PLoS ONE: Ginkgo biloba ekstrakt Mindsker Ikke-småcellet lungekræft Cell Migration ved nedregulering Metastase-Associated Factor Heat-Shock Protein 27

Abstrakt

Heat-chok proteiner (HSP’er) er molekylære chaperoner, der beskytter proteiner fra skader. HSP27-ekspression er associeret med transformation cancer og invasion.

Ginkgo biloba

ekstrakt (EGb761), den mest solgte urtekosttilskud, har antiangiogene virkninger og inducerer tumor apoptose. Data om effekten af ​​EGb761 på HSP udtryk er begrænset, især i kræft. HSP27 udtryk i parrede tumorer og normale lungevæv af 64 patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) blev påvist ved real-time PCR, western blotting, og immunhistokemi. NSCLC cellelinjer (A549 /H441) blev anvendt til at undersøge de vandrende evner

in vitro

. NSCLC væv viste højere HSP27 udtryk end normalt lungevæv. Kaplan-Meier overlevelse analyse viste, at NSCLC patienter med lav HSP27-ekspression ratio ( 1) havde signifikant længere overlevelse end dem med en høj ekspression ratio ( 1) (p = 0,04). EGb761 inhiberede HSP27-ekspression og migreringsevnen af ​​A549 /H441-celler, hvilket er det samme som HSP27-siRNA transfektion virkning. Desuden EGb761 behandling aktiveret de AKT og p38 veje og påvirkede ikke udtryk for PI3K, ERK, og JNK veje. HSP27 er en dårlig prognostisk indikator for NSCLC. EGb761 kan nedsætte migration evne A549 /H441 ved at hæmme HSP27 udtryk sandsynligvis gennem AKT og p38 MAPK veje aktivering

Henvisning:. Tsai JR, Liu PL, Chen YH, Chou SH, Yang MC, Cheng YJ, et al. (2014)

Ginkgo biloba

Uddrag Mindsker Ikke-småcellet lungekræft Cell Migration ved nedregulering Metastase-Associated Factor Heat-Shock Protein 27. PLoS ONE 9 (3): e91331. doi: 10,1371 /journal.pone.0091331

Redaktør: Prasad S. Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA

Modtaget: 29 oktober, 2013; Accepteret: 9. februar 2014 Udgivet: marts 11, 2014

Copyright: © 2014 Tsai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud KMU-Q098022 fra Kaohsiung Medical University, og giver NSC102-2314-B-037-067 fra National Science Rådet, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste dødsårsag kræft verdensplan. Selv med forbedringer i både diagnostiske og terapeutiske teknikker, den samlede 5-års overlevelse er stadig fattige. Dårlig prognose for lungekræft skyldes primært tidlig tilbagefald, metastaser og dårlig reaktion på behandlinger såsom kirurgi, kemoterapi og strålebehandling [1] – [2]. Mangel på gode prognostiske biomarkører, som kan forudsige behandlingsrespons og prognose, påvirker også behandling planer og patientresultater.

Heat-chok proteiner (HSP’er) er en stor familie af proteiner, der har væsentlige hæmostatiske funktioner i celler under fysiologiske betingelser. Ifølge molekylvægte, er HSP’er grupperet i flere underfamilier: lille (HSP 20-30 kDa), Hsp40, Hsp60 HSP70, HSP90, og Hsp100. Den vigtigste funktion af HSP er at beskytte celler mod beskadigelse under stressende forhold [3]. Ud over deres cytobeskyttende virkninger, kan HSP’er fremme carcinogenese ved at inhibere apoptose [4] – [8] og ved at forbedre resistens mod behandling [9] – [10]. Imidlertid er rollen af ​​HSP’er i forskellige tumorer kompliceret [4], [9].

