PLoS ONE: 5 ‘UTR Kontrol af Native ERG og TMPRSS2: ERG Varianter Aktivitet i prostatakræft

Abstrakte

ERG, et medlem af ETS transskription faktor familie, ofte overudtrykt i prostatacancer som et resultat af sin fusion til androgen-responsive TMPRSS2 genet. Forskellige genomiske rearrangementer og alternative splejsning begivenheder omkring krydset regionen fører til multipel kombination af TMPRSS2: ERG fusion udskrifter, der korrelerer med forskellige tumor aggressivitet, men deres specifikke funktioner og biologiske aktiviteter er stadig uklart. Kompleksiteten af ​​ERG udtryk mønster forstærkes af anvendelse af alternative promotere, splejsningssteder, polyadenyleringssteder og oversættelse initieringssteder i både de indfødte og fusion sammenhænge. Vores systematisk karakterisering af indfødte ERG og TMPRSS2: ERG varianter afslører, at deres forskellige onkogent potentiale er påvirket af status for Ets domæne og konfigurationen af ​​5’UTR region. Især ekspression og aktivitet af funktionelle ERG og TMPRSS2: ERG varianter er påvirket af både translationsinitieringssignaler inden for de forskellige isoformer og ved inhibitorisk opstrøms åbne læserammer (uORF) i deres 5’UTR’er. Stabil udtryk for ERG og TMPRSS2: ERG varianter forfremmet cellemigration /invasion, inducerede en blok af spredning og inducerede en degeneration-lignende tilstand, hvilket tyder på en rolle for disse varianter i prostata tumorigenesis processen. Foruden TMPRSS2: ERG fusionsprodukter, en gruppe af beslægtede native ERG isoformer er også meget overudtrykt i fusion bærende prostatakræft, og deler den samme translationsstartstedet (i ERG exon 4) med almindeligt observerede TMPRSS2 exon1 forbundet til ERG exon 4 (T1: E4) fusion-afledt variant. Brug af denne ATG kan være fortrinsvis nedreguleret ved rettet antisense-baserede forbindelser, eventuelt repræsenterer grundlaget for en målrettet tilgang, der skelner mellem tumor-associerede og normal ERG

Henvisning:. Zammarchi F, Boutsalis G, Cartegni L (2013) 5 ‘UTR Kontrol af Native ERG og TMPRSS2: ERG Varianter Aktivitet i prostatakræft. PLoS ONE 8 (3): e49721. doi: 10,1371 /journal.pone.0049721

Redaktør: Bin Tian, ​​UMDNJ-New Jersey Medical School, USA

Modtaget: Juli 27, 2012; Accepteret: September 19, 2012; Udgivet: 5 mar 2013

Copyright: © 2013 Zammarchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet var støttet af DOD tilskud PC081477. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kromosomtranslokationer er veletablerede vigtige begivenheder i udviklingen af ​​blodkræftsygdomme og sarkomer [1]. Identifikationen af ​​tilbagevendende translokationer mellem androgen-responsive TMPRSS2 genet og medlemmer af Ets familie af transkriptionsfaktorer i prostatakræft (PCA) har ændret panorama af PCa biologi [2].

Mere end 80% af PCa prøver harbor onkogene fusioner, mest almindeligt involverer 5′-regionen af ​​TMPRSS2 locus (med sin promotor) forbundet til åben læseramme (ORF) af forskellige Ets gener [3], selv om andre kombinationer er blevet beskrevet [4], [5] [6]. Den mest almindelige omlejring, exon1 TMPRSS2 sluttet til ERG exon 4 (T1: E4 eller variant III) er til stede i -50% af PCA tilfælde [3]

Ets genfusioner spiller en rolle i overgangen. fra prostata intraepitelialneoplasi (PIN) til adenocarcinom og er forbundet til aggressive læsioner og dårlig prognose [7], [8], [9], [10], [11]. Overekspression af ERG i prostata cellelinjer aktiverer celle invasion programmer og resulterer i udviklingen af ​​pinkoder i mus, men kan ikke køre carcinogenese [5], [8], [10], [12], som samarbejdet med separate genetiske læsioner, for eksempel PTEN tab, er nødvendig for at udløse progression til fremskreden sygdom [7], [13], [14].

