrolantistoffer ( i det andet rør) i 10 prøver. Slutkoncentrationen af ​​hvert antistof var 10 ug /ml. En FACS AriaIII systemet (BD Biosciences) blev udført for at bestemme ekspressionen af ​​alle markører, og data blev analyseret under anvendelse FlowJo 7.2.5 software (Tree Star, Ashland, OR, USA). Celler med ekspression af de ovennævnte markører blev gated med den tilsvarende isotypekontrol baseret på udtalt opdeling mellem dem. CTCs blev defineret som Cytokeratin + CD45-CD53- celler.

Spiking eksperiment

Den menneskelige lungecancer cellelinie PC9 (høj ekspression af EpCAM og Cytokeratin) blev indskudt af Cancer Center i Nanjing Medical University og dyrket i højglucose DMEM medium indeholdende 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære. PC9 celler blev høstet efter samme procedure som tidligere beskrevet [16]. Nul, 10, 50, 100 og 500 PC9 celler blev tilsat til 2 ml blod fra raske frivillige. PC9 celler blev derefter beriget ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåde. Efter tilsætning, blev CTCs opdelt ligeligt i 2 rør og farvet med humant anti-EpCAM, anti-CK7 /8, anti-CD45 og de tilsvarende isotypekontrolantistoffer. I flowcytometrisk analyse, procentdelen af ​​CTCs i alle forblev celler (herunder leukocytter og CTCs) efter berigelse blev defineret som renheden af ​​CTCs. Inddrivelse og renhed blev beregnet til at evaluere resultaterne af den metode, der blev bestemt som følger: Recovery = n

1 /n

2 × 100%, renhed = n

1 /(n

1 + n

3) × 100% (n

1 var antallet af PC9 celler fundet efter berigelse, n

2 blev antallet af PC9 celler tilsat til 2 ml blod, n

3 var antallet af leukocytter fundet efter berigelse). Den spiking eksperiment i hver tilstand blev gentaget tre gange

For at kontrollere vores CTC-platform er stadig brugbar, blev PC9 cellelinje med lav ekspression af EpCAM opnået i overensstemmelse med følgende trin:. Celler blev podet ved en tæthed på 5 × 10

5 celler i fire 6cm-retter og inkuberet i 5% CO

2, 95% luft ved 37 ° C, indtil dens massefylde nåede 80%. Dyrkede celler blev opretholdt i serumfrit DMEM (0,1% BSA, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 atmosfære natten over, og derefter stimuleret ved 5 ng /ml rhTGF-β1 (PeproTech, USA) i det samme medium i 3 dage. De standardtilsætningsforsøg blev fortsatte anvendelse af denne type PC9 celler (opkaldt PC9-EMT) i henhold til den samme procedure som beskrevet ovenfor.

Cutoff værdien

baseline af E + og E-CTCs blev bestemt ved deres opregningen i blodprøverne fra 11 raske frivillige. Cutoff værdierne for E + og E-CTCs blev beregnet ved den øvre grænse af middelværdien af ​​CTCs plus standardafvigelse (SD). Hvis de to typer CTCs var begge under cutoff værdier, denne patient ville blive defineret som at have uopdagede CTCs og ville blive udelukket fra statistisk analyse. Hvis der kun én type CTC var under cutoff værdi, ville denne type CTC behandles som 0 for nemheds skyld i statistisk analyse. Procentdelen af ​​E-CTCs blev beregnet i overensstemmelse med det samlede antal E + og E-CTCs. Hvis andelen af ​​E-CTCs var højere end 95% (

r

95%)., Vil denne patient anses for at have absolut flertal af E-CTCs i blodet

Statistisk analyse

Dataanalyse blev udført med Stata statistiske pakker (Stata Corporation, College station, TX, USA). Mann-Whitney og χ

2 tests blev anvendt til at sammenligne de to grupper. Cox proportionel risiko model blev udført ved hjælp af SPSS (Statistisk pakke for Social Sciences) v. 16.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) for at vurdere sammenhængen mellem overlevelsestid for patienter og procentdelen af ​​CTCs.

P

værdier 0,05 blev anset for at præsentere væsentlige forskelle.