HSP27 er et cytoplasmatisk protein, der udtrykkes konstitutivt i flere normale væv og maligniteter. Dets ekspression er blevet associeret med dårlig prognose i æggestokkene [11], bryst [9], [12], gastrisk [13] – [14], lever [15], og prostatacancer [16] samt osteoscarcomas [7] . I hoved- og halscancer [3] og urogenitale kanal tumor [17], HSP27 udtryk har ingen effekt på prognosen. Men den prognostiske rolle HSP27-ekspression i lungekræft er under debat. Zimmermann et al. [18] rapporterede, at serum HSP27 niveau var positivt korreleret med avancerede lungekræft stadier. HSP27-ekspression kan øge kemoresistens af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og er et dårligt indikator for prognose [10], [19]. I modsætning hertil er HSP27 overekspression forbundet med bedre overlevelse hos patienter med NSCLC ifølge en undersøgelse af Malusecka et al. [20]. Immunohistokemisk farvning viste, at HSP27 udtryk i lungekræft væv ikke er korreleret med T (primær tumor) N (lymfeknuder) M (metastaser) og stadier [21].

Uddrag fra bladene af

Ginkgo biloba

har været brugt i Kina og vestlige lande i århundreder på grund af deres antioxidant egenskaber [22]. En standard

G. biloba

ekstrakt, EGb761 (handelsnavn), indeholder 22% -27% flavonoider og 5% -7% terpenoider, som er de vigtigste aktive stoffer [23]. EGb761 kan bekæmper frie radikaler og neutraliserer færge ion-inducerede peroxidants [24]. Derfor EGb761 er nyttigt til forebyggelse og behandling af degenerative processer associeret med oxidativt stress [25] – [26]

Selvom kemoterapi er stadig den primære behandling anvendes til lungekræft, de negative bivirkninger forbundet med dette. behandling begrænse dens anvendelse. Supplerende medikamenter såsom urte medicin er blevet mere populære i de seneste årtier. Desuden har flere eksperimenter rapporteret, at EGb761 har antitumorvirkninger. De anticancer egenskaber EGb761 tilskrives dets antioxidant, antiangiogene, og gen-regulatoriske virkninger [24]. EGb761 kan hæmme tumor proliferation via apoptose i tyktarmskræft [27] og mundhulen kræft [28]. Fase II kombineret behandling med 5-fluorouracil (5-FU) og EGb761 er testet hos patienter med pancreatisk eller colorectal cancer [29] – [30] og har vist lovende resultater. I denne undersøgelse undersøgte vi HSP27-ekspression i patienter med NSCLC og analyseret forholdet mellem HSP27-ekspression og kliniske resultater. Endvidere blev virkningerne af EGb761 på HSP27-ekspression undersøges. Vi håber, at resultaterne af denne undersøgelse vil give klinikere med en ny kombination af stof regimer og tjene som en indikator for at forbedre NSCLC prognose.

Resultater

Demografiske data og HSP27 udtryk hos patienter med NSCLC

i alt blev 64 patienter med NSCLC inkluderet i denne undersøgelse. Af disse blev 47 (73%) histologisk identificeret som havende adenocarcinom og 17 (27%) patienter blev identificeret som havende pladecellecarcinom. Gennemsnitsalderen for patienterne var 61,2 ± 9,5 år (spændvidde, 36-78 år). Det TNM mellemstationer og HSP27 udtryk status i NSCLC patienter er sammenfattet i tabel 1. Den gennemsnitlige HSP27 udtryk forholdet var 2,05 ± 1,95. Patienter med NSCLC med metastase og fremskreden (stadie IIIb-IV) kræft havde højere HSP27 udtryk forhold end dem uden metastase og tidlig fase kræft (p = 0,03 og p = 0,009, henholdsvis). Kaplan-Meier overlevelse kurve viste NSCLC patienter med et lavt HSP27 udtryk forholdet havde signifikant bedre overlevelse end dem med en høj ekspression ratio (p 0,05;. Figur 1). De multivariate justeret risiko nøgletal er beregnet ved hjælp af Cox regression med yderligere variabler af køn (mandlige versus kvindelige), alder (år), metastase, tumor og lymfeknude involvering (tabel 2). Ved at gøre dette, fandt vi, at patienter med højt HSP27 udtryk havde en 2,30 gange højere dødelighed risiko (p = 0,04) end patienter med lav HSP27 udtryk. Vejviser

HSP27 udtryk i patienter med NSCLC

HSP27 udtryk hos patienter med NSCLC blev analyseret (fig. 2). Immunhistokemisk farvning og western blot-analyse af lungekræft væv udviste højere HSP27-ekspression i lungekræft væv end i den normale lungevæv (Fig. 2A-B).