Flere varianter af det normale ERG genproduktet er blevet beskrevet, som følge af en kombination af alternativ splejsning, polyadenylering og transkriptionel initiering [15], [16], [17], [18]. De nærmere af de genomiske omlejringer også indføre en betydelig strukturel heterogenitet i 5′-området. Foruden den fælles T1: E4 transskript, TMPRSS2 exon 1, 2 og 3 kan kombineres med ERG exoner 2, 3, 4, 5 og 6 i forskellige alternative splejsning mønstre, der kan generere mindst 17 distinkt TMPRSS2: ERG transkripter [2 ], [19], [20], [21]. Disse kan tjene som markører for sygdomsprogression og korrelere til aggressiviteten af ​​tumorerne [8], [9], [19]. Især T2: E4 variant (TMPRSS2-exon2: ERG-exon4 eller variant VI), hvor det native ATG i TMPRSS2 exon 2 er i ramme med ERG ORF, der er forbundet med patologiske og kliniske aspekter af aggressiv sygdom [19] .

den mekanistiske grundlag for de enkelte onkogent potentiale af fusionsaktiviteterne isoformer mangler at blive belyst, og det kunne være relateret til iboende forskelle i de N-terminale regioner eller til virkning (er), variation i 5 “region af mRNA kan have på RNA stabilitet eller udtryk.

for at teste denne hypotese, vurderede vi brug af 3 alternative promotere, 2 almindelige alternative splejsning begivenheder og 3 polyadenyleringssteder (PAS) i normale væv i forhold til TMPRSS2: ERG-udtrykkende prostatatumorer. Disse uafhængigt regulerede begivenheder sammen med til at generere 30 væsentligste ‘native isoformer, hvoraf nogle, som vi fandt også stærkt overudtrykt i tumorer. Karakteriseringen af ​​oversættelsen initieringssteder anvendes af de mest almindelige indfødte ERG og fusion varianter afslører, at den specifikke organisering af 5’UTR region er en af ​​de vigtigste determinanter for deres biologiske aktivitet og identificerer et ATG i exon 4 som en formodet mål for antisense-baseret oversættelse hæmning i prostatakræft.

Resultater og diskussion

struktur af ERG Gene

Flere indfødte ERG isoformer kan opstå på grund af en kombination af alternative initiativtagere, splejsning og polyadenylering. Disse isoformer kan igen kombineres med TMPRSS2 og andre 5’partnere til at producere mange ERG-afledte varianter, med variable prognostiske værdier [8], [9], [19]. For bedre at forstå aktiviteterne i ERG-afledte onkogene produkter, vi søgte i første omgang at afklare ERG gen struktur og at beskrive dets udtryk mønster.

Der er betydelige uoverensstemmelser i den offentliggjorte ERG nomenklatur, med mindst fire forskellige klassificering ordninger, med den indlysende konsekvens af at generere forvirring i at forstå og sammenligne data fra forskellige undersøgelser (f.eks: den store terminal exon, der indeholder de Ets og transaktiveringsassays domæner variabelt kaldet exon 11 [2], [22], 12 [3] , 16 [18], [23], 17 [24]).

Vi rapporterer i figur 1A en up-to-date visning af exon-intron struktur af ~300 Kb ERG locus (ENSG000000157554) og foreslå en samlet, rationel nomenklatur af RNA og protein varianter, der sigter på at inddrage de mest etablerede konventioner. Strukturen er hovedsageligt baseret på de 11 exons af Refseq entry NM_004449.4 (UniProt entry P11308 for ERG2), og inkorporerer exon nummerering brugt i den skelsættende Tomlins papir [2], [22] først beskriver TMPRSS2: ERG fusion. Kort sagt, vi fastholdt som “exon 4” den 218nt exon, der er den vigtigste partner for TMPRSS2 og som “exon 11” den store 3897nt exon koder for Ets-domæne; vi navngivet Exon 1a, 1b, 1c de tre eksklusive gensidigt »første« exoner følge de tre validerede initiativtagere P

A, P

B og P

C. For at sikre en rationel medtagelse af yderligere exoner, som kunne afdækkes i fremtiden, vi udmærker sig ved breve de alternative exons ikke en del af de 11 reference- dem. For eksempel 72 nt alternativ exon inkluderet mellem exon 7 og 8 kaldes “exon 7b ‘

