PLoS ONE: Met receptortyrosinkinase Signaling inducerer Sekretion af den angiogene kemokin interleukin-8 /CXCL8 i kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

Ved diagnose, de fleste af bugspytkirtlen kræftpatienter til stede med fremskreden sygdom, når helbredende resektion er ikke længere mulige og nuværende terapeutiske behandlinger er stort set ineffektive. En forbedret forståelse af molekylære mål for effektiv indgriben af ​​kræft i bugspytkirtlen er således presserende. Met receptortyrosinkinase er én kandidat impliceret i bugspytkirtelkræft. Især er Met overudtrykt i op til 80% af invasive pancreascancer, men ikke i normale duktale celler korrelerer med dårlig samlet patient overlevelse og øget tilbagefald satser efter kirurgisk resektion. Men den funktionelle rolle af Met signalering i bugspytkirtelkræft stadig dårligt forstået. Her brugte vi RNA-interferens til direkte at undersøge patobiologiske betydning øget Met-signalering for kræft i bugspytkirtlen. Vi viser, at Met knockdown i pancreas tumor celler resulterer i nedsat celle overlevelse, celle invasion, og migration på kollagen I

in vitro

. Brug af en ortotopisk model for kræft i bugspytkirtlen, vi leverer

in vivo

beviser for, at Met knockdown reduceret tumor byrde korrelerer med nedsat celle overlevelse og tumor angiogenese, med minimal effekt på cellevækst. Især rapporterer vi, at Met-signalering regulerer sekretionen af ​​pro-angiogene kemokin interleukin-8 /CXCL8. Vores data viser, at interleukin-8-receptorer CXCR1- og CXCR2 ikke udtrykkes på bugspytkirtlen tumorceller, tyder på en parakrin mekanisme, hvormed Met signalering regulerer interleukin-8 sekretion at omforme tumor mikromiljø, en roman fund, der kunne have vigtige kliniske implikationer for forbedring effektiviteten af ​​behandlinger for kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Hill KS, Gaziova i, Harrigal L, Guerra YA, Qiu S, Sastry SK, et al. (2012) Met receptortyrosinkinase Meldefunktioner inducerer Sekretion af den angiogene kemokin interleukin-8 /CXCL8 i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 7 (7): e40420. doi: 10,1371 /journal.pone.0040420

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Februar 15, 2012; Accepteret: 6 juni 2012; Udgivet: 17 Juli 2012

Copyright: © 2012 Hill et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health CA-119.075 til LAE, DK-052.067 til CDL, og CA-118.405 til SKS K.S.H. blev støttet af træning tilskud NIH /NCI Tværfaglig uddannelse i Cancer Research, T32 (CA117834-03). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er en aggressiv kræft med en median patient overlevelse på mindre end et år, hvilket gør det den fjerde hyppigste årsag til kræftdødsfald i USA [1]. Den høje dødelighed af PDAC patienter skyldes flere faktorer. I mangel af effektive screeningsmetoder, 80-85% af patienterne til stede med fremskreden sygdom, der ofte udelukker helbredende resektion [2]. Desuden standard behandlinger for fremskreden sygdom er stort set ineffektive [3], [4]. Der er således et presserende behov for at forstå den molekylære basis for PDAC vækst til at identificere mål for høj terapeutisk værdi. Seneste genetisk analyse af pancreas tumorer identificeret flere genetiske mutationer fælles for 75-90% af patientens sager er vigtige for PDAC initiering og efterfølgende udvikling af preinvasive pancreas intraepithelial neoplasmer (PanINs 1-3) [5] – [7]. Efter aftale med dette, har gensplejsede musemodeller for PDAC bekræftet rolle specifikke genetiske mutationer i initiering og udvikling af tidlig sygdom. Eksempler er Panin-1 (Kras aktivering, tab af Notch2) [8], [9], Panin-2 (tab af funktion mutationer i tumor suppressor p53 og p16INK4a) [10] og Panin-3 (inaktivering af p53, Smad4 /DPC4 og BRCA2) [8], [11], [12]. I modsætning til disse tidlige stadie preinvasive læsioner, PDAC har en mangel på definerede mekanismer.