(A) Lung prøver (lungekræft og tilsvarende normale tilstødende lungevæv) blev analyseret med antistof mod varmechokprotein 27 (HSP27) i immunhistokemisk farvning (DAB-farvning og hematoxylin modfarvning). For negative kontroller blev antistoffet erstattet med kontrol-IgG. HSP 27 blev overudtrykt i NSCLC væv end normalt lungevæv. (B) Western blotting-analyse af HSP 27-ekspression i NSCLC væv og normalt væv. Repræsentative data fra fire forskellige patienter med NSCLC er vist (T = tumor, N = normal). Ekspressionen af ​​HSP27-protein-ekspression blev signifikant forøget i NSCLC væv sammenlignet med et normalt lungevæv (* p 0,05).

Virkning af EGb761 på cytotoksicitet og HSP27-ekspression i BEAS-2B og NSCLC cellelinier (A549 og H441)

Vi behandlede 3 cellelinjer (BEAS-2B, A549, og H441) med forskellige koncentrationer af EGb761. MTT-assayet viste, at EGb761 ikke havde cytotoksisk virkning på disse 3 cellelinjer selv ved højere koncentrationer (fig. 3A). DNA fragmentation assay viste også, at EGb761 ikke inducerer apoptose i BEAS-2B, A549, og H441 cellelinier ved forskellige koncentrationer (fig. 3B). HSP27-ekspression i A549 og H441 cellelinier faldt betydeligt på en dosis-afhængig måde med en stigning i EGb761 koncentration, som bestemt ved Western blot analyse (fig. 3C). Men HSP27-ekspression i normale bronchiale epitelceller (BEAS-2B) ikke ændre sig, når EGb761 koncentrationerne var under 500 ug /ml.

(A) EGb761 afse indlysende cytotoksisk virkning på lungekræft cellelinier ( A549 og H441) og normale bronchiale epitelceller (BEAS-2B). (B) DNA-fragment assay viste EGb761 inducerede ikke BEAS-2B, A549 og H441 celle apoptose. (C) Den HSP27 mRNA /protein-ekspression af BEAS-2B celler ikke ændre sig væsentligt, når koncentrationen af ​​EGb761 var under 500 [0-9] [A-z] ug /ml. Desuden kan den HSP27 mRNA /protein ekspression af A549 /H441-celler være faldende signifikant med stigende EGb761 koncentration i en dosisafhængig måde. Repræsentative billeder af tre uafhængige forsøg. *

P

0,05 versus kontrol. Analyser blev udført i tre eksemplarer.

Effekt af EGb761 og HSP27-siRNA transfektion på HSP27 udtryk

Vi transficeret den A549 /H441 celler med HSP27-siRNA plasmid. Den HSP27-siRNA plasmidtransfektion faldt betydeligt HSP27 udtryk i A549 /H441 celler, som blev bekræftet ved hjælp af real-time PCR og western blotting (fig. 4A-B). EGb761 havde også den samme virkning som HSP27-siRNA transfektion i væsentligt faldende HSP27 mRNA og protein-ekspression i A549 /H441 (Fig. 4A-B). Selv om både HSP27-siRNA og EGb761 behandling kan nedregulere HSP27 udtryk, betyder det ikke, at der er en effektor forholdet mellem dem. Yderligere undersøgelser er nødvendige for yderligere at undersøge dette forhold.

(A) HSP27 mRNA ekspressionen af ​​A549 /H441 celler blev reduceret med EGb761 behandling eller HSP27-siRNA transfektion 24 timer senere sammenlignet med kontrolgruppen. (B) The HSP27-protein ekspression af A549 /H441-celler blev også reduceret med EGb761 behandling og HSP27-siRNA transfektion 24 timer senere i sammenligning med kontrolgruppen. *

P

0,05 versus kontrol. Assays blev udført i tre eksemplarer. NC-siRNA er den negative kontrol.

Virkninger af EGb761 og HSP27-siRNA transfektion på vandrende evne A549 /H441

A549 /H441 celler blev anvendt til at vurdere effekten af HSP27 på NSCLC celle vandrende evne

in vitro

. Cellulær migration blev analyseret under anvendelse sår ridse assay. Sammenlignet med den vandrende evne kontrolgruppen blev den vandrende aktivitet A549 /H441 celler hæmmes betydeligt efter HSP27-siRNA transfektion eller EGb761 behandling. (P 0,05) (Figur 5A-B.)