(A) Top:. Det ~300 Kb humane ERG locus, trukket nogenlunde at skalere. Anslåede intron størrelser er angivet, sammen med exoner position (søjler). Rød indikerer første exoner, blå fælles alternative dem og grå ualmindeligt dem. I midten: Exon struktur, med exon størrelser nederst. Blå felter angiver de vigtigste forudsagte ORF’er, hvide kasser de uoversatte regioner og grå de ualmindelige exons. Røde cirkler indikerer polyA sites. Nederst: tilpasning af exonerne danner vigtigste ORF (ERG-1b) med proteinets domæner. Tal angiver størrelse i aminosyrer. PNT = spidse domæne, AD = alternativ domæne, Ets = Ets domæne, TAD = transaktiveringsdomæne. Asterisk og cirkel angiver positionen af ​​det første og andet ATG. (B) Menneskelig ERG vigtigste varianter. Tilpasning af exons danner de 30 vigtigste RNA varianter af humant ERG. Blå angiver ORF, lyseblå den ekstra region fra ATG i exon 3. For hver variant, er det foreslåede navn er angivet ved siden af ​​tidligere nomenklatur (hvis det findes). Den foreslåede protein Navnet er rapporteret langs den forudsagte størrelse i AA og kDa. Varianter afledt fra den alternative brug af promotor 1a og 1b er parret, da de fører til relaterede mRNA og identiske proteiner

Vi identificerede derefter de vigtigste alternative reguleringsmæssige begivenheder, der genererer størstedelen af ​​ERG variabilitet:. 3 alternativ initiativtagere (P

A, P

B og P

C); to almindelige alternative splejsningsbegivenheder (inklusion /skipping af exon 4 eller 7b); tre separate polyA signaler (PAS 7bpA, 11LpA og 12Pa). Kombinatorisk brug af de alternative arrangementer genererer 30 mulige “store” ERG udskrift varianter (Figur 1B), som kan kode 15 forskellige forudsagt ERG-beslægtede polypeptider, med 3 forskellige N-terminaler, 3 forskellige C-terminaler og en mulig intern variation (inklusion eller skipping af 24 aa i Alternative domæne kodet af exon 7b).

Ud over de 30 “større” varianter beskrevet i figur 1, har en overflod af “mindre” isoformer blevet rapporteret i litteraturen eller er præsentere i databaser. Listen indeholder varianter viser skipping af exon 2, 5, 7 og 8; brugen af ​​en proximal (Short) polyA sted i exon 11 (11SpA) eller af en yderligere intronisk en nedstrøms for exon 8 (8PA); og inddragelse af supplerende alternative exons 7c, 10b og af flere alternative exons afledt intron 3 (exons 3b-h), der er angivet i grå i figur 1A. Isoformer ERG4, ERG6 og ERG9 fra den tidligere Owczarek undersøgelse [18] er mindre varianter og er blevet omklassificeret i denne gruppe.

Da nogle af disse yderligere mindre begivenheder kunne kombinere selvstændigt med alle de strukturelt kompatible store isoformer, hundredvis af varianter kunne potentielt blive genereret. Men disse begivenheder synes, at forekomme sporadisk, og deres fysiologiske relevans er ukendt

ERG Expression: a. Cancer-associeret switch i Promoter Usage

Vi satte os for at undersøge brugen af ​​initiativtagere, PAS eller splejsningssignaler ved qPCR analyse af ERG-ekspression i forskellige normale væv, tumorer og cellelinier (figur 2). Mens der observeres en vis grad af væv-til-væv variation (fig. S1A), generelt promotor P

C (middel Δc (t) = 10,2), synes at være den mest aktive i normalt væv (herunder prostata), -25 gange og ~ 10 gange mere aktive i gennemsnit end promotorer P

A (Δc (t) = 14,9), og P

B (Δc (t) = 13,4) henholdsvis (figur 2A). På den anden side, i et panel af 8 primære PCA prøver udtrykker TMPRSS2-ERG-fusioner, promoter P

B (middel Δc (t) = 5.4) udgør størstedelen af ​​nativt ERG transkript og er til stede i niveauer svarende til dem af fusionsproteinet selv (Δc (t) = 6), over 100 gange mere forekommende end det samme transkript i normale prostata (Δc (t) = 12,8) (figur 2B og fig. S1A). I flere TMPRSS2: ERG-bærende prøver det native P

B promotor, snarere end fusionsgenet, er den vigtigste kilde til ERG transcript (Fig S1B.). Sammenlignet med normal prostata, promotorer P