Resultater

Evaluering af CTC berigelse metode

Efter stimulering af TGF-β i 3 dage, udtryk for EpCAM i PC9 celler faldt fra 97,7% til 51,7%. Ved hjælp af vores metode i standardtilsætningsforsøg, middelværdien af ​​opsvinget /renhed PC9 og PC9-EMT celler 80,7% /9,5% og 74,3% /9,5%, hhv. Kalibreringskurven er vist i Fig 1. Der er en lineær sammenhæng med hældningen på 0,678 (0,782) mellem logaritmerne PC9 celler (PC9-EMT celler) fundet og PC9 celler (PC9-EMT celler) tilsættes.

Kalibreringskurver i standardtilsætningsforsøg anvendelse af (A) PC9 cellelinje og (B) PC9-EMT celler; (C) FACS-analyse for ekspression af EpCAM i PC9 og PC9-EMT celler stimuleret af 5 ng /mL TGF-β i 3 dage.

De cutoff værdierne for E + og E-CTCs blev bestemt i 11 blodprøver fra raske frivillige. E + CTCs blev detekteret i kun én prøve, og blev påvist E-CTCs i 8 prøver. Middelværdien af ​​CTCs + SD var 0,09 + 0,30 og 1,18 + 0,98 /ml blod for E + og E-CTCs hhv. Derfor nul og 2 blev defineret som cutoff værdier for E + og E-CTCs henholdsvis.

I 46 blodprøver blev CTCs opdaget i fem prøver (1 i fase II og 4 i stadie IV) på grund af både E + og E-CTCs under de tilsvarende cutoff værdier. I 41 blodprøver med fundne CTCs, Middelværdien [interval] af renheden af ​​CTCs var 10,6% [0,1% -51,1%]. Af disse prøver, 36,6% (15 af 41) havde en renhed på CTCs løbet 10,0%. Den maksimale renhed af CTCs var 51,1%. Repræsentative resultater af FACS-analyse er tilvejebragt i S1 Fig.

Fordeling af CTCs i patienter

detektionsrater af E + og E-CTCs er vist i fig 2A. E + CTCs blev påvist i 13 af 16 (81,3%) fase I-II, 6 af 8 (75,0%) fase III og 8 af 22 (36,4%) stadie IV patienter. E-CTCs blev påvist i 13 af 16 (81,3%) fase I-II, 8 af 8 (100%) fase III og 18 i 22 (81,8%) stadie IV patienter. E + CTCs blev bestemt til at være betydeligt lavere i stadie IV patienter end i fase I-II patienter (

s

= 0,007). E + CTCs og E-CTCs blev påvist at være væsentligt anderledes i fase IV patienter (

s

= 0,003). Desuden 2 af 15 (13,3%) fase I-II, 3 af 8 (37,5%) fase III og 11 af 18 (61,1%) fase blev opdaget IV patienter til at have et absolut flertal af E-CTCs i blodet (

r

95%). Hyppigheden af ​​patienter med

r

95% blev fundet at være signifikant højere i stadie IV end i fase I-II patienter (

s

= 0,006, Fig 2B).

(A) Fordeling af afsløring satser E + og E-CTCs patienter på forskellige stadier; (B) Procentdel af opdagede patienter med en procentdel af E-CTCs højere end 95% (

r

95%); (C) Fordeling af antallet af E + og E-CTCs hos patienter på forskellige stadier; (D) Fordeling af Andel af E-CTCs i forskellige stadier. (+ /+, Cytokeratin + EpCAM +; +/-, Cytokeratin + EpCAM-).

Ifølge cutoffværdier påvistes CTCs i 41 patienter og fordelingen af ​​antallet af E + og E -CTCs er vist i fig 2C. De medianværdier [Interquartile Range, IR] /ml blod af E + og E-CTCs var 6,0 [2,5-12,0] og 18. [11,0-47,5] i trin I-II patienter, 11.0 [3.25-16.0] og 31,5 [22,5 -31,5] i fase III og 6,5 [2,25-49,25] og 15,5 [5,75-35,75] i trin IV patienter. Der var en signifikant forskel i antallet af E + og E-CTCs i både trin I-II og III (

s

= 0,001 for begge), men ikke i fase IV, fordi antallet af E + CTCs blev forøget hos adskillige patienter. Fordelingen af ​​procentdelen af ​​E-CTCs er vist i fig 2D. De medianværdier [IR] i procentdelen af ​​E-CTCs var 83,0% [50,0% -91,0%] i fase I-II, 90,0% [72,8% -99,0%] i fase III og 100,0% [60,5% -100,0% ] i trin IV patienter. Selv om en høj procentdel af E-CTCs blev fundet i alle faser, der var ikke en signifikant forskel.