(A) Cellulær migration blev bestemt ved monolag blotlægning assay og analyseret af Wimasis WimScratch softwaren. Den vandrende evne A549 /H441-celler blev inhiberet med EGb761 (100 ug /ml) behandling sammenlignet med kontrolgruppen. Deaktivering af HSP27 udtryk ved HSP27-siRNA transfektion, den vandrende evne faldt også i A549 /H441. NC-siRNA er den negative kontrol. Repræsentative billeder af tre uafhængige forsøg. Data er fra tre uafhængige forsøg. *

P

0,05 versus kontrol. Analyser blev udført i tre eksemplarer.

Den regulatoriske effekt af EGb761 på HSP27 udtryk gennem AKT og p38 MAPK pathway

De intracellulære signalveje som MAPK’er og PI3K /AKT er vigtige determinanter af kræft migration [31] – [33]. Men de intracellulære regulatoriske signalveje mellem EGb761 og HSP27 udtryk er stadig uklart. Vi analyserede ekspressionen af ​​forskellige pathway proteiner efter behandling af A549 /H441-celler med forskellige EGb761 koncentrationer. Udtrykket af p-AKT og p-P38 blev øget markant efter EGb761 behandling i forhold til kontrolgruppen, og udtryk for PI3K, ERK, og JNK ikke ændre sig efter EGb761 behandling (fig. 6A, D) Vi yderligere behandlet A549 /H441 cellelinien med AKT-inhibitor (API-59, 3 mM) og p38 MAPK inhibitor (SB203580, 10 mM). Den inhiberende virkning af EGb761 på HSP27-ekspression blev blokeret af AKT eller p38 MAPK inhibitor (fig. 6B, E). Endvidere migration evne A549 /H441-celler også udvindes efter AKT eller p38-inhibitor behandling selv i nærvær af EGb761 (fig. 6C, F). Disse resultater antydede, at EGb761 reguleret HSP27 udtryk, sandsynligvis gennem AKT og p38 MAPK signalveje.

(A, D) De udtryk for AKT /Pakt, P38 /pP38, PI3K /pPI3K, ERK /pERK, JNK /pJNK af A549 /H441 blev analyseret ved western blotting efter behandling med EGb761 (100 ug /ml). Udtrykket af Pakt og p-p38 blev forstærket af EGb761 behandling signifikant (p 0,05) (B, E). A549 /H441 celler linje blev behandlet med inhibitorer af AKT (API-59) (3 mM), blev p38 MAPK (SB203580) (10 mM) i 1 time og EGb761 (100 ug /ml) behandlet senere. Den AKT inhibitor eller p38-inhibitor kan blokere den inhiberende virkning af EGb761 i HSP27-protein-ekspression. (C, F) Cellulær migration blev bestemt ved monolag blotlægning assay og analyseret af Wimasis WimScratch softwaren. Med AKT-hæmmer eller p38-inhibitor, blev den cellulære vandrende evne A549 /H441 ikke svækket af EGb761. Repræsentative billeder af tre uafhængige forsøg. Data er fra tre uafhængige forsøg. *

P

0,05 versus kontrol. Analyser blev udført i tre eksemplarer.

Diskussion

HSP’er er allestedsnærværende molekylære chaperoner til stede i alle levende celler. De beskytter celler fra miljøbelastninger skader [34]. Den lille HSP27 spiller en rolle i signaltransduktion, regulering vækst, udvikling, differentiering og tumorigenese [35]. Stigende niveauer af HSP27 er blevet observeret i flere maligniteter som brystkræft [36], tyktarmskræft [37], prostatacancer [16], og lungekræft [10], [21]. I vores undersøgelse, screenede vi ekspressionen af ​​HSP’er, herunder Hsp10, HSP27, HSP30, HSP60, HSP70, og HSP90 i NSCLC-vævsprøver (data ikke vist). Kun HSP27 blev fundet at være overudtrykt i NSCLC væv. Koordinering med patientens kliniske parametre, overekspression af HSP27 synes at øge den metastatiske potentiale NSCLC og er en dårlig prognostisk indikator. Blokering HSP27 udtryk ved EGb761 faldt den vandrende evne NSCLC cellelinjer.