A (Δc (t) = 9) og P

C (Δc (t) = 8) aktiveres også, men ikke til graden af ​​P

B. I PCA cellelinier, P

B er den eneste aktive native ERG-promotor, med detekterbare signaler fra P

A eller P

C (figur 2C). To af de testede PCA cellelinjer, VCap og NCI-H660, udtrykke TMPRSS2: ERG fusion (figur 2C, fuld symboler), der er i stedet fraværende i PCA-cellelinjer, der ikke indeholder den TMPRSS2: ERG fusion (LNCaP, DU 145, C4- 2, åbne symboler og fig. S1c). Som forventet blev ingen ekspression fra nogen af ​​de native promotorer observeret i NCI-H660 cellelinien, der bærer fusionen på begge alleler og mistede alle endogene promotorer [25].

kvantitativ bestemmelse ved qPCR af alternative ERG varianter i normalt væv (A, D), primære PCA prøver (B, E) og PCA cellelinier. (C, F). (A-C) Kvantificering af promotoranvendelse. Primersæt specifikke for de 3 forskellige ERG promotorer og for TMPRSS2: ERG fusion, hvor der anvendes, sammen med en primer sæt udspændende exoner 5-7 at kvantificere totale ERG. Normale væv ikke udtrykker fusionsproduktet. Angivelse af varianter 1a og 1c er næsten ikke målbart i PCA cellelinjer analyseres. For panel C, åbne symboler angiver LNCaP, DU145 og c4-2 (ikke udtrykke TMPRSS2: ERG fusion), fuld symboler angiver VCap og NCI-H660 (udtrykker TMPRSS2: ERG fusion). Se også fig. S1 A-C. (D-F) Kvantificering af qPCR af alternativ polyadenylering brug. Primersæt specifikke for de 3 forskellige polyA steder, hvor der anvendes, sammen med en primersæt at kvantificere totale ERG og et sæt til at kvantificere totale exon 11 niveauer for at udlede 11SpA brug. Se også fig. S1 D-F. I alle tilfælde, hver angivet værdi repræsenterer gennemsnit af ≥3 uafhængige eksperimenter og præsenteres som ΔC (t) normaliseret til husholdning genet GAPDH, derfor en “høj” ΔC (t) værdi betyder lave niveauer af ekspression og en “lav” værdi betyder højt ekspressionsniveau. Vandrette søjler angiver middelværdien. Stjerner angiver, at produktet ikke blev påvist i prøven og ville derfor svare til en eksperimentel punkt i toppen af ​​tabellen, men det afspejles ikke af middelværdien.

Fra denne første sæt eksperimenter vi konkludere, at en promotor switch forekommer i PCA tumorer og cellelinier, og at øget brug af native promotor P

B er associeret med (og muligvis bidrager til) tumoren fænotype.

Overekspression af ERG i PCa er tidligere blevet beskrevet [23], men efter opdagelsen af ​​TMPRSS2: ERG fusion, har det været typisk tilskrives denne begivenhed. Men vores fund, at der ud over de fusion-afledte transkripter, nogle native ERG varianter kan også være stærkt overudtrykt i PCa, antyder en større rolle for nativt ERG i PCa udvikling. Dette understøttes af den iagttagelse, at endogene mus

Erg

udskrifter er overudtrykt i tumorer fra prostata betinget

PTEN

– /-;

Trp53

– /- mus, sammenlignet med

PTEN

– /-;

Trp53

+ /+ mus [7]. Vigtigt er det, mens sidstnævnte model resulterer i en indolent form af PCa, den tidligere producerer en aggressiv fænotype [7].

Den differentielle aktivering af de tre native promotorer i fusion-transporterer PCA prøver tyder på, at denne afvigende udtryk transkriptionelt reguleret. En spændende mulighed er, at aktiveringen af ​​den native P

B-promotoren kan drives direkte eller indirekte af ERG selv som en del af en positiv regulatorisk løkke. For eksempel blev adskillige formodede c-myc responsive elementer identificeret umiddelbart opstrøms for ERG P

B-promotoren [18]. Da c-Myc er en central nedstrømsmål af ERG [26], androgen-afhængige aktivering af ERG fra fusionen, eller en separat PTEN-afhængig Myc-aktivering [27] kan udløse en selvbærende ERG /Myc onkogen løkke, som kan i sidste ende blive androgen-uafhængig. Faktisk konsekvent med denne model, en feed-forward mekanisme, hvor ekspressionen af ​​endogent ERG styres af overekspression af fusion produkt er for nylig blevet beskrevet [28]