Longitudinal overvågning af CTCs i adjuverende behandling

E + og E-CTCs blev dynamisk overvåget i 4 indeks patienter, og resultaterne er vist i figur 3. Patient 1 (fig 3A og S2 fig), der havde progressiv sygdom efter indledende behandling med Gefitinib viste sygdommen fra delvis til fuldstændig remission i behandlingen med ALIMTA (pemetrexeddisodium) + cisplatin . Antallet af E + CTCs faldt 4-0 /ml blod, men antallet af E-CTCs steget fra 15 til 44 /ml blod i den første periode og faldt til nær 0 /mL blod i de sidste tre perioder. Procentdelen af ​​E-CTCs var 79% i begyndelsen, steg en smule til 100% i den første periode, faldt til 50% og fastholdes på dette niveau i de følgende to perioder, men blev opdaget i den sidste periode.

(A) Gefitinib og derefter ALIMTA + cisplatin behandling; (B) Paclitaxel liposom + cisplatin og derefter strålebehandling + erlotinib behandling; (C) ALIMTA + carboplatin og derefter erlotinib behandling; (D) Erlotinib behandling. Hver periode af behandlingen var en måned.

Patient 2 (fig 3B og S3 Fig), der havde progressiv sygdom efter indledende behandling med paclitaxel liposom + cisplatin, viste stabil sygdom i den første periode, men havde progressiv sygdom i den anden periode på grund af en hjerne metastase. Efter behandling med strålebehandling + erlotinib, viste denne patient delvis eftergivelse af sygdom. Antallet af e-CTCs faldt 34-3 /ml blod i den første periode, steg til 13 /ml blod i den anden periode, og derefter faldt til 3 /ml blod i den sidste periode, mens antallet af E + CTCs viste ufølsom ændring fra 0, 0, 2 til 1 /ml blod under terapien. Procentdelen af ​​E-CTCs blev fastholdt på det høje niveau (100%) i den første periode, og derefter faldt til 87% og 75% i de sidste to perioder.

Patient 3 (fig 3C og S4 Fig ), der havde progressiv sygdom efter første behandling med ALIMTA + carboplatin viste partiel remission i den første periode, men havde progressiv sygdom i den anden periode af behandlingen med erlotinib. Denne patient døde en måned senere. Antallet af E-CTCs faldt fra 69, til 10 /ml blod i den første periode, og steg til 25 og 19 /ml blod i de sidste to perioder. Antallet af E + CTCs viste en uordnet ændring 8-23 /ml blod i den første periode, og derefter faldt til 7 /ml blod og målbart i de sidste to perioder. Procentdelen af ​​E-CTCs blev holdt på et højt niveau (90%) i starten, reduceret til 30% sammen med en reaktion på partiel remission af sygdom og derefter forøget til 78% og 100% efter progression af sygdommen.

Patient 4 (fig 3D og S5 fig), der havde progressiv sygdom i den indledende diagnose, viste delvis remission, stabil sygdom, progressiv sygdom og stabil sygdom fra første til fjerde periode i behandling med erlotinib. Antallet af E-CTCs viste en fluktuerende ændring fra 23, 17, 6, 17-5 /ml blod, mens E + CTCs var næsten uopdaget på alle tidspunkter. Procentdelen af ​​E-CTCs blev opretholdt nær til 100% på alle tidspunkter.

Opfølgende

Alle patienter havde opfølgende poster fra 10 til 20 måneder afhængig af prøvetagningstidspunkt. Sytten patienter døde på grund af en fjernmetastaser (trin I-II: 3 tilfælde, stadie III: 3 sager; stadie IV: 11 tilfælde). I de 17 tilfælde blev 4 patienter udelukket fra den statistiske analyse, fordi CTCs blev opdaget. I 41 patienter med påviselige CTCs, 9 af 16 patienter med absolut flertal af E-CTCs i blodet (

r

95%) og 8 af 25 patienter med

r

≤ 95% døde. Kaplan-Meier analyse viste, at patienter med

r

95% havde signifikant kortere overlevelsestid end dem med

r

≤ 95% (

s

= 0,041, Fig 4).