Flere signalveje er sandsynligvis involveret i PDAC. En kandidat er Met /hepatocytvækstfaktor (HGF) signalering akse. Under fysiologiske betingelser, er Met receptortyrosinkinase og dets ligand HGF udtrykt i lave niveauer i pancreas acinare celler og stromale rum henholdsvis [13] – [15]. Parakrin binding af HGF til Met resultater i receptorfosforylering fører til øget celle overlevelse og motilitet [16], [17]. I modsætning til lunge og gastriske adenokarcinomer, hvor aktiverende mutationer forlænge Met signalering, sådanne gain-of-function Met mutationer endnu ikke er identificeret i PDAC. Normale pancreas kanaler udtrykker lave Met-niveauer. Omvendt Met er overudtrykt i op til 80% af PDAC sager [18], er en stærk indikator for øget tilbagefald satser og generelt dårlige PDAC patient overlevelse [13], [19] – [22]. Met ekspression er til stede i op til 29 tumorgene pancreatiske cellelinjer med forskellige genetiske baggrunde, herunder ASPC-1, Panc-1, BxPC-3 og Suit-2-celler [13], [23]. En undtagelse er dårligt differentierede MIA PaCa-2-cellelinje, der ikke udtrykker endogene Met [13], [23]. For nylig blev Met lille molekyle inhibitor SGX523 rapporteret at reducere væksten og infiltration af subkutane pancreas tumorer [24] hæve interesse i Met som et potentielt terapeutisk mål for fremskreden sygdom. Men den nøjagtige rolle Met signalering for PDAC stadig uløst.

I denne undersøgelse anvendte vi RNA-interferens til at reducere Met signalering i humane pancreas xenografter ved hjælp af en

in vivo

mus ortotopisk model. Mødte knockdown (MetKD) celler forblev kompetent til at danne ortotopisk pancreas tumorer

in vivo

; imidlertid de resulterende MetKD xenotransplantater var signifikant vækst hæmmet i forhold til tumorer som følge af kontrol celler, der udtrykker et ikke målretning (NT) shRNA. Immunohistokemisk analyse af MetKD xenotransplantater viste øget celle apoptose ledsaget af reduceret celleproliferation og betyde kardensitet (MVD i periferien af ​​MetKD xenotransplantater. I overensstemmelse med dette scenario, viser vi, at Met knockdown reducerer sekretionen af ​​interleukin-8 /CXCL8 (IL-8) , en potent pro-angiogen kemokin, der fungerer som en parakrin regulator af endotelcelleproliferation, en aktivator af neutrofiler og en kemoattraktant for fibroblaster og andre immunceller [25]. Vores fund, at Met er en opstrøms regulator af IL-8 sekretion er signifikant og foreslår en mekanisme, hvormed Met signalering kunne regulere bugspytkirtelkræft

in vivo

, en roman fund, der kan give unikke muligheder for klinisk intervention.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyr blev passet i overensstemmelse med Kontoret for beskyttelse fra Research Risici (OPRR) og dyreværnsloven retningslinjer under et dyr protokol godkendt af University of Texas MD Anderson Institutional Animal Care og brug Udvalg. Denne undersøgelse blev godkendt af University of Texas MD Anderson Institutional Animal Care og brug Udvalg.

Antistoffer, cellelinjer og vedligeholdelse

Et antistof mod C-terminalen af ​​Met (C-28 ) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology. Et monoklonalt muse-antistof mod β-actin blev købt fra Sigma. Site-specifikke anti-phospho tyrosin antistoffer for Met Y1234 /1235 var fra Upstate. Et antistof specifikt for det ekstracellulære domæne af Met (anti-hHGFR) blev indkøbt fra R 1D).