ERG Expression:. Alternativ polyadenylering og Splejsning

Analogt til, hvad vi gjorde for at studere initiativtagerens forbrug, så udforskede vi rollen som alternativ polyadenylering og splejsning i udtrykket af ERG varianter. Af de tre vigtigste PAS beskrevet (figur 1), er det 11L-pA behov for en fuldt funktionel ERG protein, hvorimod PAS i intron 7b (7b-pA) og exon 12 (12-pA) generere C-terminalt afkortet ERG isoformer mangler Ets DNA-bindende domæne og transaktiveringsdomænet (TAD).

11L-pA PAS blev den mest anvendte i normale væv (betyde, ΔC (t) = 10,8), omkring 8 gange mere end 7b-pA (ΔC (t) = 13,8) og 50 gange mere end 12-pA (ΔC (t) = 16,6) (fig. 2D). Men i TMPRSS2: ERG-udtrykkende PCA prøver (ΔC (t) = 5,2), brug af 7b-PA stærkt aktiveret, og bliver lige så almindeligt som det 11L-pA (ΔC (t) = 5,8) (figur 2E) . Det samme gælder i PCA cellelinjer, der udtrykker fusionsproteinet (figur 2F) antyder, at skifte til denne ekspressionsmønster kunne korrelere med tumorudvikling. Det er vigtigt at bemærke, at mens denne variant mangler de Ets og TAD domæner, bevarer dimeriseringen determinanter, og dermed dens udtryk kunne påvirke aktiviteten af ​​andre fuld længde varianter tilstedeværende. En proksimal PAS inden exon 11 (11S-pA) [15], [18], blev indirekte vurderes ved at sammenligne qPCR regioner på begge sider af det (E11 og 11L-pA), og lignende niveauer af ekspression blev observeret, hvilket antyder, at brugen af 11S-pA er marginal under de fleste normale og patologiske tilstande (figur 2D-F og Figur S1D-F)

Da alternative splejsning varianter kan påvirke ERG eller TMPRSS2:. ERG fusion funktioner [24], vi analyserede regioner omkring exon 7b og exon 4 i normale væv, PCA prøver og cellelinjer ved semi-kvantitativ PCR. Begge alternative splejsning begivenheder var let påviselige med en klar forekomsten af ​​de exon 4 og exon 7b inklusion varianter. Men vi ikke observere nogen væsentlig berigelse i den relative mængde af enten splejsning varianter i PCA prøver, hvilket tyder på, at modulering af disse to specifikke splejsningsbegivenheder ikke kan spille en afgørende rolle i PSA.

Helt, disse data viser, at fuld-længde produkter, der indeholder exon 7b og Ets og TAD domæner, er den mest udbredte ERG varianter uanset status for de opstrøms regioner, både i normale væv og tumorer. Den kraftige stigning i den afkortede TE: 7bpA isoform i forhold til den fulde længde variant kunne simpelthen afspejle ændringer i splejsning /polyadenylation maskiner af kræftceller, men det kan også angive sin (endnu uudforsket) rolle i ERG biologi i tumorer

N-terminal Meget forskellige ERG Isoformer

for at vurdere, om den beskrevne heterogenitet i 5′-området påvirker ERG udtryk og aktivitet, vi sub-klonet den indfødte varianter ERG-1a, ERG-1b, ERG -1c, ERG-1b.Δ4, ERG-1c.Δ4, og den fælles fusion variant T1: E4, med deres komplette 5 ‘UTR’er og med exon 7b inkluderet (figur 3A.). Efter transient transfektion i HeLa-celler, ERG-1c cDNA udtrykt effektivt det forventede 54 kDa produkt (fig. 3B, bane 4). Tværtimod ekspression af de native ERG-1a og ERG-1b varianter var ineffektiv, hvilket resulterer i peptider mindre end ~55 KDa forventes, hvis den første i-ramme ATG i exon 3 blev anvendt (fig. 3B, bane 2-3 ). Interessant dette peptid co-migrerede med at der genereres af den transiente overekspression af T1: E4 fusion variant, ved -50 kDa (bane 5). Yderligere variation i den N-terminale region stammer fra exon 4 skipping, som ændrer ERG vigtigste ORF så de forudsagte startende ATGs i exon 1c eller exon 3 ikke ville være i stand til at generere en ERG-relateret peptid (figur 3A). Forbigående overekspression af ERG-1b.Δ4 eller ERG-1c.Δ4 begge resulterede i ERG-beslægtede peptider migrerede ved ~44 KDa, i overensstemmelse med brugen af ​​en i-ramme M5 ATG i exon 5 (figur 3B, bane 7,9) . Dette er mest tydeligt, når anvendelse af ERG antistof C-17, som let genkender rekombinant ERG, men ikke de endogene proteiner. En anden ERG antistof (C-20) fortrinsvis genkender en endogen bånd svarende i størrelse til ERGΔ4 (bane 1-5), gøre overgangen til M5 forbrug sværere at opdage.