HSP27 har tiltrukket en masse opmærksomhed i de seneste årtier på grund af sin rolle i tumor carcinogenese, prognostiske, forudsigende og behandling konsekvenser [4]. I kræft i spiserøret, falder HSP27 udtryk under carcinogenese til adenocarcinomer men øger under carcinogenese til planocellulære karcinomer [38]. HSP27 udtryk er korreleret med graden af ​​differentiering i huden [39], endometrial [40], og livmoder kræft [41]. HSP27 overekspression inducerer også kemoresistens i prostatakræft [42] og kræft i spiserøret [43], men forbedret respons på behandling i hoved og hals kræft [44]. Sammenfattende rolle HSP27 er variabel og afhænger af forskellige tumortyper.

I vores undersøgelse, HSP27 var en dårlig prognostisk indikator for patienter med NSCLC efter justering for andre faktorer. Højere ekspression forhold på HSP27 blev observeret hos patienter med NSCLC med en fremskreden cancer, hvilket var samme som rapporteret i en undersøgelse af Zimmermann et al. [18]. Serum HSP27 niveau er en nyttig biomarkør til at diskriminere raske rygere og patienter med kræft med tidlig og fremskreden NSCLC [18]. Men en rapport fra Malusecka et al. viste, at HSP27-ekspression kan være en gunstig prognostisk faktor i NSCLC [20]. Undergruppe analyse viste, at HSP27 bevaret sin prognostisk betydning i pladecellecarcinom men ikke i adenocarcinom. To tredjedele af patienterne havde pladecellekarcinom i Malusecka undersøgelsen, men andelen af ​​pladecellecarcinom var kun 27% i vores undersøgelse. Vores undergruppe analyse viste ingen prognostiske forskel mellem patienter med adenokarcinom og pladecellekræft. Små stikprøvestørrelser og heterogenitet er vores begrænsninger. Desuden vandrende evne A549 og H441

in vitro

var signifikant faldt efter lyddæmpende HSP27 udtryk, som var i overensstemmelse med vores kliniske observation, at HSP27 udtryk kan øge metastatisk potentiale. Selvom HSP27 var blevet identificeret som en metastase-associeret protein i NSCLC [45] – [46], den nøjagtige sammenhæng mellem HSP27 og metastatiske mekanisme kræver yderligere undersøgelser

Kemoterapi narkotika normalt påvirke både patologiske tumorceller og normale. celler og forårsage alvorlige komplikationer og toksicitet. Cisplatin, en effektiv antineoplastisk middel, er det vigtigste element i lungekræft kemoterapi. Sensorineuralt høretab og nefrotoksicitet er de værste skadelige virkninger af cisplatin, der kan indebære for stor dannelse af frie radikaler [24]. Gennem opfangning og forhindre dannelsen af ​​frie radikaler, kan EGb761 inducere beskyttende virkninger mod cisplatin-induceret toksicitet. I et forsøg i rotter, EGb761 held faldt cisplatin-associeret toksicitet uden at dæmpe dens antitumoraktivitet [47]. Passivitet eller overlevelse af kræft stamceller efter behandling kan være ansvarlig for tilbagefald og resistens for lungekræft til moderne terapi [48]. HSP27 aktivering, er blevet observeret i kemoresistent lungekræft stamcellelignende celler [10]. Vores undersøgelse viste, at EGb761 hæmmede HSP27 udtryk i NSCLC celler. Derfor kan EGb761 har et stort potentiale i lungekræft behandling på grund af sin hæmmende effekt på HSP27 udtryk.