BxPC-3 (A) eller ASPC- 1 (B) celler inficeret med rekombinant lentivirus udtrykker Met knockdown shRNAs (2 eller 5) eller en ikke målretning (NT) shRNA blev behandlet uden (-) eller med (+) HGF og undersøgt ved Western-analyse for pMet (Y1234 /1235) , Met, pErk1 /2, Erk1 /2, Pakt, AKT og p-actin niveauer (n = 3). Flowcytometri detekteret reduceret Met overfladeekspression i BxPC-3 (C) og ASPC-1 (D) MetKD celler i forhold til NT-celler. Værdier er udtrykt som den gennemsnitlige tilstand +/- SEM (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). Reduceret forankringsuafhængig vækst af BxPC-3 (E) og ASPC-1 (F) MetKD celler i blød agar i forhold til NT-celler (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). Met knockdown havde minimal effekt på væksten af ​​BxPC-3 (G) og ASPC-1 (H) MetKD celler i forhold til NT celler.

For at vurdere, om Met signalering påvirker tumorigent potentiale BxPC- 3 og ASPC-1 celler, udførte vi forankringsuafhængig vækst-assays i blød agar. NT og MetKD celler blev podet i 0,4% agarose i nærvær eller fravær af HGF og antallet af resulterende kolonier, som defineres som en klynge af tre eller flere celler blev scoret. I NT cellelinjer, HGF behandling resulterede i en signifikant stigning i antallet af kolonier er til stede i blød agar i overensstemmelse med en rolle for Met signalering i forankringsuafhængig cellevækst. Omvendt viste HGF-behandlede MetKD celler nedsat kapacitet til at vokse til en ankerplads uafhængig måde i blød agar (figur 1E 1F). Dernæst undersøgte virkningen af ​​Met knockdown på HGF-induceret celleproliferation. Interessant nok blev HGF-induceret proliferation ikke påvirket af Met knockdown i BxPC-3 og ASPC-1-celler (figur 1G 1H).

Virkningen af ​​Met knockdown på HGF-induceret cellemigration blev undersøgt under anvendelse af en sårheling assay. Som vist i fig 2A B (Støtte Information S1), MetKD celler konsekvent viste reduceret HGF-induceret motilitet i forhold til NT celler. Ved hjælp af en matrigel-baseret invasion assay, viser vi også, at tab af Met signalering signifikant reducerede invasiv fænotype af BxPC-3 MetKD celler (figur 2C). PDAC er kendetegnet ved en rigelig desmoplastiske stroma, der er stærkt beriget med ekstracellulære matrix-komponenter, herunder kollagen I. Som følge heraf udførte vi levende celler undersøgelser for at måle forskelle i HGF-induceret migrering af ASPC-1 NT og MetKD cellelinier podet på collagen I (figur 2D). Celler lodes adhærere i 1 time på kollagen I før behandling med HGF, hvorefter levende cellemigration blev undersøgt ved at måle den totale vejlængde for migrerende celler over en 2 timers periode. I fravær af HGF, blev påvist sammenlignelige migrerende vejlængder for ASPC-1 MetKD og NT-celler (NT: 87,2 um +/- 12,0; MetKD-2: 112,1 um +/- 12,3; MetKD-5: 76.5 um +/- 7,0) (figur 2D). Behandling med HGF forøgede banelængde APSC-1 NT-celler (216,7 um +/- 13,1), korrelerer med øget celle hastighed (data ikke vist). Omvendt har HGF behandling af MetKD-2 og MetKD-5 celler ikke føre til øget vejlængde (Film S1, Film S2, Film S3). Derfor Met Knockdown resulterer i nedsat ASPC-1 cellevandring på kollagen I.

Serum-udtømte, sammenflydende NT eller MetKD BxPC-3 (A) eller ASPC-1 (B) celler blev såret med en ridse, seks regioner markeret, og straks afbildes (0 timer) før behandling med HGF. Identiske regioner langs bunden blev afbildet efter 3, 9, 18, og 24 timer og værdierne blev normaliseret til det indledende størrelse af bunden ved 0 timer. Cellemigration rapporteres som% udbedring ved hvert tidspunkt (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). MetKD reducerer BxPC-3 celleinvasion som respons på HGF forhold til kontrol celler (C). Værdier repræsenterer gange ændring i antallet af celler /felt og er angivet som middelværdien +/- SEM (*** p 0,001; ANOVA, n = 3). Levende celler af ASPC-1 MetKD celler udpladet på collagen I-belagte glas nederste celle dyrkningsskåle viser nedsat cellemigrering som respons på 100 ng /ml HGF (D). Billeder blev indsamlet hver 2 min for i alt 120 min og data er udtrykt som den gennemsnitlige vejlængde +/- SEM pr tilstand (*** p 0,001; ANOVA, n 30 celler).