(A) N-terminal heterogenitet i menneskelige indfødte ERG varianter. De 5 regioner for de angivne varianter er gengivet. Kasser repræsenterer exoner med ORF’en i blåt. Rød flåter under exons angiver i-frame ATGs i exon 1c og exons 3 til 5. out-of-frame produkter forårsaget af exon skipping, fra det ellers i frame ATGs er angivet med rødt. (B) Western blot (WB) i transient ekspression af varianterne i HeLa-celler. Antistof C20 genkender eksogene protein og en endogen band på ~44 kDa svarende i størrelse til Δ4 varianter. Antistof C17 fortrinsvis genkender eksogene ERG bands. (C) Mutationer, der uafhængigt eliminere de 3 i-ramme ATGs i exon 4, blev indført i cDNA’et af T1: E4 og analyseret som ovenfor. (D), Tilsvarende mutationer blev indført for at fjerne de ATGs i exon 3 (ERG-1b) eller i exon 1c (ERG-1c) alene eller i kombination med mutationer i den første i-ramme ATG (M4A) i exon 4 (ERG-1b og ERG-1c)

Da T1:. E4 mangler de forudsagte initieringskodoner fra både TMPRSS2 og ERG udskrifter, en alternativ intern ATG indefra ERG åbne læseramme skal anvendes til at udtrykke en ERG-relateret produkt fra fusionen mRNA, sandsynligvis fra exon 4. for at identificere T1: E4 initieringskodon, en serie af methionin-til-alanin-punktmutationer blev frembragt for de tre i-ramme ATG-kodoner stede i ERG exon 4 ( fig. 3A). Mutation ved nukleotiderne 79 (M4A), men ikke 121 (M4B) og 184 (M4C) i exon 4 afskaffet T1: E4-ekspression (figur 3C), hvilket indikerer, at fusion transkript bruger den første i-ramme ATG til ekspression af ERG-peptidet .

for at kortlægge de startende ATGs fra den indfødte ERG isoformer lignende mutationer, hvor også introduceret alene eller i kombination i de første in-frame ATGs i exon 3, 1c og 4 (figur 3D). Mutation af ATG i exon 3 (M3) ikke havde nogen effekt på ekspressionen af ​​-50 kDa produkt (figur 3d, stræder 2 vs. 4), mens mutation af den næste ATG i exon 4 (M4A) ophævet det både i wt og M3 sammenhæng (figur 3D, bane 3 og 5), hvilket indikerer, at ERG-1b (og ERG-1a) ikke anvender deres første i-ramme ATG, som ville blive forudsagt af en 5’cap-afhængig scanning model af translationsinitiering [29]. Stedet, brug af følgende ATG i exon 4 frembringer et peptid identisk med det, der kodes af T1: E4 fusion. Tværtimod når startkodonen i exon 1c er muteret (M1c), er ERG-1c mobilitet reduceret fra ~54 kDa til -50 kDa (figur 3D, bane 6 vs. 8), ligesom T1: E4 og ERG-1b (bane 1 og 2), i overensstemmelse med et skift til den M4A ATG. Faktisk mutation af denne ATG resultater i ophævelsen af ​​~ 50 kDa produkt til fordel for en endnu mindre produkt.