Cellular varme-shock respons normalt udvikler hurtigt, som er relateret til aktivering af større signalering pathways involverer mitogenaktiverede protein (MAP) kinaser, ekstracellulære signal-regulerede kinaser (ERK’er), c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p38 [49]. Disse signaleringskaskader spiller en central rolle i reguleringen og bestemmelse celleskæbne herunder vækst, differentiering eller apoptose i talrige fysiologiske samt stressbetingelser [50]. AKT /PI3K-afhængige signal transduktion pathways er celleoverlevelsessignaler stimuleres af vækstfaktorer, cytokiner og oncoproteiner. Overaktiv AKT /PI3K pathway kan reducere tumorcelle apoptose og forøge proliferation [51]. Men de lovgivningsmæssige forhold mellem HSP27, PI3K /AKT, og MAP-kinase veje er kompleks. For eksempel vil p38MAPK-MAPKAPK2-HSP27 pathway aktiveres ved kemoterapimiddel ciplastin plus Gemcitabin i lungekræft stamceller [10]. I modsætning hertil HSP27 inducerer cisplatin resistens ved at trykke p38-aktivering og styrkelse AKT aktivering i lungecancerceller [52]. Denne forskel kan skyldes forskellige celletyper og undersøgelsens design. Guo et al. viste, at en tidlig, transient aktivering af JNK eller p38 MAPK (eller begge) sædvanligvis er forbundet med celleoverlevelse eller differentiering, mens en sen, vedvarende aktivering af disse kinaser almindeligvis er associeret med apoptose [53]. I tarmkræft, HSP27 overekspression er KRAS mutation afhængig [54], men både A549 og H441 er KRAS mutation cellelinjer. Forholdet mellem KRAS mutation og HSP27 udtryk i lungekræft behov for yderligere undersøgelse. I vores rapport, EGb761 svækket HSP27-ekspression i A549 /H441 cellelinjer ved at aktivere p38 MAPK og AKT veje, men ikke ERK eller JNK. Fordi kombinationen af ​​AKT og p38-hæmmer behandling kan nedsætte cellulær levedygtighed, kan de synergistiske virkninger af kombinationsbehandlingen på ekspressionen af ​​HSP27 brug for yderligere analyse. Desuden, på grund af aktivering (phosphorylering) status er ustabil og dephosphorylering forekom hurtigt under fysiologiske betingelser, er det vanskeligt at observere de sande resultater af AKT og p38-aktivering

in vivo

i den lave HSP27-ekspression patientgruppe.

som konklusion, HSP27 er en dårlig prognostisk faktor NSCLC, og EGb761 har et stort potentiale til at blive brugt som et supplement til behandling af NSCLC grund af sin hæmmende effekt på HSP27 udtryk.

Materialer og Metoder

Tumor prøvetagning

NSCLC og tilsvarende normale væv blev indsamlet fra 64 patienter, som gennemgik kirurgisk resektion ved afdelingen for Thoracic Surgery, Institut for Kirurgi, Kaohsiung Medical University Hospital, 2004-2010 . Vævsprøver blev straks anbragt i flydende nitrogen til forsendelse til laboratoriet, og derefter opbevaret i -80 ° C frysere indtil RNA-isolering og protein ekstraktion blev udført. Komplet mellemstationer procedurer, herunder bryst røntgen, bronkoskopi, hjerne og thorax computertomografi, sonografi, og knogle scintigrafi blev udført præcist bestemme de karakteristiske træk TNM hos patienter med NSCLC i henhold til TNM International Staging System for Lungekræft [55]. Alle patienter blev fulgt op indtil marts 2011, og detaljer om deres demografiske og overlevelsesdata blev opdateret.

Etik erklæring

Undersøgelsen blev godkendt af Etisk Review Board for Forskning (KMUH-IRB 990.358) i Kaohsiung Medical University Hospital, Kaohsiung, Taiwan. Deltagerne give deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse.

RNA-ekstraktion og tidstro polymerasekædereaktion (PCR)