Met Knockdown forringer

in vivo

tumor Growth

Vi søgte at undersøge konsekvensen af ​​Met forstyrrelser på tumorvækst

in vivo

, ved hjælp af en ortotopisk musemodel for kræft i bugspytkirtlen . Da cross species forskelle i interaktionen af ​​murine HGF med human Met er blevet rapporteret [31], vi først brugt Western analyse for at bekræfte aktiveringen af ​​human Met ved murine HGF i BxPC-3 og ASPC-1 celler. Anvendelse af betingelser, der resulterer i maksimal Met phosphorylering med human HGF, viser vi, at human Met blev aktiveret ved de murine og humane ligand under anvendelse af site specifikke anti-Met phospho-tyrosin antistoffer og Western-analyse (figur 3A 3B). Under disse betingelser human HGF var 3-5 gange mere effektivt end murint HGF til induktion Met phosphorylering, i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at murin HGF er funktionelt aktivt mod humane receptor

omend

med en lavere affinitet [32], [ ,,,0],33].

Western-analyse bekræftede, at murine (mHGF) og humant HGF (hHGF) aktivere human Met i BxPC-3 (A) og ASPC-1 (B) NT cellelinier. Nr Met aktivering blev observeret i fravær af ligand. Værdier er udtrykt som middelværdi relativ densitet på pMet /Met +/- SEM (** p 0,01 *** p 0,001; ANOVA, to separate forsøg). Tumorstørrelse blev målt hver 10 dage med

in vivo

bioluminescerende billeddannelse til BxPC-3 (C) eller ASPC-1 (D) celler efter injektion og rapporteres som gennemsnitlig tumorstørrelse i fotoner /s /cm

2 (* p 0,05, ** p 0,01; ANOVA). Repræsentative bioluminiscerende billeder vises umiddelbart før obduktion på 30 dage (BxPC-3) eller 45 dage (aspC-1). Vægten og samlede forekomst (%) af BxPC-3 primære tumorer (E) og ASPC-1 (F) primære og metastatiske tumorer er angivet. Stabil knockdown af Met-mRNA i BxPC-3 (G) og ASPC-1 (H) MetKD xenotransplantater blev bekræftet under anvendelse QRT-PCR. Data, blev normaliseret til GADPH og rapporteres i forhold til den respektive NT kontrol (** p0.01, *** p 0,001; ANOVA, n = 2).

For at undersøge effekten af Met knockdown på PDAC vækst, anvendte vi BxPC-3 og ASPC-1 celler præ-mærkede med ildflueluciferase at følge tumorbyrde ikke-invasivt [26]. Lige antal MetKD og NT kontrol celler sprøjtes ind i kroppen i bugspytkirtlen af ​​athymiske nøgne mus og tumor byrde kvantificeres ved hjælp af

in vivo

bioluminescens [26]. Stærk tumorvækst blev påvist i mus injiceret med kontrol celler, der udtrykker NT shRNA (figur 3C 3D). Omvendt blev tumor incidens og byrde væsentligt reduceret i mus injiceret med MetKD BxPC-3 eller ASPC-1 celler. Ved obduktion (40 og 45 dage for BxPC-3 og ASPC-1 injicerede mus henholdsvis) blev små tumorer masserne let påvises i pancreas injiceret med BxPC-3 MetKD-2-celler, men ikke med BxPC-3 MetKD-5-celler (figur 3C og 3E). Dette var ikke på grund af problemer med tumor såning, som små tumor felter blev let påvises mikroskopisk i H E farvede sektioner af MetKD tumorer i overensstemmelse med de bioluminescens data (Støtte Information S2). I mus injiceret med aspC-1-celler, viser MetKD celler reducerede primær tumor størrelse i ortotopisk model sammenlignet med mus injiceret med NT-celler (figur 3D), korrelerer med nedsat forekomst af lokale (lever) og fjern (lunge) tumor metastase (figur 3F). QRT-PCR bekræftede reduceret Met mRNA-niveauer i MetKD tumorer i forhold til NT tumorer (Figur 3G 3H). Således tab af Met signalering i BxPC-3 og ASPC-1 celler svækker tumor byrde

in vivo

.