Biologisk karakterisering af ERG Isoformer

For at vurdere, om det strukturelle N-terminal forskelle mellem cancerassocieret ERG-1b /T1: E4 og den normale ERG-1c påvirke uløseligt deres biologiske aktivitet, vi oprindeligt stabilt udtrykt deres tilsvarende cDNA’er i NIH-3T3-celler (figur 4A) og udvalgte kloner med robust ekspression. Efter aftale med tidligere rapporter, observerede vi fremme celle invasion og migration af både ERG varianter, som analyseres ved trans-brønd migration gennem matrigel (figur 4B) og ridser sår assay (figur 4C-D). Omfanget af påvirkningen af ​​migration /invasion var sammenlignelig i ERG-1b og ERG-1c viser, at de er ligeledes aktive, i det mindste i nogle grundlæggende aspekter af deres biologi. Salg

(A) NIH-3T3-celler stabilt udtrykker højt niveau af ERG-1b og ERG-1c blev analyseret som i figur 3. (B-C) Efter valg af narkotika, ERG-overekspression kloner (1b og 1c), tomme vektor kontrol (pLPC) og ubehandlet NIH-3T3 celler (NT) blev analyseret for deres invasion potentiale ved anvendelse af en matrigel invasion assay (B), og i en standard sår ridse assay for at måle deres motilitet (C). (D) Kvantificering af (C), ved hjælp ImageJ software. Barer angiver standardafvigelsen. (E) Vækstkurve af NIH-3T3 stabile kloner. Efter selektion blev cellerne fikseret ved 48 timers intervaller over en periode på 8 dage og farvet med krystalviolet. (F) Efter selektion lægemiddel, blev NIH-3T3 stabile kloner udpladet og serumudsultet, og celledød blev målt ved trypan blå metode. (G) 5 dage efter lægemiddel-selektion NIH-3T3 stabile kloner blev farvet for SA-β-galactosidase. (H) Vækstkurve af IMR90 celler, der stabilt udtrykker højt niveau af ERG1b /T1: E4 eller tom vektor. Efter lægemiddel-selektion, blev celler fikseret ved 48 timers intervaller over en periode på 8 dage og farvet med krystalviolet. (I) 5 dage efter lægemiddel-selektion IMR90 stabile kloner blev farvet for SA-β-galactosidase. Røde pile angiver bi-celler med kerne. Repræsentative billeder vises i B, C, G og I.

Overraskende ekspression af ERG varianter i denne forbindelse resulterede i nedsat cellulær proliferation (figur 4E). Dette var ikke associeret med celledød. Tværtimod ekspression af ERG-1b og især ERG-1c resulterede i beskyttelse mod celledød efter serum sult (Figur 4F). Denne adfærd kan afspejle aktivering af et onkogen-afhængig senescens-lignende tilstand af ERG-ekspression som tidligere beskrevet for andre onkogener [30]. Faktisk ERG-udtrykkende celler, men ikke kontrol, farvet positive for ældning biomarkør (beta)-galactosidase (figur 4G). Fascineret af disse resultater vi efterfølgende stabilt overudtrykt ERG-1b /T1: E4 isoform og den tilsvarende tom vektor i normal human fibroblastcellelinie IMR90, en velkarakteriseret celle modelsystem til cellulær ældning. Som med NIH-3T3-celler, overekspression af ERG-1b /T1: E4 isoform resulterede i øget cellemigrering og celleinvasion, (figur S2). Desuden IMR90 celler overudtrykker ERG-1b /T1: E4 isoform viste senescens-lignende fænotyper, såsom en inhibering af cellulær proliferation (figur 4H), akkumulering af bi-celler med kerne og forhøjede SA-β-gal-aktivitet, en klassisk biomarkør for aldring (figur 4I).

Dette resultat er særligt spændende i lyset af, at ældning programmet aktiveres, når en celle har fornemmet et kritisk niveau af skader eller dysfunktion, der peger på en afgørende rolle for ERG -1b /T1: E4 overekspression som en indledende begivenhed, der medfører PSA. Desuden er det vigtigt at bemærke, at der kan påvises cellulær senescens i den tidlige fase humane PCA prøver og kan udløses af akut tab af PTEN i en p53-afhængig måde i mus PCA modeller [31], hvilket antyder, at ERG-aktivering kan resultere i en indledende aldrende fænotype, der kræver efterfølgende miljømæssige eller genetiske ændringer at gå videre til malignitet.