Karakterisering af CTCs i stemness

at udforske kapacitet CTCs efter CSC-model, vi bestemt udtryk for CXCR4 og CD133 på E + og E-CTC henholdsvis 10 patienter. CXCR4 blev påvist i 8/10 af patienterne inden for undergruppe af E-CTCs, mens det blev påvist i kun 3/10 af patienterne inden for undergruppen af ​​E + CTCs. Både CXCR4 og CD133 blev påvist i 6/10 af patienterne inden for undergruppe af E-CTCs, mens de blev opdaget i kun 1/10 af patienterne inden for E + CTCs undergruppe. CXCR4 + CTCs og CXCR4 + CD133 + CTCs blev påvist at være væsentligt højere i E-CTCs end i E + CTCs (

s

= 0,021 og 0,005 henholdsvis figur 5A). Derudover blev ekspressionen af ​​CD133 fundet at være signifikant højere i CXCR + E-CTCs end i andre typer af CTCs (

s

= 0,029, Fig 5B). Interessant nok i de samme individer, antallet af CTCs med ekspressionen af ​​CXCR4 og /eller CD133 var altid mere inden undergruppen af ​​E-CTCs end E + CTCs. Ingen patient kunne findes, at ekspressionen af ​​CXCR4 og /eller CD133 blev påvist kun i E + CTCs men ikke i E-CTCs.

Fordeling af (A) antallet af CXCR4 + og CXCR4 + CD133 + celler og ( B) de positivitet afsløring satser af CXCR4 + CD133 + celler i CTCs klassificeret af ekspression af EpCAM i 10 NSCLC patienter.

diskussion

CTCs kan bruges som prognostisk markør [17 , 18]. Imidlertid har det lille antal og lav koncentration af CTCs begrænset undersøgelse af biologi CTCs [9, 19]. På grund af heterogenitet CTCs, er det vanskeligt at indfange alle typer CTCs af EpCAM-baserede metoder. En mere fornuftig strategi er at udtømme leukocytter. Ved hjælp af vores forbedrede metode blev renheden af ​​CTCs steget med 10 gange i standardtilsætningsforsøg, og op til 50 gange højere i blodprøver sammenlignet med en tidligere rapporteret metode baseret på magnetiske nanobeads [16]. Ved anvendelse af denne metode, kan middelværdien af ​​renheden af ​​CTCs være op til 10% i standardtilsætningsforsøg og 10,6% i de blodprøver fra patienter, som også støttede den videre anvendelse i molekylær analyse. Denne metode er sammenlignelig til påvisning af CTCs med og uden ekspression af EpCAM. I resultaterne, 36,4% (for E + CTCs) og 81,8% (for E-CTCs) af patienterne havde stadie IV sygdom. Disse data er i overensstemmelse med de offentliggjorte resultater, E + CTCs blev påvist i kun 23 ~ 32% af avanceret NSCLC patienter ved CellSearch og 80% af dem efter størrelse isolation strategien [4, 7]. Denne metode er specifik for identifikation af CTCs med og uden ekspression af EpCAM. Både E + og E-CTCs blev påvist at være meget lavere i de blodprøver fra raske frivillige i forhold til dem hos patienter, som også var i overensstemmelse med en tidligere offentliggjort undersøgelse [20]. Selvom E + og E-CTCs blev opdaget i fem patienter, er det muligt, at opregningen af ​​CTCs var lavere end cutoff værdier eller fraværende fra yderligere specifikke markører for at identificere de heterogene tumorceller i NSCLC [21, 22].

i den foreliggende undersøgelse undersøgte vi fordelingen af ​​CTCs med og uden ekspression af EpCAM i NSCLC-patienter ved en forbedret fremgangsmåde. I resultaterne, blev E + og E-CTCs opdaget at være signifikant forskellig kun trin IV patienter, selv om de ikke var i fase I-II og III patienter. Desuden er andelen af ​​patienter med et absolut flertal af E-CTCs i blodet steg betydeligt fra trin I-II-IV. Desuden resultaterne ved Kaplan-Meier analyse viste, at patienter med et absolut flertal af E-CTCs i blodet havde en kortere overlevelsestid end patienter med en lav procentdel af E-CTCs. Disse resultater antydede, at procentdelen af ​​E-CTCs kunne anvendes til at forudsige prognosen for NSCLC-patienter.