Met Signaling remodels den tumorvaskulatur

ortotopisk ASPC-1 tumorer blev fjernet og behandlet til yderligere analyse. Immunfældning og Western-analyse af human Met i ortotopisk tumorer bekræftede aktiveringen af ​​menneskelige Opfyldt ved murine HGF

in vivo

(figur 4A), i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser, der viser aktivering af menneskelig Opfyldt ved rekombinant muse-HGF (Se figur 3A 3B). Som forventet lavere niveauer af phospho-Met blev påvist i Met KD tumorer i forhold til NT-xenografter (figur 4A). Interessant, tumorer produceret af ASPC-1 MetKD celler rutinemæssigt indeholdt omfattende områder af central nekrose (figur 4B) sammenlignet med de større tumorer skyldes ASPC-1 NT celler. Kvantificering detekteret en 5 gange stigning i nekrotiske områder inden for de mindre tumorer afledt af MetKD-2 og MetKD-5-celler sammenlignet med NT kontroltumorer (figur 4B). Den øgede tumornekrose observeret i MetKD ASPC-1-xenografter kan skyldes hurtig tumorvækst, der overstiger tumorvaskulaturen, øget tumorcelle apoptose eller nedsat tumorangiogenese. For at skelne mellem disse muligheder, vi farves ASPC-1 MetKD og NT tumor afsnit for Ki67 eller kløvet caspase-3 for at vurdere niveauet af celleproliferation og apoptose hhv. Morfometrisk analyse af Ki67-farvning i tumorer sektioner som følge af MetKD celler afslørede færre Ki67-positive celler pr område sammenlignet med NT tumorer (figur 4C). Undersøgelse tumor sektioner for spaltet caspase-3-farvning afslørede højere antal spaltede caspase-3-positive celler i MetKD tumorer i forhold til NT tumorer (figur 4D), hvilket indikerer, at tab af Met-signalering kunne resultere i øget modtagelighed for apoptose. Den øgede apoptose og nekrose observeret i MetKD tumorer kunne tilskrives nedsat tumor angiogenese. For at teste dette, vi bestemt den gennemsnitlige fartøj densitet (MVD) i NT og MetKD-tumorer ved immunhistokemisk farvning hjælp antistoffer mod CD31, en markør for endotelceller [28]. I overensstemmelse med vores data, som viser øget nekrose i MetKD-2 og MetKD-5 tumorer, MVD blev reduceret betydeligt i periferien af ​​MetKD tumorer i forhold til NT-afledte pancreas xenografter (Figur 4E). Intet signal blev påvist i den centrale masse xenograft væv, i overensstemmelse med rapporter om menneske- og musemodeller for bugspytkirtelkræft [34]. Således tab af Met signalering i ASPC-1 celler reducerer tumor byrde i en mus ortotopisk model, sandsynligvis som følge af nedsat celle overlevelse og tumor angiogenese.

Immunfældning og Western-analyse opdaget stærk fosforyleret Met (pMet) i NT tumorer i forhold til lave pMet niveauer i MetKD tumorer (A). Serielle sektioner af paraffinindlejrede tumorer var enten H 0,01, *** p 0,001 ; ANOVA). Repræsentative felt billeder vises.

Met Signaling fremmer sekretionen af ​​angiogene faktorer

Met-signalering har vist sig at fremme omdannelse af tumorvaskulaturen i bryst- og uterus tumorer gennem opregulering af VEGF og nedregulering af thrombospondin-1 (TSP-1) [35]. VEGF er en potent agonist af angiogenese, der aktiverer både endotelcelleproliferation og migration. I opposition, TSP-1 undertrykker angiogenese ved inhibering endotelcelleproliferation og inducere endotelcelle apoptose.