ATG kontekst og uORFs Affect ERG Translation Effektivitet og funktioner

Effektiv oversat eukaryote mRNA kræver en optimal kontekst omkring startcodonet, at støtte i sin erkendelse af ribosomet (Kozak-sekvensen: GCCRCCATGG) [32]. Dette er imidlertid ikke altid tilstrækkelig til at forklare translationseffektiviteten. For eksempel, selv om ERG-1a /b og T1: E4 har samme ATG i exon 4 (M4A) at initiere translation, deres ekspressionsniveauer er forskellige (figur 3B bane 2,3 og 5), hvilket antyder en rolle for deres forskellige 5′ UTR’er. Faktisk substitution af de naturlige 5 ‘UTR’er med en, der indeholder en konsensus Kozak (figur 5A-B) førte til aktivering af udtryk fra M3 ATG i ERG-1b variant med syntese af det oprindeligt forudsagt 55 kDa peptid (figur 5C, banerne 1-2). Dette bekræfter, at elementer i 5’-UTR af ERG-1b inhiberer dens oversættelse og det udelukker, at den lave ERG-1b (M3) overflod skyldes en iboende ustabilitet af dets N-terminale domæne.

( a) den native 5′-UTR af ERG-1b, ERG-1c og T1: E4 blev erstattet med en fælles en fra ekspressionsvektoren (orange), og en optimeret Kozak-sekvens. De udskiftede ATGs er i exon 3 (M3), 1c (M1c) og 4 (M4A) (B) Baggrunden for flere i-frame ATG som startkodoner i forskellige ERG og TMPRSS2: ERG varianter. Sekvensen omkring ATG er justeret til en konsensus Kozak-sekvens, med de vigtige konserverede positioner ved -3 (R) og 4 (G) fremhævet med rødt (tælling af A som +1). Kontekst vurderes som »stærk« (S), hvis begge positioner er bevaret, og “svag” (W), hvis de ikke er. En udvidet analyse af ATGs i 5’UTR region ERG og TMPRSS2: ERG er rapporteret i tabel S1. (C) WB analyse af varianter og mutanter repræsenteret i (A). Forbedring af M3 sammenhæng favoriserer dens anvendelse på bekostning af den M4A ATG. (D) uORFs, der kan påvirke translation effektiviteten af ​​ERG varianter i 5 ‘UTR’er af ERG-1b og flere fælles TMPRSS2: ERG varianter. Røde flåter indikerer ATGs, boksene nedenfor angiver den formodede uORF genereret og deres omtrentlige varighed (tegning ikke at skalere). Røde felter angiver stærke ATG sammenhænge og grønne svage (som defineret i (B)). Flere detaljer om de uORFs er anført i tabel S1. (E) Effekt af selvstændigt mutere uORFs ‘ATG i ERG-1b: mutation af det første ATG i exon 2 udgivelser undertrykkelse af oversættelse og øger niveauet af ERG fra ATG i exon 4. (F) Ekspression af ERG og TMPRSS2: ERG varianter . CDNA’er i fuld længde for varianterne, herunder hele deres 5’UTR’er, blev udtrykt og lysater fra forbigående transficerede HeLa-celler blev analyseret ved western blot.

Upstream åbne læserammer (uORFs) er typisk korte ORF’er at starte inden 5 ‘UTR, er ude af ramme med de vigtigste nedstrøms kodende sekvens og kan reducere sit udtryk [33], [34]. Mens ingen uORFs er til stede i ERG-1c eller i T1: E4 findes tre uORFs i ERG-1b 5’UTR (figur 5D, øverst), som kunne interferere med genkendelse af den forudsagte ATG i ERG-1b (tabel S1) . Ophævelse af uORF begyndende ved uM2a ved mutation af ATG til GCG ført til øget ERG-1b ekspression (figur 5E, bane 2), hvilket indikerer, at indgrebet af scanning ribosomet ved først mødte ATG, at generere et kort 29 aa uM2a peptid, er en begrænsende faktor i ERG-1b ekspression fra nedstrøms ATG

tilstedeværelsen af ​​uORFs kunne også tilsvarende påvirke niveauerne af ekspression af de forskellige androgen-driven TMPRSS2:. ERG fusionsproteiner, med prognostisk implikation, da 5’heterogenitet i fusion er forbundet med forskellige kliniske resultater [19], [20]. De forskellige patologiske profiler kan skyldes ændringer i biologisk aktivitet, afhængigt af den primære proteinsekvens eller forskelle i sin overflod,

via

modulering af translation. Sådanne variationer kan forklare, hvordan f.eks T2: er E4 fusion forbundet med en mere aggressiv fænotype [19], [20]

For at undersøge om oversættelse effektivitet spiller en rolle i aktiviteten af ​​fusion varianter.