Totalt RNA blev isoleret fra frosne lunge tumorvæv fra patienter med NSCLC og tilsvarende normale hosliggende lungevæv. RNA fra normal lungevæv, lunge tumorvæv, og lungecancerceller blev analyseret under anvendelse real-time PCR. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af et RNeasy Mini kit og en RNase-fri DNase Set (Qiagen, Valencia, CA, USA). Totalt RNA (2 ug) blev revers-transkriberet under anvendelse af SuperScript ™ og første-streng syntese System for RT-PCR-kittet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). En 1:05 fortynding af den resulterende cDNA blev anvendt som standard, og en 1:10 skabelon fortynding af den resulterende cDNA blev anvendt som standard til at kvantificere relative indhold af mRNA ved anvendelse af real-time PCR (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I, Roche, Mannheim, Tyskland). Følgende primere til real-time PCR blev designet ved hjælp af Primer Express-softwaren (RealQuant, Roche, Mannheim, Tyskland) ved hjælp af publicerede sekvenser: human HSP27 (GenBank: tiltrædelse nummer: AB020027.1) sense primer: 5′-GTC CCA CGA GAT CAC CAT-3 ‘, humant HSP27 antisense-primer: 5′-GGT GGT TGC TTT GAA CTT TAT T-3′, humant GAPDH sense primer: 5’-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3 ‘, og GAPDH antisense primer: 5’-GCC CAA TAC GAC CAA ATC C-3 ‘. Fluorescens data blev erhvervet i slutningen af ​​forlængelsen. Smelt analyse blev udført for alle produkter for at bestemme specificitet forstærkning. Desuden blev PCR-produkter elektroforeret på 1% agarosegeler at bekræfte, om de korrekte båndstørrelser var til stede. Relativ udtryk blev beregnet i forhold til udtrykket i tumoren i forhold til udtryk i den normale tilstødende væv (høj ekspression: tumor læsion /normalt væv 1; lav udtryk: tumor læsion /normalt væv 1) [56] – [57]

Immunohistokemisk farvning

tumorprøver blev dissekeret fra humant lungevæv, fikseret i 4% bufret formalinopløsning natten over, indlejret i paraffin, og snit i 5-um tykkelser.. De paraffinsnit blev afparaffiniseret med xylen og farvet med antihuman-HSP27 (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) antistof. Efter PBS vask blev sektionerne inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. For farve reaktioner, blev diaminobenzidin (DAB), der anvendes, og tæller farvet med hematoxylin. For negative kontroller blev antistoffet erstattet med kontrol-IgG.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret med lysepuffer [0,5 M NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,05% SDS, 0,5% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pH 7,4] i 30 min ved 4 ° C, og cellelysaterne blev centrifugeret ved 4.000

g

i 30 minutter ved 4 ° C. Proteinkoncentrationer i supernatanterne blev målt under anvendelse af en BioRad proteinbestemmelse kit (BioRad, Hercules, CA, USA). Supernatanterne blev underkastet 12% SDS-PAGE og derefter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (NEN) i 1 time ved stuetemperatur. Membranerne blev derefter behandlet med PBS indeholdende 0,05% Tween 20 og 2% skummetmælk i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet separat med muse-antihuman HSP27, AKT /Pakt, P38 /pP38, PI3K /pPI3K, ERK /pERK, JNK /pJNK eller α-tubulin (Abcam, Cambridge, MA, USA) i 1 time ved stuetemperatur som intern kontrol. Efter vask blev membranerne inkuberet i med peberrodsperoxidase-konjugeret kanin antigoat eller mus IgG ved stuetemperatur. Immundetektion blev udført ved hjælp af kemiluminescens reagens plus NEN og eksponering for Biomax MR Film (Kodak, Rochester, NY, USA).

Kultur af NSCLC celler

Lunge adenocarcinom A549 /H441-celler (ATCC CCL- 185 /ATCC HTB-174) blev dyrket i kolber i F12K vækstmedium suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin og 100 pg /ml streptomycin. Cellerne blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2. BEAS-2B celler (ATCC EF- referencelaboratoriet 9609), som er normale bronchiale epitelceller, blev anvendt som kontrol.

HSP27 lyddæmpning i A549 /H441 celler

Små interfererende RNA (siRNA), en specifik dobbeltstrenget 21-nukleotid RNA-sekvens homolog med målgenet, blev anvendt til at lukke munden HSP27-ekspression. Humant HSP27 siRNA sense primer: 5′-GCG UGU CCC UGG august UCA ATT-3 ‘og antisense-primer: 5′-UUG ACA UCC AGG GAC ACG CGC-3’. SiRNA for HSP27 og negativ kontrol (NC-siRNA) blev udformet og syntetiseret under anvendelse af en computer software fra Ambion (Austin, TX, USA) og Lyddæmper ™ siRNA byggesæt fra Ambion, ifølge producentens instruktioner. Inhibering af HSP27-mRNA og proteinekspression blev vurderet ved anvendelse af real-time PCR og immunoblotanalyse efter transfektion af A549 /H441 med HSP27-siRNA. Kort beskrevet blev celler dyrket i 6 brønde og transient transficeret med 20 nM siRNA ved anvendelse af 8 pi siPORT Amine (Ambion, Austin, TX, USA) i et totalt transfektion volumen på 0,5 ml af mediet. Efter inkubation ved 37 ° C, 5% CO

2 i 5 timer, 1,5 ml af den normale vækstmedium blev tilsat, og cellerne blev inkuberet i 48 timer.