I øjeblikket diagnostiske værdi CTCs med og uden ekspression af EpCAM i NSCLC er uklar. I denne undersøgelse, vi gennemførte langsgående overvågning i 4 indeks patienter under adjuverende behandling. Procentdelen af ​​E-CTCs viste sig at være mere nøjagtig end antallet af E + CTCs i vurderingen af ​​terapeutisk virkning på både kemoterapi og målrettet terapi. Desuden blev et lavt antal E-CTCs forbundet med en positiv reaktion i patienter. Disse resultater antydede, at procentdelen af ​​E-CTCs kan have potentiale som en markør i overvågningen og forudsigelse af den terapeutiske effekt i NSCLC. Det er muligt, at noncancerous celler kan indgå i E-CTCs [9], og vi har heller ikke finde nogen klinisk værdi i den simple tælling af E-CTCs. Dette fænomen var også i overensstemmelse med de nyligt offentliggjorte resultater på kemoterapi i brystkræft [23]. vores data oplyste imidlertid, at en høj procentdel af E-CTCs kan betyde en styrket evne til tumorceller i invasion og spredning.

At udforske ovenstående biologi CTCs, vi karakteriserede stemness af CTCs med forskellige udtryk profiler af EpCAM efter resultaterne af vores tidligere arbejde [13]. Tidligere undersøgelser har antydet, at en kombination af CXCR4 og CD133 kan bruges som CSC markør [24, 25]. I vores resultater, blev CXCR4 + CD133 + CTCs detekteret at være væsentligt mere udbredt i E-CTCs end dem i E + CTCs, og antallet af E-CTCs med ekspressionen af ​​CXCR4 og /eller CD133 var altid mere end E + CTCs i i de samme individer, som foreslået, at E-CTCs syntes at være mere stamme-lignende. Dette resultat kan forklare, i det mindste delvist, den dårligt resultat hos patienter med overvældende E-CTCs i blodet i et vist omfang. Desuden CXCR4 blev opreguleret under TGF-β induceret EMT. Den potentielle forhold mellem mere dæmme-lignende E-CTCs og EMT bør undersøges nærmere. Selv om et relativt lille antal patienter blev anvendt i denne undersøgelse, disse resultater bidrage til en bedre forståelse af forholdet mellem CSC og EMT i CTCs. Der er behov for yderligere forskning med en stor stikprøve og EMT identifikation at præcisere status for denne type CTCs og dens funktion i tumor progression af NSCLC.

Konklusion

Baseret på en teknik CTC berigelse ved udtømning af leukocytter med bi-antistoffer, denne undersøgelse vurderede den kliniske værdi af CTCs med og uden EpCAM udtryk i NSCLC. Vore data tyder på, at andelen af ​​E-CTCs steget betydeligt fra trin I-II til IV, og kan anvendes til at evaluere den fjerne metastaser, terapeutisk virkning og prognose af patienter i NSCLC. Endvidere E-CTCs syntes at være mere stængel-lignende end E + CTCs. Disse resultater giver det første bevis for den potentielle kliniske anvendelse af E-CTCs i NSCLC.

Støtte Information

S1 Fig. Repræsentant FACS-analyse på CTCs i blodprøver fra 4 NSCLC patienter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s001

(TIF)

S2 Fig. Computertomografi (CT) billeder til patient en behandling med Gefitinib og derefter ALIMTA (pemetrexeddisodium) + cisplatin

doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s002

(TIF)

S3 Fig. CT-billeder til patient 2 behandlet med paclitaxel liposom + cisplatin og derefter strålebehandling + erlotinib

doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s003

(TIF)

S4 Fig. CT-billeder til patient 3 behandlet med ALIMTA + carboplatin og derefter erlotinib

doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s004

(TIF)

S5 Fig. CT-billeder til patient 4 behandlet med erlotinib

doi:. 10,1371 /journal.pone.0137076.s005

(TIF)