MTT assay for cellelevedygtighed

3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma, Louis, MO, USA) assay blev anvendt til måling af cellelevedygtighed [58]. Princippet for denne test er, at mitokondriel dehydrogenase i levedygtige celler reducerer MTT til et blåt formazan. Kort beskrevet blev celler dyrket i 96-brønds plader og inkuberet med forskellige koncentrationer af EGb761. Efter vask af cellerne to gange med PBS, 100 pi af medium indeholdende MTT (0,5 mg /ml) blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i yderligere 4 timer. Mediet blev derefter omhyggeligt fjernet, således at den ikke forstyrrer formazankrystallerne dannet. Næste 100 pi DMSO, som solubiliserer de formazankrystaller, blev tilsat til hver brønd, og absorbansen af ​​den opløste blå formazan blev aflæst ved 540 nm ved anvendelse af en mikropladelæser (Multiskan Ex, ThermoLabsystems), med DMSO som blind. Reduktionen i optisk densitet ved lægemidlerne blev anvendt som måling af cellelevedygtighed, normaliseret til celler inkuberet i kontrolmedium, som blev anset for 100% levedygtige.

Kvantificering af DNA-fragmentering

Cellulær DNA fragmentering ELISA-analyser blev udført under anvendelse af et kit ifølge producentens protokol (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland). Celler blev inkuberet i 12 timer ved 37 ° C med et ikke-radioaktivt thymidin-analog 5-brom-2-deoxyuridin (BrdU), som kan inkorporeres i genomisk DNA. Efterfølgende blev celler inkuberet med eller uden EGb761 i 6 timer. Celler blev derefter lyseret, overført til en mikrotiterplade overtrukket med et anti-DNA-antistof, og inkuberet i 90 minutter ved stuetemperatur. Pladen blev vasket 3 gange og opvarmet i 5 minutter i en mikrobølgeovn. Anti-BrdU-peroxidasekonjugat blev sat til hver brønd, og pladen blev inkuberet i 90 minutter ved stuetemperatur. Efter pladen blev vasket 3 gange, blev substratopløsning tilsat, og pladen blev inkuberet i mørke på et rysteapparat, indtil farveudvikling var tilstrækkelig. Reaktionen blev derefter stoppet ved tilsætning af 25 pi 0,56 M H

2SO

4. En mikropladelæser (BioRad, Hercules, CA, USA) blev anvendt til måling af absorbans ved 450 og 655 nm for hver brønd.

In vitro

migrationsanalyser

vandrende evne celler blev analyseret i et monolag blotlægning assay som tidligere [59] beskrevne. De sammenflydende celler blev såret ved skrabning med en 100-pi pipettespids, der blottede en strimmel af monolaget, der var 300 um i diameter. Kulturerne blev vasket to gange med PBS; derefter et medium suppleret med 5% FBS blev tilsat, og blev observeret hastigheden af ​​sårlukning efter 24 timer. Cellerne, som vandrede ind i det blottede område blev fotograferet, og de områder blev analyseret ved anvendelse af Wimasis WimScratch software. Wimasis WimScratch er en ny generation web-baserede image værktøj til celle migration analyse. Edge detection teknikker kan nemt genkende den forreste kant og kløften området. Brugere kan uploade billeder og analyse starter automatisk.

EGb761 og pathway hæmmere

AKT og p38 MAPK-hæmmere, API-59 (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) og SB203580 ( Selleckchem, Radnor, PA, USA), henholdsvis blev anvendt i vores undersøgelse. De EGb761 anvendt i vores undersøgelse blev forfulgt fra Dr. Willmar Schwabe GmbH Co, Karlsruhe, (Tyskland).

statistiske analyser

Statistiske forskelle i HSP27 udtryk ratio og kliniske parametre blev testet ved hjælp studerendes

t

-test eller envejs-analyse variansanalyse (ANOVA). Overlevelseskurver blev tegnet under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Resultater er udtrykt som gennemsnit ± SEM.